SGR4和GFRa-1基因在小鼠睾丸移植物中的表达

目的检测小鼠睾丸异体异位移植物中SGR4和GFRa-1基因,对采用该动物模型进行睾丸组织移植在生殖医学中应用的可行性进行评估。方法以新生1～2 d小鼠睾丸组织为供体,雄性去势免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植;在移植后不同时间段(分为3 d、1～10周共11个组)取出移植物,采用RT-PCR法对移植物中生精阶段特异性基因SGR4和GFRa-1进行检测;分析2种基因在精子发生不同阶段出现的时间及表达情况,并与相应各时期正常小鼠睾丸中的基因表达相比较;同时进行组织形态学观察,对比各种基因出现的时间与小鼠睾丸发育周期的吻合程度。结果在11个时间段取出的移植物中,GFRa-1在出生3 d就开始表达,表达持续恒定;SRG4在出生2周内的小鼠睾丸中呈低表达,直至出生3周,SRG4基因在小鼠睾丸中开始大量表达,以后表达持续恒定在高水平。2种基因表达趋势与正常昆明小鼠睾丸中的表达基本相同,并与小鼠发育周期基本吻合。结论将新生小鼠睾丸组织移植到免疫缺陷小鼠体内后,生精细胞的发育在组织形态和SGR4、GFRa-1基因出现的时间上与正常小鼠相似。     

异体异位发育睾丸组织的蛋白质组图谱构建及差异蛋白分析*

[摘要] 目的 应用蛋白质组学实验方法对在异体异位生长发育的新生小鼠睾丸组织进行差异蛋白分析,从而对睾丸组织体外移植模型用于生精细胞发育研究的可行性提供进一步的理论依据。方法 以新生小鼠睾丸组织为供体,免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植,移植8周后收集移植物组织,采用双向凝胶电泳（2-DE）分离移植物组织总蛋白,同时分离8周正常小鼠睾丸组织总蛋白作对比分析,运用ImageMaster 2D Elite 5.0图象分析软件识别移植物组织与正常组织差异表达的蛋白质点,应用基质辅助电离解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）获取肽质量指纹图谱（PMF）,检索数据库鉴定差异表达的蛋白质点。结果 正常睾丸组织和移植物组织双向电泳图谱的平均蛋白质点数分别为(1 326±15)个和(1 561±20)个,3次重复实验的蛋白质点位置重复性较好。通过比较两者的双向凝胶电泳图谱,得到表达差异量较大的蛋白质点21个。选取6个仅在正常睾丸组织中有表达的蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定出的6种蛋白质,除血红蛋白α1链（Hba-a1）外,其他5种蛋白均为在小鼠睾丸中有较高表达的蛋白质,包括A激酶锚定蛋白结合的精子蛋白(ASP)、磷脂过氧化氢物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)、精子蛋白(Sp17)、天门冬酰胺酶样蛋白(ASRGL1)和过氧化物氧化还原因子4(Prdx4)。结论 在本实验中,从异体异位生长发育成熟的新生小鼠睾丸组织中检测到5种在睾丸中特异性高表达蛋白质的缺失,这些蛋白质主要在精子运动、精子顶体形成以及精子的受精等功能中发挥作用。     

成人睾丸组织在裸鼠体内的存活情况研究

目的以成人睾丸组织为供体,免疫缺陷小鼠为受体,研究成人睾丸组织中生精细胞异种移植后的存活及变化情况。方法将成人正常睾丸组织植入去势裸鼠背部,于移植后110d取出移植物,进行组织形态学观察。结果在一例移植前显示非正常生精上皮结构标本的移植物中,大多数生精小管中只含有Sertoli细胞,而另一例移植前显示出正常生精上皮结构的标本,在移植到裸鼠背部110d后,仍然观察到圆形和长形精子细胞存在。结论将成人睾丸组织移植到免疫缺陷小鼠体内,110d后仍观察到有生精细胞的存活。     

DNAJB8在小鼠睾丸生殖细胞中的表达定位

目的：探究DNAJB8［DnaJ heat shock protein family（HSP40） member B8］在小鼠精子发生过程中的表达模式。方法：分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测小鼠各脏器、不同发育时期睾丸组织以及不同生精细胞DNAJB8的mRNA转录和蛋白表达量;免疫荧光检测DNAJB8在生精细胞中的表达定位。结果：DNAJB8基因在睾丸组织中特异表达,从小鼠出生后21 d（P21）即圆形精子阶段开始DNAJB8 mRNA保持较高的表达,而DNAJB8蛋白在精子变形晚期出生后35 d（P35）才开始表达。DNAJB8蛋白主要定位在晚期精子细胞及精子鞭毛中段。结论：DNAJB8可能参与小鼠精子变形晚期的发育过程。     

大鼠睾丸移植模型的建立及植睾损伤机制的研究

目的：探讨影响植睾生精细胞发育的内在因素及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）mRNA在植睾丸组织中的表达。方法：应用Cuff管技术建立大鼠原位异体睾丸移植模型，并将实验动物分为6组，在光镜和电镜下分别观察移植物的形态学和超微结构变化，应用放免法和RT—PCR技术检测实验各组T、FSH、LH水平和GDNFmRNA的表达量。结果：术后7d，同种移植组植睾组织在光镜下可见间质内大量淋巴细胞浸润，曲细精管内生精细胞层次紊乱，支持细胞数目减少并出现萎缩，电镜下可见支持细胞之间构成的紧密连接出现断裂；血清T值下降而FSH、LH值反馈性升高，GDNFmRNA的表达量较正常对照组减少。术后14d，同种移植组植睾损害进一步加剧，且GDNFmRNA的表达量明显下降。结论：同种移植植睾组织中支持细胞数目的减少和萎缩及其胞突构成的紧密连接出现断裂可能是植睾生精功能不良的主要原因；GDNFmRNA表达水平可作为睾丸生精功能状态指标之一。     

骨桥蛋白在雄性小鼠生殖系统中的表达及意义

目的:检测骨桥蛋白(OPN)在小鼠睾丸、附睾、精子中的表达,探讨其意义。方法:用免疫组织化学方法检测OPN在正常小鼠睾丸及附睾中的表达情况,免疫细胞荧光法检测OPN在小鼠精子中的表达情况,分析OPN与雄性小鼠生殖能力的关系。结果:OPN在小鼠睾丸、附睾组织及精子上均具有特征性表达。在睾丸中,OPN表达于Sertoli细胞、Leydig细胞以及各级生精细胞,尤其是精原细胞、精子细胞和精子的胞质中;附睾内,OPN的表达主要见于各段上皮主细胞胞质中,部分基细胞、亮细胞中也可见到免疫阳性反应。并且附睾头部的免疫阳性染色相对较弱;免疫荧光染色则将OPN定位于附睾尾精子的顶体帽区及鞭毛。结论:小鼠睾丸、附睾及精子中均存在OPN的特异性表达,OPN可能参与精子的发生及成熟过程,并与精子的活力和受精能力密切相关。     

Ddx3基因在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达

目的:观察小鼠睾丸初次生精过程中的发育特点;检测Ddx3基因与蛋白在小鼠睾丸生精过程中的表达模式;探讨Ddx3基因对小鼠睾丸生精的影响。方法:采用HE染色与PAS染色的方法观察不同日龄小鼠睾丸组织的石蜡切片;用荧光实时定量PCR的方法检测Ddx3 mRNA在小鼠睾丸精子发生过程中的表达;采用免疫组织化学和Western blot方法检测DDX3蛋白在小鼠睾丸初次生精过程中的表达特点和细胞内定位。结果:HE染色结果显示4、13、21、35、42和60日龄是小鼠睾丸发生初次生精过程的特定阶段;荧光实时定量PCR结果显示Ddx3 mRNA在4日龄以后小鼠睾丸组织中均有表达,于35日龄开始明显增高,随后表达水平保持稳定;Western blot显示DDX3蛋白在35、42和60日龄小鼠睾丸生精小管中出现特异性表达并逐渐增高;免疫组织化学法显示DDX3蛋白主要在初级精母细胞和精子细胞的细胞质和细胞核中表达。结论:DDX3蛋白在小鼠初次精子发生过程中呈现特异性表达,提示Ddx3基因可能在精母细胞与精子细胞的发育中发挥作用。     

生精冲剂对环磷酰胺致生精障碍小鼠的治疗作用

目的:观察生精冲剂对环磷酰胺致生精障碍小鼠的治疗作用.方法:随机将30只昆明小鼠等分成3组:正常组、模型组、中药组.用腹腔注射环磷酰胺法建立生精障碍模型.造模完成后,中药组灌胃中药生精冲剂16 g/(kg·d),模型组和正常组经口灌胃等量生理盐水,连续15 d.测量各组小鼠睾丸质量,放射免疫法测定小鼠血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)的水平,对睾丸组织进行组织形态学观察,比较各组小鼠精子计数.结果:与正常组比较,中药组小鼠血清FSH、LH、T水平、睾丸质量、精子计数差异均无统计学意义(P均>0.05);与模型组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05).组织学观察中药组小鼠睾丸曲细精管生精细胞层数及管腔内精子数高于模型组.结论:生精冲剂可有效治疗生精障碍.     

PIAS2蛋白在不同病理分型的无精子症患者睾丸组织中的表达

目的:探讨PIAS2在不同生精功能状态的人睾丸组织中的表达情况。方法:对80例无精子症患者进行睾丸组织病理检查诊断,根据病理形态的不同分为：生精功能正常或基本正常(n=40)、精子发生低下(n=20)、唯支持细胞综合征(n=20)等。选择上述各型结构完整的睾丸组织,分别应用免疫组化法(SP)对PIAS2在不同生精功能状态的睾丸组织进行研究。结果:PIAS2在各级生精细胞多为强阳性表达,呈深棕黄色;PIAS2在间质细胞及支持细胞表达弱阳性表达或不表达。结论:PIAS2染色强弱与睾丸生精功能的强弱有一定关系,是一个潜在的判断睾丸生精功能的指标。     

X-线辐射损伤小鼠睾丸生精上皮内Ghrelin表达的研究

目的 在X线辐射损伤小鼠睾丸生精上皮中Ghrelin表达变化的意义.方法 采用辐射剂量1.0 GyX线对成年小鼠进行全身照射,于照射后16 h、2 w和4 w取小鼠睾丸组织制备标本,免疫组织化学ABC法检测Ghrelin的表达及变化.结果 正常小鼠睾丸Ghrelin表达主要集中在睾丸间质的间质细胞,生精上皮呈阴性反应,照射后Ghrelin间质细胞为阴性,而生精上皮内出现阳性反应,阳性反应定位于精原细胞、精母细胞和早期变形精子细胞,支持细胞未见阳性反应.但随照射时间延长,Ghrelin表达逐渐减少.结论 在X线辐射损伤小鼠睾丸生精上皮中Ghrelin表达的变化,表明Ghrelin及其受体GHS-R系统在小鼠睾丸辐射急性损伤及损伤后修复过程中具有一定的调节作用.     

跨膜蛋白CMTM2在人睾丸和精子中的表达及定位

目的：通过研究跨膜蛋白CMTM2在睾丸和精子中的表达来探讨CMTM2蛋白在男性生殖系统中潜在的功能。方法：Western blot方法检测CMTM2在人睾丸及精子中的表达,免疫组织化学及组织免疫荧光方法检测CMTM2在人睾丸组织中的定位,TRITC-CMTM2及FITC-Hoechst免疫荧光双染法检测CMTM2在人精子顶体反应前后的定位。结果：CMTM2在人睾丸及精子中均有表达,在睾丸组织中CMTM2定位于各级生精细胞的细胞膜,睾丸组织冰冻切片免疫荧光检测的结果与免疫组织化学一致,进一步证实CMTM2存在于睾丸各级生精细胞的细胞膜,在精子中则定位于核后区附近。以TRITC-CMTM2及FITC-Hoechst免疫荧光双染法检测CMTM2在人精子顶体反应前后的定位,在顶体反应前后,CMTM2在人精子的定位及表达量未发生改变。结论：CMTM2在人睾丸和精子中均有表达,其表达定位具有细胞特异性和区域特异性,提示其可能在人睾丸精子发生和精卵融合过程中发挥作用,是男性不育研究的靶基因。CMTM2在男性生殖系统中的表达呈现细胞与生精区域的特异性,提示其高度参与生精功能,但目前针对CMTM2在男性生殖系统与精子生成过程中的作用仍未明确,今后可以采用体外受精 胚胎移植等技术进一步研究CMTM2的作用。     

雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达

目的 研究雄激素受体（AR）敲除小鼠睾丸生精功能及p63在曲细精管中表达的改变.方法 采用雄性Flox-AR小鼠与雌性ACTB-Cre小鼠交配,并敲除胚胎中AR,筛选AR敲除（AR敲除组）和AR未敲除（对照组）雄性小鼠各10只,对比睾丸曲细精管生精功能及p63的表达.结果 两组小鼠曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度评分及总Makler评分之间差异均有统计学意义（P＜0.05）,p63的阳性表达主要位于精原细胞及精母细胞,精子细胞及成熟精子中表达呈阴性,且AR敲除组表达阳性率及HSCRE评分均显著低于对照组（P＜0.01）.结论 AR表达与小鼠睾丸曲细精管p63表达关系密切,AR敲除小鼠睾丸曲细精管生精功能受损、p63表达下调,p63调控生殖细胞的早期分化.     

诱变剂诱导的精子染色体异常对胚胎发育的影响

环磷酰胺处理雄性小鼠后每周与超排卵雌鼠交配,制备分析受精卵染色,持续整个生精周期（７周）。处理组小鼠雄原核染色体出现多种畸形,最敏感期在处理后第８天,相当于诱变剂作用于睾丸精子期。处理后第８天的小鼠精子体外受精试验表明,睾丸精子期受环磷酰胺作用后精子的活力和密度及其受精能力未受显著影响,但胚胎发育受到显著阻滞（＜００１）。     

环磷酰胺对小鼠精子发生的影响

观察雄性小鼠经腹腔注射环磷酰胺后,在不同时期其精子及睾丸组织学的变化。结果;第３４,３６ｄ,精子计数下降,畸形率增高;第２１,２８,３４,３６ｄ,生精细胞数均减少;睾丸超微结构的变化主要表现为各级生精细胞核膜的溶解,核的破坏及精子细胞顶体囊泡的异常,但紧密连接不受影响。提示ＣＹ通过对精原细胞及细线前期初级精母细胞产生毒害作用而影响精子发生。     

人参皂苷Rg1联合人参皂苷Rg3对雄性生殖功能损伤模型小鼠生殖功能的改善作用

目的：探讨人参皂苷Rg1联合人参皂苷Rg3对邻苯二甲酸二丁酯（DBP）诱导的雄性生殖功能损伤模型小鼠生殖功能的改善作用,阐明人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3对生殖功能保护作用的相关机制,为其深入开发提供实验依据。方法：28只清洁级雄性C57BL/6小鼠随机分为模型组（400 mg·kg^-1 DBP）、人参皂苷Rg1+DBP组（20 mg·kg^-1人参皂苷Rg1,400 mg·kg^-1 DBP）、人参皂苷Rg3+DBP组（20 mg·kg^-1人参皂苷Rg3,400 mg·kg^-1 DBP）和联合组（20 mg·kg^-1人参皂苷Rg1,20 mg·kg^-1人参皂苷Rg3,400 mg·kg^-1DBP）,每组7只。DBP溶于玉米油于每天上午灌胃给药,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3溶于生理盐水于每天下午皮下注射给药,每天各给药1次,连续给药35 d。采用WLJY-9000型精子质量检测系统检测各组小鼠的精子密度、精子活力和总畸形率,HE染色观察小鼠睾丸组织病理形态表现,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠血清中睾酮（T）、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平,采用免疫荧光法检测睾丸组织缝隙连接蛋白43（Cx43）蛋白表达水平。结果：与模型组比较,联合组小鼠睾丸脏器系数明显升高（P<0.05）,人参皂苷Rg1+DBP组、人参皂苷Rg3+DBP组和联合组小鼠精子密度和精子活力明显升高（P<0.01）;与模型组比较,人参皂苷Rg1+DBP组、人参皂苷Rg3+DBP组和联合组小鼠血清中T和LH水平明显升高（P<0.01）,FSH水平明显降低（P<0.01）,小鼠睾丸组织中Cx43蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。HE染色,模型组小鼠睾丸组织生精上皮较薄,管腔中生精细胞严重脱落;与模型组比较,人参皂苷Rg1+DBP组和人参皂苷Rg3+DBP组小鼠睾丸组织生精上皮变厚,管腔中脱落细胞较少;联合组小鼠睾丸组织生精上皮结构完整,各级生精细胞排列规则,腔内精子丰富。析因分析,人参皂苷Rg1联合人参皂苷Rg3可致小鼠精子活力（F=6.704,P=0.016）、血清中T水平（F=4.912,P=0.036）和睾丸组织中Cx43蛋白表达水平（F=6.937,P=0.018）升高。结论：人参皂苷Rg1和人参皂苷Rg3单独使用及人参皂苷Rg1与人参皂苷Rg3联合使用,可提高精子密度和精子活力,使小鼠血清中T和LH水平升高,FSH水平降低,减轻小鼠生殖功能损伤,其作用机制可能与上调Cx43表达水平发挥生精保护作用有关,可抑制DBP所致的生殖功能损伤,且人参皂苷Rg1与Rg3联合使用表现为协同作用。     

Effects of Aging on Spermatogenesis, Sperm Maturation and Fertility in Mice

Aging is a normal physiological process. During the process of aging, the human organ- ism undergoes a series of morphological and functional modifications. Testis is the site forspermatogenesis, and testicular sperm are further maturated in the epididymi…     

丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶SRPK2在小鼠睾丸组织中的表达及意义

【摘要】 目的 通过研究丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2（serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2） 基因mRNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的表达特征，探讨该基因在精子发生过程中的作用及意义。 方法 分别采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹杂交（Western blotting）分析该基因mRNA及蛋白产物在小鼠多种组织中的表达；利用实时定量PCR（real-time quantitative PCR）分析SRPK2 mRNA在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的差异表达；应用免疫组织化学染色和间接免疫荧光技术观察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位和生精细胞内的亚细胞定位。 结果 半定量RT-PCR和Western blotting分析显示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睾丸组织中均大量表达；实时定量PCR分析发现SRPK2 mRNA在5周及8周龄雄性小鼠睾丸组织中显著表达，具有明显的阶段特异性表达特征。免疫组织化学染色结果表明SRPK2蛋白阳性着色主要位于曲精小管中的长形精子细胞核；间接免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位于长形精子细胞核表面。 结论 SRPK2基因在小鼠睾丸组织中大量表达，并且具有显著的阶段特异性表达特征和明确的细胞核定位，极有可能在小鼠精子发生的变态成形期参与mRNA前体分子的剪接过程，其作用机制值得进一步深入研究。     

小剂量玉米赤霉烯酮损害雄性小鼠生殖能力的研究

目的 评估小剂量(低于无明显作用水平的浓度)玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)暴露后小鼠精子发生及精液质量的变化趋势,探讨小剂量ZEA暴露对雄性小鼠生殖能力的影响.方法 90只出生后21 d的雄性CD-1小鼠按随机数字表法分成3组,分别暴露于0、20、40 μg/(kg·d)ZEA,处理14、28、42 d后,采用计算机辅助精液质量分析观察精子活力参数,吉姆萨染色观测精子畸形率,测量睾丸体积及质量,免疫组化染色检测生精细胞计数.结果 处理42 d后,20、40 μg,/(kg·d)组精子活动率低于0 μg/(kg·d)组[(82.80±4.34)％、(74.90±6.70)％ vs (93.20±1.66)％,P=0.004、0.002];20、40 μg/(kg·d)组小鼠畸形精子率高于0μg/(kg·d)组[(29.40±1.09)％、(40.80-±6.17)％ vs (19.40±0.45)％,P ＜0.001,P=0.002];20、40μg/(kg·d)组小鼠的单位面积生精细胞计数低于0μg/(kg·d)组(2 422.7±206.1、1 855.8±105.3 vs3 189.8 ±306.0,P=0.013、0.001).结论 小剂量ZEA的暴露能够降低雄性小鼠的精子发生及精液质量,损害其生殖能力.     

诱变剂诱导的精子染色体异常及其对胚胎发育的影响

以环磷酰胺处理雄性小鼠后每周与超排卵雌鼠交配,制备分析受精卵染色体,持续整个生精周期（７周）。处理组小鼠雄原核染色体出现多种畸形,最敏感期在处理后第８天,相当于诱变剂作用于睾丸精子期。处理后第８天的小鼠精子体外受精试验表明,睾丸精子期受环磷酰胺作用后的精子其活力和密度未受显著影响,但其对卵子的受精能力降低,胚胎发育受到显著阻滞（Ｐ＜０．０１）。