C57BL／6-gfp小鼠嗅球神经干细胞的培养鉴定及耳蜗核移植

目的建立C57BL／6－gfp小鼠嗅球神经干细胞体外培养的方法,并初步应用于大鼠耳蜗核定位移植。方法培养C57BL／6－gfp小鼠胚胎嗅球神经千细胞,传代并进行分化实验及鉴定后将其立体定位注射于大鼠耳蜗核。结果所培养的神经干细胞生长良好,可稳定传代,能够分化为3种神经细胞。定位注射后可在局部见到绿色荧光阳性的细胞团。结论该方法培养的C57BL／6-gfp小鼠胚胎嗅球神经干细胞可稳定传代并可以作为荧光标记细胞进行移植实验。     

三种病毒载体经蜗窗膜导入大鼠耳蜗的靶向分布比较

目的比较3种病毒载体经蜗窗膜注入大鼠耳蜗鼓阶介导报告基因在内耳的转染分布,甄选螺旋神经节细胞及其神经纤维基因靶向转移载体。方法分别将带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒、5型-腺病毒、2型-腺相关病毒载体经大鼠耳蜗蜗窗膜缓慢注入鼓阶外淋巴,荧光显微镜观察病毒载体导入后3、7、14天绿色荧光蛋白基因在内耳表达部位及荧光强度。结果经蜗窗膜注入3种病毒载体能有效转染内耳多种类型细胞,相对其他两种病毒载体,5型-腺病毒载体高效转染螺旋神经节及其神经纤维,持续稳定表达2周以上。结论不同病毒载体经蜗窗膜导入后,在耳蜗内的表达分布存在明显差异,5型-腺病毒高效转染耳蜗神经,可作为未来听神经病变分子治疗的载体工具选用。     

增强声环境中嗅球神经前体细胞在耳蜗核的迁移

目的观察增强声环境中移植到大鼠耳蜗核的嗅球神经前体细胞的迁移特点,是否产生部位特异性的修复过程。方法培养嗅球神经前体细胞取自孕14-16d胚胎大鼠,荧光染色Hoechst33342标记后移植到成年大鼠的耳蜗核内侧缘。移植大鼠分为A、B两组,A组置于增强声环境,B组在正常环境中饲养。14d取材观察移植细胞的迁移和分化。结果A组移植细胞有沿听觉神经通路移动的趋势。免疫荧光技术观察到Hoechst33342和神经元核蛋白（NeuN）、谷氨酸阳性三重标记的移植细胞。结论嗅球神经前体细胞移植耳蜗核短期存活良好,增强声刺激可能促进前体细胞在听觉系统的迁移。     

豚鼠胚胎神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的：从胚胎豚鼠端脑组织中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法：分离胚胎豚鼠端脑组织，用含碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达及细胞分化后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。采用荧光染料Hoechst33342标记神经干细胞。结果:从胚胎豚鼠端脑组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin和分化成神经元和神经胶质细胞；荧光染料的标记效率可达96．7％，细胞传代6次后荧光亮度仍无明显衰减。结论:从胚胎豚鼠端脑分离的细胞具有明显的增殖能力及多分化潜能，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞经蜗窗移植到正常耳蜗的研究

目的 探讨感染携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus with GFP,Ad-GFP))的大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cell,NSC)经蜗窗径路移植到正常大鼠耳蜗后的存活、分布及报告基凶的表达情况,并检测移植后大鼠听力和耳蜗形态结构的变化.方法 大鼠随机分为三组:组Ⅰ(感染Ad-GFP的NSC移植组)10只,组Ⅱ(人工外淋巴注射组)10只,组Ⅲ(空白对照组)10只.组Ⅰ及组Ⅱ的手术径路均为经蜗窗途径;两组移植前后分别测试大鼠听性脑干反应(ABR),了解其听力的改变;移植后14 d在荧光显微镜下观察耳蜗中轴切片中感染Ad-GFP的NSC的存活、分布及报告基凶的表达情况,并通过耳蜗切片HE染色及摹底膜铺片硝酸银染色观察耳蜗形态结构及毛细胞数目的 变化.结果 组Ⅰ及组Ⅱ术后ABR反应阈分别为(33.5±3.4)dB和(32.5±3.5)dB,与移植前相比差异均无统计学意义(P值均＞0.05),两组术后ABR反应阈问的差异亦无统计学意义(t=0.526,P＞0.05).两组大鼠术后耳蜗形态结构均正常.组Ⅰ NSC移植入耳蜗14 d后,存活的细胞主要分布在耳蜗底回的前庭阶和鼓阶,耳蜗其他各回的前庭阶和鼓阶中也有存活,同时表达强烈的绿色荧光.三组均出现耳蜗外毛细胞的散在缺失,总缺失率均未超过1%,且三组各回的缺失率及总缺失率之间的差异均无统计学意义(P值均＞0.05);三组耳蜗各回均未见内毛细胞的缺失.结论 感染Ad-GFP的NSC经蜗窗径路移植到正常大鼠耳蜗后可以存活并表达GFP基因,移植对大鼠听反应阈及耳蜗形态结构无明显影响.     

耳蜗传出神经之分布

用豚鼠研究耳蜗传出神经之分布。Rasmussen首先描述耳蜗之传出神经,发现了交叉或不交叉的橄榄耳蜗束(OCB)。Churchill和Schuknecht测出耳蜗传出神经分泌乙酰胆素酯酶(AchE)并向中枢传入。在上橄榄体神经核集合处(SOC)的神经元呈AchE阳性者表示其细胞来自OCB。作者用12只300～500克重的健康豚鼠,麻醉后打开鼓泡,将50%辣根过氧化物酶(HRP)0.3～0.5μl由蜗窗注入鼓阶,避免药液溢人鼓室,作为检测的标记。经40～48小时后用1.5%麦胺基乙醛和1%三聚甲醛固定作检查。结果:所有豚鼠之两侧SOC都有HRP逆行输入后所产生的颗粒反应,有10只豚鼠在外侧丘系腹核内也可见到。每只豚鼠竟有500个神经元有HRP之标记,一般注射侧比对侧多3倍。当HRP进入蜗核顺行输入耳蜗神经,也可出现     

干细胞移植治疗噪声性和药物性聋的比较实验研究

目的：比较耳蜗干细胞移植治疗噪声性聋豚鼠和药物性聋豚鼠模型的效果。方法选用清洁级健康成年纯白红目豚鼠120只,建立噪声性聋模型耳蜗干细胞移植组、噪声性聋模型空白对照组、药物性聋模型耳蜗干细胞移植组、药物性聋模型空白对照组,每组30只;向噪声性聋模型耳蜗干细胞移植组和药物性聋模型耳蜗干细胞移植组耳蜗分别注入耳蜗干细胞悬液10μl,向噪声性聋模型空白对照组和药物性聋模型空白对照组耳蜗分别注入10μl 生理盐水。于术后7、28、56 d 进行 ABR 检测并进行免疫荧光观测 Nestin 阳性细胞数和 MyosinⅦA阳性细胞数。结果在噪声性聋和药物性聋耳蜗干细胞移植组的耳蜗鼓阶处观测到 Nestin 阳性细胞和 MyosinⅦA 阳性细胞,但噪声性聋干细胞移植组的 Nestin 阳性细胞和 MyosinⅦA 阳性细胞数量多于药物性聋干细胞移植组;耳蜗干细胞移植后噪声性聋和药物性聋组 ABR 反应阈均下降,但术后28天和56天噪声性聋干细胞移植组ABR 阈值分别为52．61±5．14和40．39±4．59 dB SPL,低于药物性聋干细胞移植组（分别为66．39±4．77和60．41±4．17 dB SPL）。结论耳蜗干细胞移植对于噪声性聋豚鼠模型的治疗效果优于药物性聋豚鼠模型。     

骨髓基质干细胞豚鼠内耳移植初步观察

目的建立骨髓基质干细胞(marrow stromal cell，MSC)内耳移植技术，研究内耳细胞移植的可行性。方法将豚鼠骨髓基质干细胞分离培养，用4，6-联脒-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)荧光标记，采用显微注射技术在耳蜗底周鼓阶钻孔，通过钻孔处缓缓注入细胞，术后14天处死，行耳蜗石腊切片，荧光显微镜及HE染色观察移植细胞成活情况。结果骨髓基质干细胞内耳移植成活，并贴壁生长。结论成功地建立了骨髓基质干细胞内耳移植技术，为进一步研究MSC在内耳的分化和表达奠定了重要的基础。     

脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞在受损耳蜗内的生存和分化

目的探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor gene,BDNF)基因转染的骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSC)在受损耳蜗内的生存和分化情况。方法将转染了BDNF基因并在体外诱导分化的BMSC(BDNF-BMSC)标记后,通过鼓阶注射植入阿米卡星致聋的豚鼠耳蜗内(BDNF-BMSC组,18只),并设注射未诱导分化的BMSC的豚鼠为对照组(BMSC组,18只)。在注射后1、2、4w取耳蜗组织石蜡切片,HE染色和荧光染色观察注射细胞的分布;神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protien,GFAP)抗体免疫组化染色观察注射细胞在耳蜗内的分化。结果 BDNF-BMSC和BMSC在耳蜗内均能成活并分布到一定的区域,鼓阶和前庭阶较多,中阶和蜗轴较少。NSE和GFAP免疫化学可见BDNF-BMSC部分细胞阳性染色,而BMSC阳性细胞较少。BDNF-BMSC在1、2w时平均光密度(AOD)值较高,在4w时显著下降(P<0.05);在各时间点,BDNF-BMSC组AOD值均显著高于BMSC组(P<0.01)。结论诱导分化前后的BMSC耳蜗移植后均能成活并分布到一定的区域,在耳蜗内BDNF-BMSC分化能力明显强于BMSC,但随时间延长分化能力下降。     

蜗内直流电对耳蜗基底膜振动的影响

目的：探讨外加直流电流后对耳蜗基底膜振动的影响。方法：在豚鼠耳蜗底回距圆窗龛缘2．4mm处开一直径约0．4mm小孔，作为测量活体基底膜的振动速度测试窗，在测试窗上，下缘的鼓阶，前庭阶各开一小孔，将铂－铱电极置入鼓阶，前庭阶作为跨蜗管的电刺激电极，用激光多普勒干涉测速仪观察直流电流对纯音诱发的基底膜振动速度的影响。结果：当外加电流前庭阶极性为正，鼓阶极性为负时，可以看到基底膜振动速度显著增大，给相反极性电流时，基底膜振动速度减小。结论：生理状态下的正内淋巴电位是耳蜗将声音能量转变为神经冲动的必要条件，适当提高外毛细胞顶端正电位，有助于提高耳蜗放大器的增益，外加负电位则严重影响耳蜗放大器的增益。     

阳离子脂质体介导BFGF/GFP基因对药物性耳蜗损害的防治作用

目的 探讨阳离子脂质体(天然碱性脂SA)携带碱性成纤维细胞生长因子/绿色荧光蛋白(bFGF/GFP)基因在豚鼠耳蜗中的表达,以及对庆大霉素所致耳蜗损害的防治作用。方法 将36只豚鼠分为3组,预防组右耳园窗注入SA-bFGF/GFP复合物后次日肌肉注射庆大霉素150mg.Kg~(-1).d~(-1)8天,治疗组先用庆大霉素8d后次日右耳给药,对照组单用庆大霉素8d。分别于实验前后及处死前行听觉脑干诱发电位(ABR)测试。荧光显微镜下观察耳蜗GFP的表达;用耳蜗琥珀酸脱氢酶染色铺片,扫描电镜观察毛细胞的缺失情况。结果 荧光显微镜下见双侧耳蜗均有GFP表达。预防和治疗组处死前的双耳ABR阈值与对照组比较差异有显著意义(P<0.01,P<0.05),耳蜗内外毛细胞缺失数与对照组比较差异有显著意义(P<0.01,P<0.05)。结论 SA脂质体介导的bFGF/GFP基因单耳给药双侧耳蜗均有高效表达,并对庆大霉素所致的耳蜗损害有防治作用。     

Survival of Neural Stem Cells in the Cochlea

Adult rat hippocampus-derived neural stem cells (NSCs) have been reported to have been successfully grafted in several brain regions. To evaluate the possibility of treatment of sensorineural hearing loss using NSCs, survival of NSCs in the cochlea was estimated. NSCs were grafted into newborn rat cochleas. Within 2-4 weeks of grafting to the cochlea, some NSCs survived in the cochlear cavity. Some of them had adopted the morphologies and positions of hair cells. This suggests that NSCs can adapt to the environment of the cochlea and gives hope for treatment of the damaged cochlea and sensorineural hearing loss.     

Survival of neural stem cells in the cochlea

Adult rat hippocampus-derived neural stem cells (NSCs) have been reported to have been successfully grafted in several brain regions. To evaluate the possibility of treatment of sensorineural hearing loss using NSCs, survival of NSCs in the cochlea was estimated. NSCs were grafted into newborn rat cochleas. Within 2-4 weeks of grafting to the cochlea, some NSCs survived in the cochlear cavity. Some of them had adopted the morphologies and positions of hair cells. This suggests that NSCs can adapt to the environment of the cochlea and gives hope for treatment of the damaged cochlea and sensorineural hearing loss.     

碱性成纤维细胞生长因子脑脊液途径用药对听觉系统保护作用的实验研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）脑脊液途径用药对硫酸丁胺卡那霉素诱导的豚鼠听觉损害的防治作用,为临床有效防治感音神经性聋提供理论依据。方法应用硫酸丁胺卡那霉素肌肉注射诱导豚鼠听觉损害,将bFGF采用脑脊液途径注入豚鼠体内。用药结束后测试听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）阈值,行耳蜗灌注琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）组化染色,耳蜗铺片,观察染色强度及内、外毛细胞损伤程度,取脑干和双侧耳蜗行甲苯胺蓝染色,耳蜗螺旋神经节细胞计数,并测量相应的积分光密度（integral optical density,IOD）。结果用药后各组动物ABR阈值测试有显著性差异;耳蜗SDH染色和铺片内、外毛细胞损伤程度不同;耳蜗切片螺旋神经节细胞计数及IOD测定、耳蜗核切片IOD测试各组间比较有显著性差异。结论bFGF脑脊液途径用药对硫酸丁胺卡那霉素诱导的豚鼠听觉系统损害有防治作用。     

脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞在药物致聋豚鼠内耳的表达及保护作用

目的 探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在药物致聋豚鼠内耳的表达及对螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SGC)的保护作用.方法 阿米卡星致聋的豚鼠随机数字表法分为两组,治疗组经鼓阶开窗注射BDNF基因修饰的MSC,对照组注射外淋巴液.各组分别在术后7 d及28 d处死动物,荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测耳蜗组织中BDNF mRNA的表达,耳蜗切片计算SGC细胞密度,末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测SGC凋亡情况.结果 治疗组在术后7 d和28 d的BDNF mRNA相对表达量均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P值均＜0.01).治疗组术后7 d及28 d的SGC密度均高于对照组,并且治疗组术后7 d及28 d的SGC凋亡指数也比对照组明显下降,差异具有统计学意义(P值均＜0.01).结论 BDNF基因修饰的MSC在致聋豚鼠内耳中的表达时间超过28 d,对SGC具有保护作用.     

Neural stem cells injected into the sound-damaged cochlea migrate throughout the cochlea and express markers of hair cells, supporting cells, and spiral ganglion cells

Most cases of hearing loss are caused by the death or dysfunction of one of the many cochlear cell types. We examined whether cells from a neural stem cell line could replace cochlear cell types lost after exposure to intense noise. For this purpose, we transplanted a clonal stem cell line into the scala tympani of sound damaged mice and guinea pigs. Utilizing morphological, protein expression and genetic criteria, stem cells were found with characteristics of both neural tissues (satellite, spiral ganglion, and Schwann cells) and cells of the organ of Corti (hair cells, supporting cells). Additionally, noise-exposed, stem cell-injected animals exhibited a small but significant increase in the number of satellite cells and Type I spiral ganglion neurons compared to non-injected noise-exposed animals. These results indicate that cells of this neural stem cell line migrate from the scala tympani to Rosenthal's canal and the organ of Corti. Moreover, they suggest that cells of this neural stem cell line may derive some information needed from the microenvironment of the cochlea to differentiate into replacement cells in the cochlea.     

豚鼠外周血单个核细胞与耳蜗组织中糖皮质激素体含量的相关性分析

目的通过分析豚鼠外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)与耳蜗组织中糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)mRNA和蛋白含量变化,探讨PBMC与耳蜗组织中GR含量的相关性。方法将32只健康白色豚鼠随机分为地塞米松组和对照组,地塞米松组予地塞米松(5mg/ml,10mg/kg/day)腹腔连续注射7天,对照组予等体积的生理盐水腹腔连续注射7天。给药结束后次日取豚鼠PBMC及双侧耳蜗组织,通过实时荧光定量PCR检测豚鼠PBMC和左耳耳蜗组织中GR mRNA表达水平,通过Western blot结果半定量分析豚鼠PBMC和右侧耳蜗组织中GR蛋白的含量,并运用统计学软件SPSS16.0进一步分析豚鼠PBMC与耳蜗组织中GR mRNA及GR蛋白表达量的相关性及短期全身使用地塞米松对其表达量的影响。结果 GR mRNA与GR蛋白在豚鼠PBMC与耳蜗组织中均有表达,地塞米松组PBMC及耳蜗组织中GR mRNA与GR蛋白含量较对照组有明显提高,统计学相关性分析结果提示地塞米松组及对照组的PBMC与耳蜗组织的GR mRNA、GR蛋白表达量存在正相关,结果有统计学意义。结论豚鼠短期全身使用地塞米松可以使PBMC与耳蜗组织中的GR mRNA、GR蛋白含量均同步上调,豚鼠PBMC与耳蜗组织中GR mRNA、GR蛋白的含量变化具有正相关性。PBMC中GR含量可间接反映耳蜗组织的GR表达水平。     

Inhibition of caspases alleviates gentamicin-induced cochlear damage in guinea pigs

The efficacy of caspase inhibitors for protecting the cochlea was evaluated in an in vivo study using guinea pigs, as the animal model system. Gentamicin (12 mg/ml) was delivered via an osmotic pump into the cochlear perilymphatic space of guinea pigs at 0.5 microl/h for 14 days. Additional animals were given either z-Val-Ala-Asp (Ome)-fluoromethyl ketone (z-VAD-FMK) or z-Leu-Glu-His-Asp-FMK (z-LEHD-FMK), a general caspase inhibitor and a caspase 9 inhibitor, respectively, in addition to gentamicin. The elevation in auditory brain stem response thresholds, at 4, 7, and 14 days following gentamicin administration, were decreased in animals that received both z-VAD-FMK and z-LEHD-FMK. Cochlear sensory hair cells survived in greater numbers in animals that received caspase inhibitors in addition to gentamicin, whereas sensory hair cells in animals that received gentamicin only were severely damaged. These results suggest that auditory cell death induced by gentamicin is closely related to the activation of caspases in vivo.     

用羟基磷灰石纳米粒作内耳基因治疗新载体的体内外研究

目的 研制羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAT)纳米粒,评价其作为新的内耳基因转染载体的可能性.方法 用化学共沉淀-水热合成法制备HAT载体.经DNA电泳做不同pH值和HAT含量的DNA结合实验,了解HAT纳米粒对DNA的结合和保护作用;用四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒对宫颈癌上皮Hela细胞的毒性;用Hela细胞和小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞做神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)体外转染实验(绿色荧光蛋白基因荧光显微镜法)及NT3的蛋白印迹分析,观察HAT介导的NT3基因对活细胞的体外转染能力和基因表达情况;经实验性兴奋性耳毒性损伤豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT纳米载体-含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒载体-NT3基因复合物(HAT-pEGFPC2-NT3),用免疫组化(二氨基联苯胺法)观察NT3在耳蜗的表达,以了解HAT纳米载体在活体动物耳蜗介导基因转染的能力.结果 含量250.0 μg/ml,pH值3～7是这种长约40～50 nm的短棒状HAT纳米粒能完全结合重组质粒pEGFPC2-NT3的最低含量混悬液和最佳pH环境,并可有效保护基因不被核酸酶(DNase Ⅰ)破坏.四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒从62.5 μg/ml至500.0 μg/ml 4种混悬液对Hela细胞存活率无明显影响,细胞形态无变化.EGFP荧光显微镜观察显示,HAT纳米载体对Hela细胞的基因转染率为15.7%±2.6%(-x±s);将HAT-pEGFPC2-NT3转染培养的小鼠耳蜗神经元,也可见明显的EGFP表达.NT3免疫组化显示,向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT-pEGFPC2-NT3,可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达.结论 HAT纳米粒不仅可介导NT3基因的体外转染,而且可介导其耳蜗活体转染;尽管转染率有待提高,但由于没有病毒载体转染造成的生物威胁,仍不失为一种很有研究价值的非病毒型内耳基因治疗载体.