新型大肠杆菌—分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因？…

用ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅｃａｔｉｏｎ）技术克隆了卡介苗（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）热休克蛋白６５（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６５，ｈｓｐ６５）启动子序列，构建成穿梭载体ＭＥ－６５。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因，ＢＣＧ的ｈｓｐ６５高效启动子序列以有在分析杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因，将其转化到耻垢分枝杆菌和ＢＣＧ中均可     

分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳定表达

卡介苗（ＢＣＧ）是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ｐＵＣ１９为骨架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列（编码卡那霉素抗性）以及分枝杆菌质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌（含ＢＣＧ）、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下了基础。     

分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的 筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株.方法 采用PCR反应从pORF-h IL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12.将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12).结果 成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变.rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的 片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌.rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带.结论 分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功.     

卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.     

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。     

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的 克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因, 并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序.将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果 成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因.DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致.含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白.结论 获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础.     

电穿孔法对分枝杆菌进行高效基因转化

目的 :探讨卡介苗 (BacilleCalmette Guerin ,BCG)分枝杆菌的电穿孔转化方法及其影响因素。方法 :在基因脉冲仪上用电穿孔法对快生长型耻垢分枝杆菌———M .Smegmatismc2 15 5和BCG电转化大肠杆菌 分枝杆菌穿梭质粒ME 6 5。结果 :电穿孔法可以成功地转化两种分枝杆菌 ,筛选出卡那霉素抗性菌株。通过对转化子提取质粒进行酶切鉴定和PCR扩增均证明为阳性重组体。转化效率达 10 4 / μgDNA。重组质粒可以在分枝杆菌中稳定复制。初步结果表明 ,质粒DNA的构象和浓度、初始培养物的浓度和活力、电转化参数包括电压、电阻以及转化前对菌体的冰浴时间等都对转化效率有一定的影响。结论 :BCG重组疫苗研制中分枝杆菌的基因转化问题的解决为研制能表达分枝杆菌及其它感染性疾病或肿瘤抗原的BCG多价重组疫苗提供了实验基础。     

分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳…

卡介苗是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ＰＵＣ１９为内架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列以及分枝 力质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ＰＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下基础。     

日本血吸虫26ku抗原基因在分枝杆菌和大肠杆菌中的高效表达

构建了大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００，并将日本血吸虫２６ｋｕ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因在分枝杆菌中进行了克隆和表达。以质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｋ为骨架，分别克卫生玫分枝杆菌质粒复制基因、Ｎｅｏ基因（编码卡那霉素抗性）以及人结核杆菌热休克蛋白７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｓｐ７０）的启动子，并带有质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的多克隆位点，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭     

The Construction of Schistosoma Japonicum Vaccine BCG Sj26GST and Its Identification

Ｖａｃｃｉｎｅｓａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｅｆ－ｆｅｃｔｉｖｅｔｏｏｌｓｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ．ＢＣＧｈａｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｕｎｉｑｕｅｆｅａｔｕｒｅｓ：Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｃａｎｂｅｕｓｅｄｉｎｉｍｍｕｎｉｔｙｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｘｐｅｒｉ－ｍｅｎｔｄｉｒｅｃｔｌｙｗｉｔｈｏｕｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏ－ｃｅｄｕｒｅｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｃｈｅａｐ;ｓｉｍｐｌｅｏｎｅｖａｃ－ｃｉｎａｔｉｏｎｃａｎｉｎｄｕｃｅｉｍｍｕｎｉｔｙｃｏｎｔｉｎｕ…     

Construction of Shuttle Expression Plasmid and Stable Expression of Foreign Gene in Mycobacteria and E．Coli

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＳｈｕｔｔｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｌａｓｍｉｄａｎｄＳｔａｂｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ＦｏｒｅｉｇｎＧｅｎｅｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄＥ．ＣｏｌｉＨＵＡＮＧＦＵＹｏｎｇ－ｍｕ（皇甫永修）；ＺＨＡＮＧＤａ－ｊｕ...     

Construction of shuttle expression plasmid and stable expression of foreign gene inmycobacteria andE. Coli

Summary By employing the pUC19 as a backbone, the regulatory and signal sequences which encode kanamycin resistance, and mycobacterial plasmid origin of replication (oriM) were cloned into the pUC19. The recombinant E. Coli-mycobacteria shuttle expression plasmid pBCG-8000 was constructed. The pBCG-8000 was able to replicate in both E. Coli and mycobacteria (including BCG) systems, and to confer stable kanamycin resistance upon transformants. The study should facilitate the development of BCG and other mycobacteria into multivalent vaccine vectors. This work was funded from National Science Foundation of China.     

Expression of Foreign Gene in Mycobacterium Regulated by Human Mycobacterium Tuberculosis Heat Shock Protein 70 Promoter

CHENGJizhong,male,bornin1968,LecturerThisprojectwassupportedbyPrimaryFoundationofChina(No.94-Y-19),ChineseNationalNaturalScienceFoundation(No.39480022),andChineseHealthMinistryFoundation(No.94-1-144).Heatsh0ckproteinrepresentsahighlyconservedgr0up0fproteinsinb0thprokary0ticandeukaryoticcelltypeswhichisstronglyupregulatedinresponsetoava-rietyofdifferentstressconditi0ns,suchasheat,irradiation,andthepresenceofoxida-tiveandt0xicagents-Theyp1ayanimpor-tantroleintrans-membranetransferandcor…     

The construction ofSchistosoma Japonicum vaccine BCG-Sj26GST and its identification

Summary The expression of foreign gene,Schistosoma Japonicum 26 ku antigen (Sj26GST),in Bacillus Calmette-Guerin (BCG),Mycobacterium CM. smegmatis) andEscherichia coli (E. coli) were studied. The cDNA fragment encoding Sj26GST was amplified by PCR using plasmid pGEX, which could express Sj26GST inE. coli as template. The Sj26GST cDNA was cloned into the downstream of humanM. tuberculosis heat shock protein (hsp) 70 promoter with correct reading frame, and then the DNA fragment containing hsp70 promoter and Sj26GST gene were subcloned together intoE. coli-Mycobacteria shuttle plasmid pBCG-2000 to construct the expression shuttle plasmid pBCG-Sj26. The recombinant BCG andM. smegmatis mc²155, which were electroplated with pBCG-Sj26, could express Sj26GST and the recombinantSchistosoma Japonicum vaccine BCG-Sj26GST was made. The recombinant Sj26GST (rSj26GST) were soluble and could be observed on SDS-PAGE at molecular weight of 26 ku. The content of rSj26GST accounted for 15% and 10% of total bacterial protein in BCG andM. smegmatis respectively. The results of Western blot showed the combination of rSj26GST with antibody of GST. This project was supported by Primary Foundation of China (No. 94-Y-19), Chinese National Nature Science Foundation (No. 339480022) and Chinese Health Foundation (No. 94-1-131).     

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达

目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。     

卡介苗穿梭表达质粒pMSIL-2的构建及鉴定

目的 构建分泌性表达白介素(IL)-2的重组卡介苗(BCG)。方法 分别以BCG和IL-2cDNA为模板，通过PCR扩增得到约117bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和399bp的IL-2基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列克隆至大肠杆菌-BCG穿梭质粒pMV261，得到重组质粒pMS。再将IL-2基因克隆至pMS中，得到重组质粒pMSIL-2。结果 质粒pMSIL-2经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实，克隆基因BCG-Ag85B信号肽和IL-2正确插入载体pMV261。结论 重组质粒pMSIL-2可望在BCG中分泌性表达细胞因子IL-2，该质粒的构建成功为改造BCG、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。     

应用E1区缺陷载体构建携带SEA基因的选择性腺病毒

目的:构建由端粒酶启动子(hTERT)调控的携带超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcus aureus enterotoxin A,SEA)基因的选择性复制重组腺病毒.方法:应用酶切、连接方法将hTERT连接于腺病毒穿梭质粒E1A和E1B序列之前调控E1A和E1B蛋白的表达,CMV启动子和SV40分别...