许旺细胞源神经营养因子在大鼠腰髓中的表达

背景：许旺细胞能分泌多种营养因子，有保护和营养神经元的作用，并对神经损伤后的修复起促进作用。目的：观察正常成年大鼠和不同胎龄鼠及幼鼠腰髓组织中许旺细胞源神经营养因子的表达，及其对脊髓不同发育时期的作用。设计：对照实验。动物实验。材料：实验于2003-09于南华大学动物实验室完成，采用Wister大鼠30只，雌雄不限，体质量为150-300g，由南华大学动物实验室提供。千预：①取材和切片：取体质量180-220g，成熟期为4-6周正常成年大鼠腰髓和背根神经节，继而行后固定。共8只雌鼠受孕，取不同孕龄母鼠中的胎鼠及幼鼠腰髓组织，分别行冰冻切片。②免疫组化染色：以抗许旺细胞源神经营养蛋白抗体作为一抗，行卵白素-生物素过氧化物酶复合物免疫组化染色，观察染色部位的灰度，通过电脑上扫描计算染色深度得出半定量值，分析许旺细胞源神经营养因子在腰髓的表达。主要观察指标：①正常腰髓免疫组化染色结果。②生长发育的腰髓免疫组化染色结果。结果：共8只雌鼠受孕，实验样本均取自8只受孕雌鼠的胎鼠及所产幼鼠。①正常腰髓免疫组化染色结果：许旺细胞源神经营养因子在成年大鼠腰髓的整个白质和灰质后角Ⅲ、Ⅳ，Ⅴ层有较低表达。②生长发育的腰髓免疫组化染色结果：许旺细胞源神经营养因子在胎龄14d和胎龄15d开始有表达，胚胎时期表达先增高后下降，其中胎龄21d最高。出生后许旺细胞源神经营养因子在腰髓中表达明显下降，其中第7和12d最高。结论：许旺细胞源神经营养因子在成年大鼠腰髓及背根神经节有较低表达，在生长发育的腰髓中表达基本呈逐渐下降趋势。许旺细胞源神经营养因子对大鼠脊髓的发育可能起促进作用，此结果说明许旺细胞源神经营养因子在脊髓生长发育过程中，主要在胚胎发育时期起作用。     

神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的：观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞，对大鼠脊髓损伤的修复作用。 方法：实验于2004-07／12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只，空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞，28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。 结果：68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果：脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损，驻杆时间减少超过30％，单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力，分别为对照的36％和65％，神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想，可达到正常对照的93％以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果：许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量：（22．7&;#177;1．9），（31.3&;#177;5．3），（12．9&;#177;3．0）个／视野；平均吸光度：0．035&;#177;0．02l，0．075&;#177;0．033，0．023&;#177;0．011，P均〈0．01]。 结论：外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞，能够更加优化神经修复微环境，有利于神经损伤后修复。     

神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的:观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞,对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法:实验于2004-07/12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只。空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞,28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。结果:68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果:脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损,驻杆时间减少超过30%,单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力,分别为对照的36%和65%,神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想,可达到正常对照的93%以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果:许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量:(22.7±1.9),(31.3±5.3),(12.9±3.0)个/视野;平均吸光度:0.035±0.021,0.075±0.033,0.023±0.011,P均<0.01]。结论:外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞,能够更加优化神经修复微环境,有利于神经损伤后修复。     

许旺细胞源神经营养因子肌肉注射对端侧吻合后神经再生的影响

目的:观察分析肌肉注射许旺细胞源神经营养因子能否提高端侧吻合后再生神经的质量。方法:①实验选取清洁级雌性SD大鼠24只,随机数字表法分为许旺细胞源神经营养因子组、生理盐水对照组,12只/组。每组大鼠均随机切断一侧腓总神经,与胫神经外膜开窗处行端侧吻合,另一侧作为正常对照。②术后许旺细胞源神经营养因子组于神经端侧吻合的小腿外侧肌肉注射100mg/L许旺细胞源神经营养因子,1次/周,共4周。生理盐水对照组于相同位置注射0.1mL生理盐水,方法和疗程同上。两组作为正常对照的右侧神经不作任何处理。③术后12周,两组大鼠行腓总神经电生理特性检测、组织学检查及胫前肌湿重测定。结果:实验选取清洁级雌性SD大鼠24只,全部进入结果分析。①两组术后12周电生理检测结果:与生理盐水对照组比较,许旺细胞源神经营养因子组端侧吻合侧的神经传导速度加快[(17.33±1.59),(23.14±1.42)m/s,P<0.05],相应的潜伏期则缩短[(8.54±0.63),(5.57±0.78)ms,P<0.05],且复合肌肉动作电位振幅升高[(2.35±0.51),(3.77±0.49)mV,P<0.05]。②两组术后12周胫前肌湿重及腓总神经纤维数量测定结果:许旺细胞源神经营养因子组胫前肌湿重比值及腓总神经纤维数量比值均显著高于生理盐水对照组(0.785±0.152,0.515±0.132;0.747±0.126,0.453±0.151;P<0.05)。③两组术后12周组织学检查结果:与生理盐水对照组比较,许旺细胞源神经营养因子组端侧吻合侧再生的腓总神经横切面神经纤维数目相对较多,神经纤维粗,排列相对较齐,髓鞘厚,束间有少量结缔组织。结论:肌肉注射许旺细胞源神经营养因子可在一定程度上提高端侧吻合后再生神经的质量。     

牙种植体与许旺细胞联合培养时脑源性神经营养因子及神经生长因子mRNA的表达

背景：许旺细胞很可能是促进骨整合种植牙周围神经再生的有效因子。目的：观察许旺细胞与牙种植体复合培养时脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达,分析牙种植体与许旺细胞的相容性。方法：取成年犬发生Wallerian变性的坐骨神经,用酶消化法和差速贴壁法相结合培养许旺细胞,以1×108L^-1浓度接种于喷钛砂酸蚀的牙种植体表面和培养皿。分别在细胞培养的第1,3,6,8,11天,以反转录-聚合酶链反应检测许旺细胞中脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达。结果与结论：许旺细胞与牙种植体复合培养时,脑源性神经营养因子与神经生长因子的表达趋势与许旺细胞单独培养时相同,呈单峰型;但两种基因的表达水平高于许旺细胞单独培养组,且达到表达峰值的时间较早。提示喷钛砂酸蚀表面的牙种植体能够促进许旺细胞的基因表达,两者具有良好的相容性。     

牙种植体与许旺细胞联合培养时脑源性神经营养因子及神经生长因子mRNA的表达

背景:许旺细胞很可能是促进骨整合种植牙周围神经再生的有效因子。目的:观察许旺细胞与牙种植体复合培养时脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达,分析牙种植体与许旺细胞的相容性。方法:取成年犬发生Wallerian变性的坐骨神经,用酶消化法和差速贴壁法相结合培养许旺细胞,以1×108L-1浓度接种于喷钛砂酸蚀的牙种植体表面和培养皿。分别在细胞培养的第1,3,6,8,11天,以反转录-聚合酶链反应检测许旺细胞中脑源性神经营养因子与神经生长因子mRNA的表达。结果与结论:许旺细胞与牙种植体复合培养时,脑源性神经营养因子与神经生长因子的表达趋势与许旺细胞单独培养时相同,呈单峰型;但两种基因的表达水平高于许旺细胞单独培养组,且达到表达峰值的时间较早。提示喷钛砂酸蚀表面的牙种植体能够促进许旺细胞的基因表达,两者具有良好的相容性。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰骨髓基质干细胞移植脑出血大鼠神经营养因子的表达

背景:研究证实,细胞移植和神经营养因子相结合治疗脑损伤能促进大鼠神经功能的恢复。目的:观察移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞对大鼠脑出血后神经营养因子表达的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型鼠随机分为3组,骨髓基质干细胞组、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组和对照组于建模后第3天在脑出血部位分别移植骨髓基质干细胞、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞以及生理盐水。结果与结论:与对照组和骨髓基质干细胞组相比,胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组大鼠神经功能恢复更好;与对照组相比,移植后1,2周其他2组各神经营养因子表达均显著增加(P<0.05)。提示胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗脑出血大鼠比单纯骨髓基质干细胞有更好的神经保护作用。     

阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰许旺细胞与基质凝胶桥接损伤的坐骨神经

背景：周围神经损伤后给予外源性神经营养因子3对促进神经再生及保护肌萎缩均有作用。目的：观察阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞与细胞外基质凝胶桥接修复坐骨神经损伤的效果。方法：取80只成年Wistar大鼠制作左侧坐骨神经缺损模型,随机分组,以不同材料进行修复：细胞外基质凝胶组、许旺细胞-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组、神经营养因子3基因-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组、神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组。结果与结论：①腓肠肌肌肉组织学检查：术后8,12周神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组腓肠肌横截面积结构清晰、肌纤维粗大,呈基本正常肌肉结构,纤维组织较少,肌横截面积明显大于其他3组（P〈0.05,P〈0.01）。②肌细胞凋亡检测：术后4,8,12周神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组肌细胞凋亡数低于其他3组（P〈0.05）。表明阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞与细胞外基质凝胶可较好修复损伤神经,防止失神经肌萎缩细胞凋亡。     

慢性压迫损伤对大鼠脊髓神经营养因子及其受体表达的影响

目的：观察脊髓慢性受压后神经营养因子及其受体的变化情况。方法：采用大鼠后路渐进性脊髓压迫动物模型，用免疫组化的方法观察脑源性 神经营养因子（BDNF）及其受体TrkB表达的变化。结果：正常大鼠脊髓组织中，BDNF和TrkB反应物质几乎存在于所有的脊髓神经元，灰白质中胶质细胞染色明显；脊髓受到压迫后，压迫节段脊髓组织的神经元和胶质细胞表达BDNF和TrkB增强。结论：在慢性压迫性脊髓损伤的过程中，脑源性神经营养因子及其受体表达增多，这可能对损伤脊髓神经元 的存活和保留具有重要作用。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的：观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法：实验于2005-07／12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠，体质量（250&;#177;20）g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组，对照组6只，仅进行至椎板切除，即行切口关闭，不损伤脊髓。损伤组18只，3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，T10处椎板切开后，在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫，刺激无反应后，关闭切口。分别于伤后3，7，21d不同时间点取材，每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片，运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果：①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆，神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3，7，21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[（15．48&;#177;3．20）。（12．59&;#177;2．03），（11．33&;#177;1．92），（7．31&;#177;1．54）；（16．73&;#177;3．30），（11．15&;#177;2．85）。（13．20&;#177;3．39）。（6．00&;#177;1．50），（P〈0．01）1，术后3d时达高峰，随伤后时间的延长进行性减少。⑧损伤后3，7，21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[（10．63&;#177;2．90），（14．07&;#177;2．37），（9．35&;#177;3．50），（4．00&;#177;0．63）。（P〈0．01）]，术后7d时达高峰，3d与21d比较差异无显著性意义。结论：脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加，提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致神经元死亡的干预

背景:许旺细胞源神经营养因子是从许旺细胞胞浆中分离纯化出的一种相对分子质量为58000的神经营养物质,具有明显的神经营养活性,能对抗一氧化氮神经毒性物质。目的:建立根性撕脱伤动物模型,观察许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致脊髓前角运动神经元死亡的保护作用。设计:重复观察测量。单位:深圳市第二人民医院骨三科,中山大学附属第一医院显微外科。材料:实验于2003-03/05在中山大学医学院实验动物中心完成。选用清洁级3～4月龄SD大鼠20只,随机分为许旺细胞源神经营养因子组、生理盐水对照组,各10只。两组动物均以左侧为正常侧,右侧为损伤侧。方法:①两组大鼠均建立颈6,7神经根性撕脱伤动物模型。②许旺细胞源神经营养因子组将一小块预浸有质量浓度为1g/L的许旺细胞源神经营养因子40μL的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面,生理盐水对照组将一小块预浸有等量生理盐水的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面。③明胶海绵表面置硅胶管,硅胶管一端与明胶海绵缝扎,另一端用凡士林封闭固定于皮下,关闭切口后伤口局部肌肉注射青霉素预防感染。术后两组动物分别通过硅胶管定期注射许旺细胞源神经营养因子或生理盐水20μL,1次/周,3周后取材。④切取颈6,7脊髓节段,观察损伤侧脊髓前角运动神经元的存活率和形态学变化以及一氧化氮合酶的表达。主要观察指标:①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化。②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化。结果:实验选用20只大鼠,全部进入结果分析。①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化:颈6,7神经根性撕脱术后3周,生理盐水对照组损伤侧68.6%的运动神经元死亡,存活率31.4%,明显低于正常侧(P<0.01),且存活的神经元胞体严重萎缩;许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元的死亡率较生理盐水对照组减少35%(P<0.01),存活率为66.4%,且存活的神经元胞体代偿性增大,基本与正常侧相似(P>0.05)。②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化:正常情况下,脊髓中的一氧化氮合酶阳性神经元主要见于后角浅层,中央导水管周围、中间外侧柱和脊髓背根神经节中的内脏传入神经元,前角运动神经元不表达一氧化氮合酶。颈6,7神经根性撕脱术后3周,生理盐水对照组损伤侧脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达明显增多,而其正常侧和许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元均未见一氧化氮合酶表达增加。结论:脊神经根性撕脱可引起脊髓前角运动神经元的死亡和一氧化氮合酶表达,许旺细胞源神经营养因子则对受损的神经元有明显的保护作用和抑制一氧化氮合酶表达。提示许旺细胞源神经营养因子的神经元保护作用可能是通过改变神经元的一些细胞分子例如一氧化氮合酶而实现的。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的:观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法:实验于2005-07/12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠,体质量(250±20)g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组,对照组6只,仅进行至椎板切除,即行切口关闭,不损伤脊髓。损伤组18只,3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后,T10处椎板切开后,在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫,刺激无反应后,关闭切口。分别于伤后3,7,21d不同时间点取材,每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片,运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果:①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆,神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3,7,21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[(15.48±3.20),(12.59±2.03),(11.33±1.92),(7.31±1.54);(16.73±3.30),(11.15±2.85),(13.20±3.39),(6.00±1.50),(P<0.01)],术后3d时达高峰,随伤后时间的延长进行性减少。③损伤后3,7,21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[(10.63±2.90),(14.07±2.37),(9.35±3.50),(4.00±0.63),(P<0.01)],术后7d时达高峰,3d与21d比较差异无显著性意义。结论:脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加,提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

Exogenous administration of glial cell line-derived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injury

The aim of present study was to examine whether systemically delivered glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) was beneficial in reversing the spinal cord injury (SCI) in a spinal cord compression model. Rats were divided into three major groups: (1) sham operation (laminectomy only); (2) laminectomy+SCI+normal saline (1ml/kg, i.v.); (3) laminectomy+SCI+GDNF (50ng/kg, i.v.). Spinal cord injury was induced by compressing the spinal cord for 1min with an aneurysm clip calibrated to a closing pressure of 55g. GDNF or saline was administered immediately after SCI via the tail vein. Behavioral tests of motor function measured by maximal angle an animal could hold to the inclined plane were conducted at days 1-7 after SCI. The triphenyltetrazolium chloride staining and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling assay were also conducted after SCI to evaluate spinal cord infarction and apoptosis, respectively. Both GDNF and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the injured spinal cord were assayed by immunofluorescence. It was found that systemically delivered GDNF, but not vehicle solution, significantly attenuated the SCI-induced hind limb dysfunction and spinal cord infarction and apoptosis. Both GDNF and VEGF could be detected in the injury spinal cord after GDNF, but not vehicle solution, therapy. The results indicate that GDNF treatment may be beneficial in reversing hind limb dysfunction by reducing spinal cord infarction and apoptosis in a spinal cord compression model.     

电针对慢性期脊髓损伤大鼠功能恢复及神经营养因子表达的影响

摘要 目的:研究督脉电针对慢性期脊髓损伤大鼠功能康复及神经营养因子的表达的影响,探讨督脉经上不同穴位电针的作用是否存在差异。 方法:将32只雄性SD大鼠随机分为4组：假模组、模型对照组、头部督脉电针组（“百会、风府”）、背部督脉电针组(“大椎、命门”),每组8只。建立大鼠脊髓损伤模型,各治疗组于术后1周开始6周的电针治疗。采用BBB运动功能评分法评定大鼠后肢运动功能的恢复情况。术后7周处死大鼠,采用实时荧光定量PCR及Western-blot方法检测受损脊髓脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素-3（NT-3）mRNA和蛋白的表达。 结果:电针干预组BBB评分高于模型组（P<0.05),且背部督脉电针组评分明显高于头部督脉电针组(P<0.05)。电针治疗后大鼠脊髓BDNF及NT-3 mRNA和蛋白的表达与模型对照组比较均明显上调（均P<0.05）,且背部督脉电针组高于头部督脉电针组（P<0.05）。 结论:电针治疗能增强受损伤脊髓神经营养因子的表达和促进大鼠后肢运动功能的恢复,背部督脉电针组作用强于头部督脉电针组。     

许旺细胞基膜管与骨骼肌基膜管两种桥接体对大鼠脊髓损伤修复效果的比较

目的:比较许旺细胞基膜管与骨骼肌基膜管两种桥接体对脊髓损伤的修复效果。方法:实验于2005-08/2006-01在大连医科大学动物实验中心完成。①选取3月龄SD大鼠40只,随机数字表法分成4组:正常对照组、假手术组、许旺细胞基膜管移植组、骨骼肌基膜管移植组,10只/组。②许旺细胞基膜管移植组动物麻醉后,沿左上肢屈侧切开,取正中神经节段约1.0cm,经蒸馏水浸泡、液氮冷冻、生理盐水浸润再复温,挤出胞浆和崩解组织,修整成待移植的许旺细胞基膜管。骨骼肌基膜管移植组动物于左上肢三角肌取材后按类似过程制成待移植的骨骼肌基膜管。③除正常对照组外,其余各组均建立脊髓损伤模型。鼠尾呈痉挛性扑动,麻醉苏醒后左下肢完全瘫痪标志造模成功。④许旺细胞基膜管移植组将许旺细胞基膜管按走行方向植入脊髓切损处。骨骼肌基膜管移植组同法植入骨骼肌基膜管。假手术组、正常对照组不进行任何材料移植。观察动物存活情况、一般状态、伤口愈合、后肢溃疡情况及运动功能恢复等情况。⑤术后通过斜板试验观察大鼠左后肢负重功能恢复情况;并进行动物行为测试评分(满分7分,左后肢失去负重和行走功能为0分);测定皮层体感诱发电位;组织学观察和计算机图像分析半薄切片中轴突数目、直径以及石蜡切片中脊神经节细胞数。结果:40只大鼠全部进入结果分析。①移植术后一般情况:术后3周许旺细胞基膜管移植组、骨骼肌基膜管移植组左后肢有不同程度的运动功能恢复。术后8周动物全部存活,切口愈合较好。非正常对照组动物均发生胸腰段脊柱轻度侧弯畸形。②术后斜板试验结果:与正常对照组大鼠跌落时的木板倾斜度数比较,术后8周许旺细胞基膜管移植组、骨骼肌基膜管移植组大鼠跌落时的木板倾斜度数明显高于假手术组(t=2.378,P<0.05),但低于正常对照组(t=2.421,P<0.05)。③术后行为学测试结果:术后8周许旺细胞基膜管移植组、骨骼肌基膜管移植组行为评分与正常对照组基本相似(t=2.034,P>0.05),明显高于假手术组(t=3.647,P<0.01)。④术后皮层体感诱发电位检测结果:正常对照组可记录到潜伏期为(16.15±1.23)ms、波幅为(30.76±2.61)μV的皮层体感诱发电位波形。术后6周许旺细胞基膜管移植组潜伏期延长、波幅降低,但均优于骨骼肌基膜管移植组[(21.48±2.17),(26.72±1.83)ms;(23.74±2.02),(19.14±1.38)μV;P均<0.05];而假手术组未记录到相应皮层体感诱发电位波形。⑤术后大体及组织学观察结果:许旺细胞基膜管移植组其基膜管与脊髓交界处无明显瘢痕组织形成,移植物中再生轴索较多,辣根过氧化物酶示踪在宿主-移植物交界面头侧的正常脊髓前角内见较多标记神经元,再生轴突直径较粗,髓鞘较厚。骨骼肌基膜管移植组情况与其基本相似,但骨骼肌基膜管与脊髓交界处有少许瘢痕组织形成。⑥术后8周末轴突数目、轴突直径和脊神经节细胞数计算机图像分析结果:许旺细胞基膜管移植组的轴突数目、轴突直径和脊神经节细胞数目与正常对照组基本相似(t=2.116,P>0.05),但明显高于骨骼肌基膜管移植组、假手术组(t=2.494,P<0.05;t=3.573,P<0.01)。结论:许旺细胞基膜管比骨骼肌基膜管更适宜作为治疗脊髓损伤的桥接体材料。     

胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。