血吸虫DNA重复序列的研究进展

DNA重复序列在真核生物基因组中占有很大的比例 ,是真核生物基因组的重要特征和重要组成部分。根据它们在基因组中的分布 ,DNA重复序列主要被分为两类 :1成簇排列的重复序列 ,即串联重复序列 ,也称卫星 DNA,主要分 3类 ;第 1类 :微卫星 DNA序列 ,在基因组的间隔顺序和内含子等非编码区广泛存在 ,由 2 - 5 bp作核心单位 ,在多串联拷贝上重复而成。它存在于染色体任何部位 ,重复次数达 10- 60次 ,总序列长度从几十到几百 bp,一般不超过 3 0 0 bp;第 2类 :小卫星 DNA序列 ,由较长的重复片段 (约 15 bp)排列而成 ,序列大小高度可变 ,介于 …     

代表差异性分析方法分离日本血吸虫雌虫特异性序列

目的 分离日本备用血吸虫雌虫特异性系列,为研制抗生殖疫苗打下基础。方法 应用代表差异性分析方法利用雄虫基因扣除雌虫基因,从而获得雌虫特异性序列,约５６２ｂｐ。结果 以该序列为探针与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印的酶切后的雌、雄虫基因组ＤＮＡ及检测子和驱动子杂交,免疫学检测,显示只有检测子（ｔｅｓｔｅｒ）泳道有杂交区带,驱动子（ｄｉｖｅｒ）区带没有此带。结论 初步说明所获序列为雌虫特异性序列。     

日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的分离和EST序列测定

目的 运用表达标签技术（ＥＳＴ方法）,从ＳｊｃＤＮＡ文库中分离、鉴定血吸虫表达基因序列。方法 应用ＥＳＴ方法,人ＳｊｃＤＮＡ文库中随机挑出单个重组克陲 ＰＣＲ直接序列分析,通过互联网将获得的ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ进行同源性检素,并将发现的未知基因ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩｄｂＥＳＴ以获得ＧｅｎＢａｎｋ进入号。结果 分离了１００个ＳｊＧｅｎＢａｎｋ中已知的血吸虫基因序列,１９个为未知基因序     

日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白的基因克隆与序列分析

本研究根据曼氏血吸虫疫苗候选分子Sm23的基因序列，设计了一对引物，并通过聚合酶链反应（PCR）基因克隆技术，从日本血吸虫中国大陆株cDNA文库中克隆出了中国大陆株23kDa膜蛋白基因。DNA序列分析表明，编码日本血吸虫中国大陆株Sj23膜蛋白的基因含有657bp，与曼氏血吸虫Sm23的核着酸有79．5％的同源性，而与日本血吸虫菲律宾株的Sj23的同源性为100％。该研究为发展Sj23多肽疫苗奠定了基础。     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj 22.6kDa的核苷酸序列分析

目的：对ｐＧＳｊ２４克隆化基因进行核苷酸序列分析，了解其编码蛋白的属性。方法：常规制备ｐＧＳｊ２４克隆化基因并重组入测序载体Ｍ１３ｍｐ１９，以ＤＹＥＰＲＩＭＥＲ荧光测序试剂盒进行核苷酸序列测定。分别以ＤＮＡＳＩＳ和ＧＯＬＤＫＥＹ软件对序列资料进行分析。结果：ｐＧＳｊ２４克隆化基因长８４０ｂｐ，含一开放阅读框，可编码一分子量为２２．６ｋＤａ的蛋白质。开读框上游和下游均有终止密码子。该基因与已发表的日本血吸虫２２．６ｋＤａ蛋白的编码基因同源性达９５％，编码区同源性达９９．７％。在该基因内有一段典型的ＥＦ－Ｈａｎｄ钙结合区序列，并有内质网导肽、微体导向信号等功能位点。预测该蛋白质内可能的抗原决定簇位置为第２９－３２、６３－６８和８７－１０１等氨基酸片段。结论：ｐＧＳｊ２４克隆化基因为日本血吸虫２２．６ｋＤａ抗原编码基因。     

日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的克隆

目的比较日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的差异。方法提取东方田鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠和KM鼠肝脏DNA,根据东方田鼠特异性DNA序列片段(GenBank登录号:AF277394)设计引物,PCR方法扩增以上4种鼠的基因组特异性DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定特异条带,纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体,进行DNA序列分析。结果 PCR扩增东方田鼠、SD大鼠DNA分别得到520bp左右的特异扩增片段,同源性为99%。C57BL/6小鼠和KM鼠没有扩增出此特异片段。结论日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠之间特异性DNA序列有高度的同源性。     

日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 3kDa膜蛋白 (SjC2 3)DNA疫苗诱导C5 7BL/6小鼠免疫保护作用。方法　将全长的SjC2 3基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建DNA疫苗 pcDNA3.1 SjC2 3。制备SjC2 3及IL 12的两个亚单位 p35、p4 0的DNA疫苗和对照 pcDNA3.1。 4 8只C5 7BL/6小鼠随机分为A、B、C 3组。A组小鼠肌注 10 0 μgpcDNA3.1;B组注射 10 0 μg pcDNA3.1 SjC2 3;C组肌注 pcDNA3.1 SjC2 3、pcDNA3.1 p35及pcDNA3.1 p4 0各 10 0 μg的混合物。每隔 2周各免疫 1次 ,共 3次。第 8周每鼠感染 4 5± 2条 /只尾蚴 ,4 5d后剖杀 ,计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测SjC2 3及 p35、p4 0在小鼠局部组织内的表达 ;用脾细胞培养法检测经rSjC2 3 HD刺激后 ,攻击前、后小鼠脾细胞IL 2、IL 4、IL 10和IFN γ的水平。用Westernblotting检测血清中抗SjC2 3抗体。结果　SjC2 3以及p35、p4 0在免疫小鼠股四头肌细胞膜和细胞浆均获得表达。IL 2和IFN γ的水平攻击前、后在B组和C组均明显升高。Westernblotting检测抗SjC2 3抗体结果表明 ,免疫后两周 ,B组 8/10份血清为阳性 ,C组 9/10份血清阳性。B组和C组分别获得 2 6 .9%和 35 .4 %的减虫率 ,C组显著高于B组 (P <0 .0 5 ) ;减卵率分别为 2 2 .2 %和 2 8.4 %。结论　SjC     

日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.     

日本血吸虫中国大陆株安徽品系特异rDNA的制备及其基因克隆

目的为了制备能检测日本血吸虫种内多态性的ｒＤＮＡ探针,以用于不同地域日本血吸虫品系间差异的研究。方法根据曼氏血吸虫大、小亚基的基因序列,设计引物,ＰＣＲ扩增得到４．４ｋｂ的日本血吸虫中国大陆株安徽品系的ｒＤＮＡ片段,经纯化后克隆入ｐＵＣ１８质粒。结果得到了２个转化成功的含日本血吸虫中国大陆株ｒＤＮＡ基因的重组质粒的ＪＭ１０３菌落。结论我们采用的方法,使获取目的基因片段的手段更为简单、方便。     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因克隆

目的 :克隆日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因。方法 :用 PCR方法根据已发表日本血吸虫菲律宾株副肌球蛋白基因部分核苷酸序列扩增大陆株副肌球蛋白基因。结果 :获得一日本血吸虫大陆株 72 0 bp基因克隆。结论 :经核苷酸序列分析证实 ,本克隆基因与菲律宾株基因核苷酸同源性为 99.0 3%。     

日本血吸虫(中国大陆株)虫卵cDNA文库的构建

应用定向克隆方法，将日本血吸虫虫卵ｃＤＮＡ片段重组入噬菌体载体λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ的ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切位点之间。所构建的基因表达文库的容量为１．０７×１０７重组子。经含有ＩＰＴＧ及Ｘ－Ｇａｌ的颜色选择平皿测定，初步提示重组效率达１００％。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫（中国大陆株）22.6kDa重组抗原的免疫原性研究

用日本血吸虫（中国大陆株）22．6kDa重组抗原（rSj22．6）免疫一批昆明小鼠，获得特异性免疫血清，其与22．6kDa重组抗原和日本血吸虫成虫抗原作免疫印迹试验（Westernblot），结果显示可特异地识别重组抗原和成虫抗原中22．6kDa分子，而正常鼠血清则不能识别。实验中，血清经去除抗大肠杆菌抗体的处理后，其与大肠杆菌的非特异性反应条带被去除，特异性反应的条带则增强。     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶在大肠杆菌的温控高效表达及鉴定

以重组质粒pSj26为模板，PCR扩增出编码26kDa谷胱甘肽S-转移酶（Sj26GST）的cDNA，双酶切后克隆到pBV220DNA，构建pBV220-Sj26温控表达载体，CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化子，酶切图谱分析及PCR鉴定阳性克隆。阳性克隆菌在30℃培养，42℃温控表达Sj26。测定表达产物GST活性，并用rSj26抗原免疫的鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清进行Dot－ELISA和Westernblot检测其抗原性。实验结果表明PBV220－Sj26温控表达产物具有GST酶活性。SDS－PAGE经考马斯亮蓝染色可见染色较深的26kDa条带，该条带占菌体总蛋白的33．83％。抗rSj26的免疫鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清均可识别26kDa条带。实验结果表明日本血吸虫26kDa条带能在大肠杆菌温控高效表达。     

裸露DNA疫苗pCDSj32的构建、鉴定及在小鼠骨骼肌细胞的表达

应用基因工程技术，对本室已经克隆的日本血吸虫成虫３２ｋＤａ蛋白分子的ｃＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增，扩增产物亚克隆入高效真核表达载体ｐＣＤ，构建成功裸露ＤＮＡ疫苗ｐＣＤＳｊ３２。ｐＣＤＳｊ３２在ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌细胞得到表达。表达产物可被小鼠抗３２ｋＤａ蛋白分子单抗识别。免疫荧光定位显示，表达产物不但存在于细胞浆，而且可结合于胞膜并被分泌至胞外。     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原编码基因在C2C12细胞内的表达

目的为探索日本血吸虫（中国大陆株）22．6kDa抗原（Sj22．6）编码基因用作核酸疫苗的可行性。方法以PCR法对此编码基因改造后将其亚克隆入真核表达载体质粒PCMV－β并转化入大肠杆菌JM109进行大量扩增。将提纯的PCMV／Sj22．6基因重组质粒在体外转化C2C12真核细胞。结果免疫组化试验证明，该重组质粒能够在体外培养的C2C12细胞中表达Sj22.6抗原。结论表明该重组质粒有用作真核疫苗的可能性。