人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及其调控因子的影响

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６／Ｅ７基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子ｐ５３,ｐＲｂ的影响。方法 Ｌｏｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ介导法进行 染,筛选阳性克隆,免疫荧光染色检测ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染细胞内的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化,免疫印迹分析ｐ５３,ｐＲｂ表达情况。结果 免疫荧光染色检测见转染细胞内有ＨＰＶＥ６／Ｅ７表达,汉式细胞仪显示转染细胞Ｇ１期细胞为４９．２％比正常     

血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子对血管平滑肌和心肌细胞细胞周 …

目的 观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）和血小板源生长因子ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）对血管平滑肌细胞和心肌细胞中细胞周期素和Ｐ２７蛋白表达量的不同影响,方法 培养的血管平滑肌细胞或乳鼠心肌细胞,加入ＡｎｇⅡ１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ,ＰＤＧＦ－ＢＢ２０ｎｇ／ｍｌ后２４小时收集细胞,用碘化丙啶（ＰＩ）标记细胞ＤＮＡ,以确定细胞所处的周期,用细胞周期素（ＣｙｃｌｉｎＤ,ＣｙｃｌｉｎＥ,ＣｙｃｌｉｎＡ）或Ｐ２７蛋白的单     

人乳头瘤病毒16型E6基因表达产物单克隆抗体的制备研究

将含有人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ_（１６））Ｅ_６基因的重组质粒ＰＡＳ１－ＨＰＶ_（１６）Ｅ_６转染大肠杆菌ＡＲ１２０，在萘啶酮酸诱导下进行表达，表达产物经分离、纯化和鉴定获得一种分子量为１９０００的Ｅ_６表达蛋白。用纯化后的Ｅ６蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４在ＰＥＧ_（４０００）作用下进行融合，经ＨＡＴ培养基筛选杂交瘤细胞株，甲基纤维素半固体培养基克隆，克隆筛选，ＥＬＩＳＡ检测和再克隆，得到一株持续稳定分泌抗ＨＰＶ_（１６）Ｅ_６蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤株ＲＡＣ_６。     

角质形成细胞转染人乳头瘤病毒后c-jun、c-fos及MDM2基因的表达

目的 研究正常角质形成细胞转染人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６后，c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ表达情况。方法 在无血清的Ｍ１５４培养基上培养角质形成细胞，适当时进行传代培养。采用转染试剂ＦuＧＥＮＥ∧ＴＭ６将质粒pＳＶ２－neo/ＨＰＶ１６转入正常角质形成细胞，应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测转染后角质形成细胞中c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ表达。结果 转染质粒pＳＶ２－neo/ＨＰＶ１６后角质形成细胞形态的所改变，细胞变大，胞核结构疏松，胞浆出现颗粒。转染细胞株中，检测到ＨＰＶ１６mＲＮＡ的表达，扩增产物为１１０bp；同时检测到ＨＰＶ１６ＤＮＡ片断（７．９kb）。转染后角质形成细胞中有c－jun、c－fos、ＭＤＭ２mＲＮＡ的表达。结论 体外试验提示ＨＰＶ感染可能通过c－jun、c－fos、ＭＤＭ２的表达而促进细胞的增生。     

HPV16L1—E7重组腺病毒rAd5HPV16L1—E7的构建及克隆表达

目的：研制人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１－Ｅ７重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以ＨＰＶ１６型－１１４／Ｋ为模板,利用ＰＣＲ克隆技术构建可表达ＨＰＶ１６主要宙蛋白Ｌ１（１－３０１ａａ）和转蛋白Ｅ７（１－６０ａａ）融合基因的重组质粒ｐＵＣ１９Ｌ１－ｐＨＢＧ１０共转染２９３细胞,制备重组腺病毒ｒＡｄ５ＨＰＶ１５６Ｌ１－Ｅ７,密度梯度超速离心纯楷ＨＰＶ     

半枝莲碱Ａ对ＥＢ病毒阳性弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的　探讨半枝莲碱Ａ对ＥＢ 病毒阳性弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤（ＥＢ ｖｉｒｕｓ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ-ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ,ＥＢＶ＋ＤＬＢＣＬ）细胞株Ｆａｒａｇｅ细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法　将Ｆａｒａｇｅ细胞分为对照组和不同浓度半枝莲碱Ａ 处理组,采用ＣＣＫ ８法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,ＲＴ-ｑＰＣＲ法检测半枝莲碱Ａ作用于Ｆａｒａｇｅ细胞后细胞周期蛋白Ｄ３（ｃｙｃｌｉｎＤ３）的ｍＲＮＡ 表达以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ｃｙｃｌｉｎＤ３蛋白表达。结果　ＣＣＫ ８结果显示,与对照组相比,半枝莲碱Ａ能够明显抑制Ｆａｒａｇｅ细胞增殖,差异有统计学意义（P＜０．０５）。流式细胞检测结果显示,半枝莲碱Ａ 诱导细胞凋亡呈剂量依赖性,且主要使细胞阻滞于Ｇ０／Ｇ１ 期。ＲＴ-ｑＰＣＲ 和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示,半枝莲碱Ａ 以剂量依赖形式使Ｆａｒａｇｅ细胞ｃｙｃｌｉｎＤ３的ｍＲＮＡ 和蛋白表达减少,差异具有统计学意义（P均＜０．０５）。结论　半枝莲碱Ａ 具有抑制Ｆａｒａｇｅ细胞增殖并诱导其凋亡的作用,可使细胞阻滞于Ｇ０／Ｇ１期,并可能通过下调ｃｙｃｌｉｎＤ３表达发挥抗肿瘤作用。     

视黄酸及芳维甲对HL-60细胞细胞周期素及相关激酶P34~(cdk2)蛋白表达的影响

目的：本研究从细胞周期调控这一角度来探讨视黄酸类物质阻遏白血病细胞增殖的分子机理。方法：采用两步过量胸苷阻断法将ＨＬ－６０细胞同步化于Ｇ１／Ｓ期边缘，５×１０－６ｍｏｌ／Ｌ视黄酸或芳维甲处理１ｄ～４ｄ后收获细胞，以流式细胞仪（ＦＣＭ）分析细胞周期相分布，免疫印迹法检测ＣｙｃｌｉｎＥ、ＣｙｃｌｉｎＤ１和Ｐ３４ｃｄｋ２蛋白表达水平。结果：ＣｙｃｌｉｎＥ和Ｄ１蛋白表达量具有周期依赖性，Ｇ１期开始增加，Ｓ期达到高峰，Ｇ２期逐渐下降，而Ｐ３４ｃｄｋ２蛋白表达量在整个细胞周期中无明显变化；视黄酸或芳维甲处理后，大部分细胞被阻断在Ｇ０／Ｇ１期，Ｐ３４ｃｄｋ２蛋白表达量变化不明显，而ＣｙｃｌｉｎＥ和Ｄ１蛋白表达量明显下降。结论：视黄酸或芳维甲诱导的ＣｙｃｌｉｎＥ和ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白表达的降低，可能与视黄酸类物质干扰细胞Ｇ１→Ｓ期转换、阻遏ＨＬ－６０细胞增殖并诱导其分化有关。     

DIG—DNA探针检测宫颈癌组织中HPV—16的E7转化基因

应用地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ标记人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因作探针，分别检测了宫颈癌活检组织、宫颈炎及正常宫颈脱落细胞ＮＤＡ。其检率为：宫颈癌中４２．１％（２４／５７）、宫颈为中２．５％（１／３９）、正常宫颈中５．５％（１／１８）。宫颈组织中ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因的检出率较高，提示该转化基因与宫颈癌的发生可能密切相关。本研究也证实ＤＩＧ配基标记的Ｅ７基因探针具有特异、     

反义寡核苷酸对HPV16阳性人宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨反义硫代寡核苷酸对ＨＰＶ１６阳性的人宫颈癌细胞增殖的影响，方法：人工合三段１８－ｍｅｒ的反义硫代寡核苷酸Ｓ－ＯＤＮ１－３，其中Ｓ－ＯＤＮ１（ＡＥ６），Ｓ－ＯＤＮ２（ＡＥ７）分别与ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因的起始码及其下游序列互补Ｓ－ＯＤＮ，为一随机序列，分别用三种反义寡核苷酸处理整合有ＨＰＶ１６基因组的人宫颈癌细胞ＳｉＨａ。通过四唑盐比色法，＾３Ｈ－ＴｄＲ参入试验观察不同浓度反义寡核苷酸对Ｓ     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

Increased expression of 70 kD heat shock protein in cultured primary human keratinocytes induced by human papillomavirus 16 E6/E7 gene

Background Heat shock protein 70 （HSP70） is expressed highly in epithelial tumours associated closely with human papillomavirus 16 （HPV16） infections. However, evidence about the direct relationship between HSP70 expression and HPVs infections are still lacking. In the present study, we examined the expression of HSP70 in keratinocytes introduced with HPV16 E6/E7 oncogenes. Methods Stable transfected cells were established by transfection of the plasmids pLXSN16E6/E7 into cultured primary keratinocytes and subsequently selected by plasmid specific selection antibiotic （G418） at the required concentration. The expression of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes was determined by Western blot. The correlation of HSP70 expression and E6/E7 transfeetion was further confirmed by doubly labelled immunofluorescent staining. Results Compared to non-transfected keratinocytes, there was a significant trend for higher levels of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes. Doubly labelled immunofluorescent staining experiment showed that the co-localization of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfeeted keratinoeytes was observed and increased expression of HSP70 was strongly associated with the transfection of HPV16 E6/E7. Conclusions Our studies demonstrated increased levels of HSP70 proteins in keratinocytes stably transfected by HPV16 E6/E7 oncogenes. It suggests that the expression of HSP70 is modulated by HPV16 E6/E7 proteins, which may be involved in HPV16 E6/E7 induced immortalization.     

人喉鳞癌组织中HPV16E7、CyclinD1和Rb蛋白的表达

目的:探讨喉鳞癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16型E7、CyclinD1和Rb蛋白表达的变化.方法:采用免疫组织化学SABC法检测80例喉鳞癌、30例声带息肉组织中HPV16E7、CyclinD1和Rb蛋白的表达状况.结果:声带息肉组织中HPV16E7未见表达,喉鳞癌组织中的表达率为34/80(P＜0.000 1);声带息肉与喉鳞癌组织中Cy-clinD1的表达率分别为2/30和42/80(P＜0.000 1),Rb的表达率分别为25/30和42/80(P＜0.05).HPV16E7与CyclinD1的表达与临床分期、淋巴结转移情况和5 a生存率有关(P＜0.05或0.01).喉鳞癌组织中HPV16E7与Rb的表达相关(P＜0.01).结论:HPV16感染和Rb、CyclinD1的异常表达与喉鳞癌发生、发展有关.HPV16E7与CyclinD1可作为判定喉鳞癌预后的指标.     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒（HPV）16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E（Cyclin E）表达的影响,探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达,对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈CIN2+病变筛查中的应用价值

目的探讨高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV) E6/E7 mRNA在子宫颈上皮内瘤变中度及以上(CIN2+级)病变筛查中的临床应用价值。方法选取2016年6月至2017年6月在北京市垂杨柳医院因接触性阴道出血或疑似宫颈病变妇科门诊就诊的患者307例,均行液基薄层细胞检查(TCT)、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的检测,并行阴道镜检查及活检。以病理结果为金标准,将病检结果为高级别鳞状上皮内病变(HSIL,包括CIN2和CIN3)或宫颈鳞癌或宫颈腺癌的71例患者作为观察组,记为CIN2+;将病检结果正常和低级别鳞状上皮内病变(LSIL,包括CIN1)的236例患者作为对照组,记为CIN2-。分析TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA的灵敏度和特异度差异。结果 HPV E6/E7mRNA及HPV DNA对CIN2+诊断的特异度分别为79. 66%及19. 49%,差异有统计学意义(P <0. 05)。HPV E6/E7mRNA联合TCT及HPV DNA联合TCT检测对CIN2+诊断的特异度分别为82. 63%及35. 17%,差异有统计学意义(P <0. 05)。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA在筛查CIN2+的ROC曲线下面积分别为0. 8420和0. 5693,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 HPV E6/E7 mRNA较HPV DNA检测筛查宫颈CIN2+的病变效果更好,HPVE6/E-7mRNA联合TCT检测能够提高对CIN2+的病变筛查的特异性。     

HPV E6/E7、宫颈液基细胞学、阴道镜联合检查在宫颈癌筛查中的价值分析

目的 探究高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）E6/E7、宫颈液基细胞学（thinprep cytologic test,TCT）、阴道镜检查对宫颈癌及癌前病变筛查价值的差异。方法 选取2020年7月至2021年7月义乌市中心医院收治的均进行过HPV E6/E7 m RNA、TCT及阴道镜检查的宫颈异常患者753例,以活检组织病理结果为金标准,分析不同检查方法对宫颈癌及癌前病变的筛查价值。结果 活检组织病理学检测结果显示,753例病例中有低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL）532例,高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL）203例,鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）18例;HPV E6/E7检出阳性407例,TCT检出阳性288例,阴道镜检查阳性206例;HPV E6/E7、TCT检查的诊断一致性为62.42%;与联合检测比较,HPV E6/E7、TCT及阴道镜...     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。