RNA干扰技术的设计原则研究进展

RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术是近年发展起来的一项新技术，与内源mRNA同源的小片段外源双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)导入细胞，导致特定基因表达沉默，其中约21～23bp的小干扰RNA（short interference RNA, siRNA）是RNAi的重要效应分子。RNA干扰技术的应用关键在于siRNA的合理设计和有效转运系统。本文主要叙述了siRNA的设计原则。     

RNA干扰技术中siRNA设计原则的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年发展起来的一项新技术,与内源mRNA同源的小片段外源双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)导入细胞,导致特定基因表达沉默,其中约2l～23 nt的小干扰RNA(short interference RNA,siRNA)是RNAi的重要效应分子。RNA干扰技术的应用关键在于siRNA的合理设计和有效转运系统。该文主要叙述了siRNA的设计原则。     

RNA 干扰研究的新进展

RNA干扰技术(RNA interference, RNAi) 诞生5年来,无论在技术本身的改进上还是应用上都有了很大的发展,尤其是siRNA的产生和引入方法有了一系列的改进,使siRNA的长期稳定表达成为可能.RNAi的生殖细胞传递现象的发现,进一步拓宽了RNAi的应用潜力.然而,除了对靶基因的沉默效应外,引入的siRNA还可以导致siRNA序列特异性、而非靶基因特异性的基因沉默现象(off-target效应).这就提示,在注释特定siRNA产生的沉默效应时要特别注意,尤其是将siRNA用于疾病治疗时.     

siRNA在自身免疫病治疗中的研究进展

小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰(RNAi)的主要介导者,其通过双链RNA(dsRNA)使同源基因沉默,是以核酸为基础最广泛使用于治疗疾病的基因沉默技术。现今,siRNA已被应用于诸多研究领域,在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等自身免疫病中的研究也日益增多。本文对siRNA的发现、siRNA介导的基因沉默机制以及siRNA在自身免疫性疾病治疗中的应用进行综述。     

siRNA设计研究进展及在线设计

研究基因功能的方法之一是减少或消除其在细胞中的表达.RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 技术可以研究一个单独基因的作用, 其效应因子为小干扰RNA(small interfering RNAs, siRNA)分子[1].     

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。     

siRNA活性与mRNA二级结构关系的研究

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA起作用,特殊设计的siRNA能使靶基因发生特异性沉默,确定基因功能或沉默致病基因从而治疗疾病。在RNAi技术的应用中,通常采用的是19bp长度,正、反义链3′端各有2个不配对核苷酸的双链RNA(siRNA)。而合成siRNA模板的选择,即靶mRNA作用位点的选择对RNAi的作用效果的影响相当大,原因之一是因单链的mRNA存在二级结构。本研究试图从具体的实验结果出发,研究靶mRNA二级结构对siRNA活性的影响。     

RNA干扰机制的分子生物学研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种有效的基因沉默过程。其主要机制是指双链RNA（dsRNA）在RNase Ⅲ作用下形成小干扰RNA（siRNA）,进而与相应蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC）,介导靶mRNA降解。此外,RNAi还可作用于转录水平和翻译水平。本文介绍了RNAi的发现及可能分子机制。     

利用不同方法检测RNAi抑制人pescadillo基因的表达

目的:构建人pescadillo(PES1)基因siRNA的真核表达载体,观察其对PES1表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对PES1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。分别用以下3种方法检测RNAi的抑制效果:(1)将RNAi重组质粒和带FLAG标签的PES1共转染293T人胚肾细胞,用FLAG抗体进行Western blot;(2)将RNAi重组质粒和带GFP标签的PES1共转染293T细胞,用荧光显微镜观察GFP的亮度;(3)在293T细胞中仅转染小干扰RNA(siRNA)重组质粒,用PES1抗体进行Western blot分析。结果:测序证明,成功构建了PES1siRNA真核表达载体。通过Western blot实验证明,构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性PES1基因表达;荧光显微镜检查发现siRNA能明显减弱细胞中荧光强度,抑制PES1的表达。结论:成功地构建了PES1siRNA的真核表达载体,利用3种不同方法均证明该siRNA能有效地抑制PES1基因的表达。     

RNA干扰技术在生物医学领域中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默过程。在这一过程中,dsRNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA(siRNA),siRNA与相关的蛋白结合成RNA诱导沉默复合体,这一复合体可识别并降解mRNA,导致基因沉默。它是一种比反义寡聚核苷酸技术更为有效的方法,具有更高的特异性,在生物医学领域有广阔的应用前景。文章就RNAi技术在功能基因组学、基因治疗(如人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、肿瘤)、神经性疾病及其药物设计等领域的实验及其应用研究及存在问题作一综述。     

RNA interference as a new strategy against viral hepatitis

Hepatitis viruses are the leading cause of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma worldwide. Since currently available treatment options against these viruses are limited, there is a need for development of alternative therapies. In this minireview, we concentrate on three hepatitis viruses--hepatitis C virus, hepatitis B virus, and hepatitis delta virus and discuss how RNA interference (RNAi) has been utilized against them. RNAi is a process by which small double-stranded RNA can effectively target a homologous RNA sequence for degradation by cellular ribonucleases. Though RNAi was exploited in the beginning for down-regulating cellular genes, it has recently been demonstrated that this process is equally effective against many types of human and animal viruses including the hepatitis viruses. Both synthetic small-interfering RNAs (siRNAs) and plasmid-based siRNA expression systems have been useful in suppressing the hepatitis viruses. Though this new approach looks promising, problems of nonspecific effects and delivery may need to be addressed before the full therapeutic potential of RNAi against viral infections in patients is realized.     

Interfering with hepatitis C virus RNA replication

The emergence of RNA interference (RNAi) as a powerful tool for silencing gene expression has spurred considerable interest in its experimental and therapeutic potential. RNAi is a cellular process of gene silencing in which small duplexes of RNA specifically target a homologous sequence for cleavage by cellular ribonucleases. The introduction of 21-23 nucleotide RNA duplexes, termed small interfering RNAs (siRNAs), into mammalian cells can specifically degrade homologous mRNAs. RNAi efficiently silences the expression of both cellular and viral RNAs. A number of groups have demonstrated that siRNAs interfere with hepatitis C virus (HCV) gene expression and replication. Additionally, cellular genes are efficiently silenced in the presence of replicating HCV. These studies lay the foundation for using RNAi as an experimental tool for studying HCV replication and defining host genes that are significant for viral replication. The potential for RNAi as an antiviral therapy remains less clear, as it will face many of the challenges that have hindered nucleic acid therapies in the past.     

Comparisons of RNAi approaches for validation of human RNA helicase A as an essential factor in hepatitis C virus replication

A major issue of current virology concerns the characterization of cellular proteins that operate as functional components of the viral multiplication process. RNAi is a powerful tool to elucidate gene functions. In this study three RNAi approaches (transient transfection, stable transduction and inducible RNAi) were assessed to validate human RNA helicase A (RHA) as an essential factor in hepatitis C virus (HCV) replication. It indicated that RHA transient knockdown by synthetic siRNA had no effect on HCV replication, while RHA stable knockdown via lentivector transduction caused cell lethality. The involvement of RHA in HCV replication was verified by an RNAi inducible system that, on the one hand, maintained long-term gene silencing, but on the other hand, alleviated siRNA toxicity during the essential gene silencing. A 21-day follow-up of the response of HCV replication to the presence and absence of RNAi indicated that RHA is a cellular factor involved in the HCV replication process.     

转录后水平的基因沉默--RNA干涉

RNA干涉（RNAinterference,RNAi)是1998年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默（PTGS）机制，它利用双链RNA（dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA，从而特异性地阻断相应基因的表达，广泛存在于从真菌到植物。从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中，本文介绍了基因沉默的机理，RNA干涉的分子机制及技术应用等方面的进展。RNA干涉在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中将具有广阔的发展前景。     

siRNA体内递送策略研究进展

RNAi是由小双链RNAs触发的序列特异性转录后基因沉默,RNAi具有锁定任何引起疾病或疾病相关蛋白表达的能力,有巨大的治疗应用前景。但以治疗为目的的siRNA特异、有效的递送仍是RNAi广泛治疗应用的主要障碍。本文就目前siRNA体内递送取得的研究进展进行综述,以有助于RNAi技术安全、有效的临床应用。     

siRNA抑制胃癌细胞BGC-823及裸鼠皮下移植瘤中生存素的表达

目的： 探讨RNA干扰用于胃癌治疗的可行性与特异性。方法: 设计靶向生存素基因的小干扰RNA,并导入胃癌BGC-823细胞株和裸鼠皮下移植瘤,在体内、外诱导RNA干扰,采用MTT、流式细胞检测技术、RT-PCR法、Western bloting、免疫组织化学和TUNEL检测survivin基因表达、细胞周期和细胞凋亡。结果: 重组质粒pTZU6+1-siRNA- survivin导入BGC-823后,survivin mRNA和蛋白表达均明显下调;细胞生长被抑制,细胞周期中S期细胞减少, G1/G0期细胞增加,出现明显细胞凋亡。裸鼠皮下移植瘤体积明显缩小,Survivin表达均下调。体内、外对照组各指标均无明显变化。 结论: RNA干扰明显抑制靶基因survivin在胃癌细胞BGC-823及裸鼠皮下移植瘤中的表达及肿瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡,且特异性好,可能成为肿瘤治疗的新方法。     

小干扰RNA与壳聚糖复合纳米粒制备及基因沉默性能研究

小干扰RNA引发的RNA干扰过程在沉默靶基因表达方面表现出高特异性和高效性,有望成为癌症和流感、肝炎等病毒感染疾病治疗的有效药物,但缺少安全高效的载体系统是其发挥强大功能的主要障碍。本研究以天然阳离子壳聚糖为载体材料,利用聚电解质静电作用,直接复合沉默绿色荧光蛋白的siRNA(siRNA-eGFP),制备出siRNA复合率83%~94%、尺寸90~180 nm、Zeta电位10~30 mV的稳定纳米粒,细胞活性保持率达80%,绿色荧光蛋白基因沉默效率近80%。