串联siRNA对SW480细胞中增殖诱导配体基因表达的影响

目的分析串联siRNA在SW480细胞中对增殖诱导配体(APRIL)基因的作用效果,探讨串联siRNA对APRIL基因表达的应用价值。方法设计筛选4条针对于APRIL基因的shRNA片段(即sh644、sh1938、sh1451、sh2231),分别将其与pGenesil-1.1质粒表达载体连接,形成4个单一表达载体(pGsh644、pGsh1938、pGsh1451、pGsh2231),同时将4条shRNA与pGenesil4-T质粒连接,共同构成pG4串联siRNA表达载体。应用阳离子脂质体法对结直肠癌细胞株SW480进行转染。采用实时荧光定量PCR以及Western blot法对SW480细胞的APRIL mRNA和蛋白表达进行检测。结果酶切及测序证实串联siRNA质粒载体构建成功。siRNA能够抑制SW480细胞APRIL基因表达,pG4组APRIL mRNA抑制率为77.72%,蛋白质表达抑制率为84.74%,显著高于其他质粒,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论串联siRNA表达载体能够抑制结直肠癌SW480细胞株的APRIL基因表达,为结直肠癌APRIL基因治疗提供基础。     

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2／EOLA1,并转染人ECV304细胞株,G418压力筛选获得稳定表达株;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸,插入pSlincer3．1／H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westem blot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

环氧合酶2基因沉默诱导人肝癌细胞凋亡的作用观察

目的 观察作用于环氧合酶2(COX-2)mRNA的发卡状COX-2(COX-2 shRNA)真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建COX-2 shRNA表达载体,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染体外培养的HepG2细胞.半定量RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,筛选有效抑制COX-2基因表达的序列.采用CCK-8细胞计数法检测COX-2 shRNA对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测细胞内COX-2和Bcl-2蛋白表达水平.结果 测序结果显示成功构建了2个表达COX-2shRNA的质粒载体,转染HepG2细胞后COX-2 mRNA表达下降至阴性对照组的41.66％和77.79％.选择沉默效率较佳者转染细胞并经G418筛选,获得稳定表达COX-2 shRNA的细胞,胞内COX-2 mRNA表达水平下降了75.30％,细胞增殖活性下降了 29.33％.在稳定表达COX-2 shRNA、错义序列以及未转染的细胞中,细胞凋亡率分别为17.83％、4.63％和4.47％,G0/G1期细胞比例分别为73.93％、61.2％和57.630％,而S期细胞比例分别为13.43％、26.03％和26.90％.Westernblotting检测显示,表达COX-2 shRNA的HepG2细胞内COX-2蛋白水平下降至表达错义序列组的31.25％(P＜0.01),Bcl-2蛋白水平下降至表达错义序列组的54.93％(P＜0.01),而转染错义质粒组与未转染组之间比较差异无统计学意义.结论 构建的真核表达载体pSilencer 2.1-U6-COX-2 shRNA能有效沉默人肝癌HepG2细胞内COX-2基因的表达,并具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞、降低胞内抗凋亡蛋白(H)Bcl-2水平的作用.     

siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.     

JTV1对K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的观察上调JTV1基因的表达对人白血病K562细胞系增殖与凋亡的影响并探讨其机制。方法将携带有JTV1基因的pcDNA3.1-JTV1载体转染人K562细胞作为阳性转染组,转染pcDNA3.1空载体作为空载体转染组,未转染的K562细胞为未转染组。通过集落形成实验检测各组K562细胞的增殖能力,采用流式细胞术与Annexin-PI双染色结合分析细胞周期和细胞凋亡率,同时采用RT-PCR法检测JTV1基因及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc mRNA水平的变化,采用Western blotting检测基因JTV1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、C-myc蛋白水平的变化。结果集落形成实验结果显示上调JTV1基因表达后K562细胞的增殖能力明显降低。流式细胞术与Annexin-PI双染色检测结果显示,与空载体转染组及未转染组相比,阳性转染组K562细胞的G期细胞比例明显升高(P<0.05);阳性转染组中Bax基因的mRNA水平和蛋白水平较空载体转染组及未转染组均明显上升,而Bcl-2基因和C-myc基因的mRNA水平和蛋白水平则明显下调(P<0.05)。结论 JTV1基因过表达可能通过抑制基因Bcl-2和C-myc的表达增强基因Bax的表达,从而抑制K562细胞系的增殖并促进其凋亡。     

共转染沉默5-LOX/COX-2基因对胃癌细胞SGC-7901生长的影响

目的 观察沉默环氧合酶2(COX-2)基因和5-脂氧合酶(5-LOX)基因对胃癌细胞SGC-7901生长的影响.方法 分别构建5-LOX/COX-2基因的靶向短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,共同转染胃癌细胞SGC-7901.将细胞分为空白对照组、空质粒组、单独转染组(P-sh5-LOX或P-shCOX-2)及共同转染组(P-sh5-LOX+P-shCOX-2).分别采用RT-PCR及Western blotting检测COX-2/5-LOX的mRNA及蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 与空白对照组及空质粒组比较,5-LOX和COX-2基因单独转染组及共同转染组的mRNA和蛋白表达量均受到显著抑制(P＜0.05).P-sh5-LOX组(27.38％±0.64％)、P-shCOX-2组(29.05％±0.61％)及共同转染组(50.23％±1.73％)细胞增殖抑制率均显著高于空质粒组(3.78％±0.39％,P＜0.05),共同转染组细胞增殖抑制率显著高于单独转染组(p＜0.05).P-sh5-LOX组、P-shCOX-2组及共同转染组的细胞凋亡率(分别为15.31％±1.53％、16.69％±1.28％、27.27％±1.18％)均显著高于空质粒组(0.99％±0.46％,P＜0.05),且共同转染组显著高于单独转染组(P＜0.05).结论 同时沉默胃癌细胞SGC-7901的5-LOX及COX-2基因,可显著抑制胃癌细胞增殖,促进其凋亡,其效果优于单独沉默其中一个基因.     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

RNA干扰抑制胆囊癌血管内皮细胞生长因子的实验研究

目的：构建编码胆囊癌VEGF基因的短发夹状RNA（shRNA）,观察shRNA干扰对胆囊癌血管内皮细胞表达的影响。方法：根据人VEGF基因的序列选择了4个位点设计shRNA,制备VEGF-shRNA质粒表达载体,并进行测序分析。将重组质粒转染到胆囊癌细胞GBC-SD中,采用荧光PCR检测VEGF-mRNA表达情况,ELISA法及Western-blot法检测VEGF蛋白含量。结果：成功构建了靶向VEGF基因的shRNA质粒表达载体,并经测序验证。实时荧光PC分析shRNA2抑制VEGF基因的mRNA表达,抑制率可达86%.由ELISA法及Western-blot法看出ShVEGF-1、ShVEGF-2、ShVEGF-3、ShVEGF-4中VEGF的表达得到明显的抑制,且Sh-VEGF-4效果最显著（P〈0.05）,而NC细胞（阴性对照）则基本没有抑制VEGF的表达（P〉0.05）。结论：成功构建靶向VEGF的shRNA表达质粒,其对胆囊癌血管内皮细胞表达具有明显抑制作用。     

利用PCR方法获得shRNA抑制内外源性基因的表达

目的探讨PCR法获得的shRNA对外源性基因和内源性基因表达的抑制效果。方法选择绿色荧光蛋白(GFP)和大鼠肾脏系膜细胞高丰度表达的纤维连接蛋白(FN)分别作为外源性和内源性基因的靶基因,设计特异性引物,利用PCR扩增获得shGFPRNA和shFNRNA。前者与pEGFP质粒共转染至293T细胞,48h后进行激光共聚焦检测细胞表达GFP阳性率;后者转染至大鼠系膜细胞(RMC)中,48h后提取总RNA逆转录成cDNA,经realtimeRTPCR检测FN的mRNA表达水平,提取细胞总蛋白进行Westernblot检测FN蛋白表达水平。结果PCR获得的shGFPRNA产物能有效抑制外源性基因GFP的表达,抑制效率可达70%±3.2%;shRNA转染组内源性基因FN的表达水平明显下降,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA,对内源性或外源性基因进行特异性抑制。     

涂布介入器械的人血管内皮生长因子真核表达载体的构建

目的：构建可涂布于介入器械的人血管内皮生长因子（VEGF）真核表达载体。 方法：根据人VEGFA（NM_001025366）目的序列设计引物制备目的基因及载体,双酶切载体pIRES2-ZsGreen1和目的基因homo VEGFA进行连接后转化入大肠杆菌,构建质粒pIRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA并测序鉴定。 结果：目的基因VEGFA已连接到载体pIRES2-ZsGreen1,大小约1400 bp,与人VEGFA（NM_001025366）目的序列比对结果一致,未见变异。质粒pIRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA构建成功。 结论：成功构建重组人血管内皮生长因子真核表达载体,可用于涂布介入器械表面进行下一步实验。     

人hTERT基因的pCIneo真核表达载体的构建Q78

构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的基因的pCIneo真核表达载体。方法：根据hTERTmRNA序列设计引物,人胚肾转化细胞系293总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增后克隆到载体pCIneo上,并进行酶切鉴定及测序。结果-酶切结果表明hTERT基因已经插入pCIneo真核表达载体,测序结果显示,核苷酸序列的同源性为99．89％,氨基酸序列的同源性为100％。结论：成功构建hTERT基因的pCIneo真核表达载体,为其下一步的研究奠定了基础。     

非编码基因MEG3稳定表达细胞株建立及其对p53转录活性的影响

目的构建人类长链非编码RNA母系表达基因3（MEG3）的真核表达载体,筛选MEG3稳定高表达的肝癌细胞株,分析MEG3过表达对p53转录活性的影响。方法根据GenBank中MEG3的基因序列设计合成特异引物,从肝癌细胞中扩增MEG3的cDNA序列,将其构建入pcDNA3.0真核表达载体中,得到pcDNA3.0-MEG3表达载体,转染肝癌细胞SK-Hep-1,用G418筛选稳定株,采用RT-PCR技术检测转染细胞中MEG3基因表达,采用荧光素酶报告基因技术分析MEG3过表达细胞中对p53介导的基因转录活性的影响。结果成功构建了MEG3真核表达质粒pcDNA3.0-MEG3,筛选获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,双荧光报告实验结果显示MEG3过表达能增强p53介导的转录激活作用。结论本研究获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,为深入分析MEG3的功能及其作用机制奠定了基础。     

基质金属蛋白酶-1shRNA真核表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶-1(MMP-1)特异的RNA干扰质粒载体.方法 根据GenBank 数据库提供的MMP-1基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA (Short hairpin RNAs,shRNA) 的DNA 序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法 进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体(pWH1-MMP1)稳定转染至人腺样囊性癌ACC-M细胞系后,应用RT-PCR、免疫组织化学及Western Blot对细胞MMP1的表达进行检测.结果 在成功转染pWH1-ACC-M表达载体的ACC-M细胞中,MMP1 mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 成功构建了MMP1特异性shRNA表达载体,可有效地沉默MMP1基因,为进一步研究MMP1表达与腺样囊性癌增殖和转移的相关性奠定了一定的实验基础.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E.Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功:重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。