贝氏柯克斯体抑制宿主单核细胞的碳源代谢

贝氏柯克斯体是一种专性细胞内寄生的革兰阴性小球杆菌,为Q热的病原体。本文通过比较贝氏柯克斯体感染单核细胞和非感染单核细胞的蛋白表达谱,研究该病原体感染引发宿主细胞表达差异的蛋白。用贝氏柯克斯体I相毒株感染人单核细胞（THP一1）,采用等电聚焦和SDS-PAGE双向电泳对感染单核细胞和非感染单核细胞进行比较蛋白质组学研究,用电泳图谱分析软件发现它们之间的差异表达蛋白,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪鉴定差异表达蛋白。结果发现,电泳图谱分析发现137个差异蛋白,质谱分析鉴定到15种差异蛋白与细胞生理代谢有关。这些蛋白的表达变化说明贝氏柯克斯体感染单核细胞使宿主细胞碳源代谢受到抑制,由此可能影响单核细胞正常杀菌功能,而有利于贝氏柯克斯体在细胞内的生存。     

贝氏柯克斯体血清学反应蛋白芯片的研制

贝氏柯克斯体为Q热的病原菌.本研究对19个贝氏柯克斯体血清学反应阳性蛋白基因进行PCR扩增,将扩得的基因片段与表达载体连接,将重组质粒转化大肠杆菌并表达目的蛋白,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白.将纯化的重组蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片.将贝氏柯克斯体新桥株实验感染小鼠血清分别对蛋白芯片进行血清学分析,结果显...     

贝氏柯克斯体30kD外膜蛋白基因表达及免疫保护性的研究

贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q热。急性Q热临床表现多种多样,主要症状为发热、头痛和肌肉酸痛,并常伴有肺炎、肝炎等。慢性Q热常发展为Q热性心内膜炎、骨髓炎。Q热疫苗是预防Q热流行的最有效手段,目前人用Q热疫苗是灭活的柯克斯体。虽然灭活疫苗的免疫保护效果很好,但注射该疫苗接种部位常出现不良反应。研究发现,在贝氏柯克斯体的Ⅰ相和Ⅱ相中含有相对分子质量(Mr)为30×10 3 的外膜蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性〔1〕。我们采用分子生物学技术,研制出贝氏柯克斯体Mr30×10 3 重组外膜蛋白,用重组蛋白免疫小鼠,对其免…     

云南玉龙鼠类携带贝氏柯克斯体的基因分型研究

为更好地了解云南省鼠类中贝氏柯克斯体Coxiella burnetii的流行情况，以便制定针对Q热的预防和控制措施，本研究采用巢式PCR方法检测云南省玉龙县捕获的鼠类携带贝氏柯克斯体的情况，并对阳性样本的贝氏柯克斯体进行多间隔区序列分型(multispacer sequence typing, MST)和多位点可变数目的串联重复分析(multilocus variable number tandem repeats analysis, MLVA)。结果显示，在玉龙共捕获到49只野生鼠类，其中24只携带贝氏柯克斯体(48.98%, 24/49)。基因分型结果显示阳性样本携带贝氏柯克斯体的MST型别可分为MST16和一种新的MST基因型别，但未能获得最终的MLVA基因型别。本研究表明云南玉龙的鼠类携带新的贝氏柯克斯体MST基因型别，可为我国Q热的溯源提供一定的理论依据和数据支撑。     

贝氏柯克斯体毒力相关基因芯片对其他胞内寄生菌基因组DNA检测结果分析

目的用建立的贝氏柯克斯体毒力相关基因芯片研究贝氏柯克斯体与其致病性相似的专性胞内寄生菌（立克次体、埃立克体、新立克次体）,以及与其密切相关的兼性胞内寄生菌（巴通体和肺炎军团菌）等病原菌的毒力基因的差异。方法贝氏柯克斯体国际标准株-九里株作为本研究参考株,从全基因序列中选取166个毒力及毒力相关基因进行PCR扩增,纯化后的产物制备基因芯片。采用双色荧光标记,待测DNA（即用于分析的各菌株基因组DNA）用Cy5标记,贝氏柯克斯体九里株参照基因组DNA用Cy3标记。芯片杂交后,采用软件GenePixPro4.1,辅助以软件Excel,进行图片处理和数据分析。结果芯片的166个基因片段中有165个存在于所有贝氏柯克斯体属的6个分离株中,另一锚定蛋白（AnkI）基因（CBU1213）仅存在于九里株及Grita株;立克次体属的5株菌株均与CBU1631和CBU1125杂交;埃立克体属的3种菌株与新立克次体属的3种菌株均含有基因CBU1125;东方属的1株菌株具有基因CBU1449,而巴通体属的菌株,军团菌和大肠杆菌与基因芯片均无杂交。结论贝氏柯克斯体种内基因组具有高度保守性,它的专性细胞内寄生菌的毒力相关基因与胞外寄生菌的毒力相关基因有非常显著差异。     

甘肃南部部分地区Q热分子流行病学调查研究

为了解甘肃南部部分地区人群、媒介及宿主动物中Q热贝氏柯克斯体感染情况,采用布旗法和夹夜法分别采集蜱、野栖鼠标本,并收集当地居民及家畜血液标本.应用巢式PCR方法扩增蜱及野栖鼠标本中Q热立克次体,共检测6种蜱1 273只,其中若蜱1 126只,成蜱147只蜱标本,若蜱67组中有5组检测到Q热病原体DNA片段.成蜱中17只检测阳性;42只野栖鼠中2个鼠种3只检测阳性;采用间接免疫荧光法进行血清Q热抗体检测.共检测当地居民血清446份,抗体阳性29份;不同职业阳性率存在差异,以牧民的阳性率为最高.共检测家畜血液标本326份,其中牛56份,阳性5份;羊270份,阳性29份,无显著差别.饲养牛羊、牛羊不明原因流产、接生时保护措施3个因素与血清阳率有关,其中前两个因素为危险因素,后者为保护因素.     

贝氏隐孢子虫在珍珠鸡体内发育的透射电镜观察

采用透射电镜观察了贝氏隐孢子虫在珍珠鸡气管和法氏囊的发育。贝氏隐孢子虫各期虫体均在上皮细胞微绒毛所形成的带虫空泡内发育，虫体基部有一营养器。滋养体呈圆形，有一个细胞核。胞质中有发达的粗面内质网。裂殖体经２或３次核分裂，以出芽方式形成４或８个裂殖子。成熟的裂殖子呈香蕉形，大小为２．８５×０．７０μｍ，被双层膜。小配子体由滋养体发育而来，内含多个缺少核仁的细胞核，细胞核移向胞质浅层，并进入胞质突起成为小配子的细胞核。大配子内可观察到二种成囊体和大量多糖颗粒，并在其胞质的空泡内发现小配子类似物。孢子生殖也在带虫空泡内进行，最终形成一个大残体和４个子孢子。子孢子有一个细胞核，富含微线和多糖颗粒。     

S6K1 shRNA基因重组腺病毒的构建及对基因沉默效果的研究

目的 构建S6K1 shRNA基因重组腺病毒(S6K1Ax)并在细胞及小鼠肝脏验证对S6K1基因的沉默效果.方法 设计3种S6K1 shRNA序列,通过在pcPUR质粒与pcDNA3.1质粒、cosmid质粒之间的拼接将S6K1 shRNA转染进腺病毒,筛选沉默效果最佳的S6K1Ax并在293细胞扩增纯化得到高效价的S6K1Ax.感染来源于小鼠的肝脏、肌肉、脂肪细胞系,在Western blot水平评价其对S6K1蛋白表达的抑制效果.将S6K1Ax注射进C57BL/6J小鼠尾静脉,6 d后处死小鼠取肝脏,逆转录-聚合酶链反应和Western blot观察小鼠肝脏S6K1在mRNA和蛋白水平的表达.检测注射S6K1Ax前后小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)变化.结果 Western blot证实制备的S6K1 Ax可抑制来源于小鼠的肝脏、肌肉、脂肪3种细胞系和小鼠C57BL/6J肝脏S6K1的蛋白表达.小鼠肝脏S6K1 mRNA结果显示:对照组为1.39±0.21,实验组为0.63±0.09,t=6.132,P<0.01,差异有统计学意义.S6K1Ax注射小鼠,ALT水平注射前为(15.15±4.43)U/L,注射后为(17.32±4.22)U/L,t=1.451,P>0.05,差异没有统计学意义.结论 构建的S6K1Ax可将来源于小鼠的细胞系及C57BL/6J小鼠肝脏S6K1基因沉默,为研究S6K1的基因功能提供了适合的实验工具.     

应对“沉默”的技巧

心理咨询过程中,有时会出现沉默的局面,甚至咨询活动暂时无法进行。因此,作为心理咨询师要善于分辨沉默的真正原因,很好地理解和有效地把握这种现象,这样才会在咨询会谈中处于更为有利的地位,达到良好的咨询效果。     

FAK基因沉默诱导白血病细胞凋亡

目的:本研究靶向黏着斑激酶(FAK)基因,构建FAK-shRNA慢病毒载体,并研究FAK基因沉默对白血病细胞生长的影响。方法:化学合成人FAK基因的shRNA序列,应用分子生物学方法将该FAK shRNA序列插入含荧光素GFP慢病毒质粒。该FAK shRNA慢病毒载体在体外包装、浓缩,然后转染至人白血病细胞株。应用逆转录聚合酶链反应及蛋白质印迹方法检测FAK基因表达水平,予Annexin V标记检测细胞凋亡的情况。结果:经核苷酸序列分析提示FAK shRNA正确插入慢病毒质粒,该病毒载体在白血病细胞株的转染率为10%-25%。与对照组相比(无FAK shRNA的慢病毒载体),FAK shRNA慢病毒载体在细胞FAK mRNA及蛋白水平的抑制率分别为40%和70%。凋亡实验表明,对照组与FAK shRNA慢病毒载体组的Annexin V阳性率分别为(4.19±0.36)%和(8.48±0.58)%,两者差异明显(P0.05)。结论:我们成功构建FAK shRNA慢病毒载体,该载体能抑制FAK基因表达并诱导白血病细胞凋亡。     

沉默PTEN基因抑制H2O2诱导的大鼠心肌细胞损伤

目的探究肿瘤抑制因子沉默PTEN后对H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞损伤的作用及其机制。方法将培养的大鼠心肌细胞分为对照组和H_2O_2处理组(50、100和200μmol/L)。试剂盒检测心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放及氧化应激诱导后心肌细胞LDH释放量;流式细胞计量术检测心机细胞凋亡;RT-qPCR和Western blot检测心肌细胞PTEN表达水平及转染PTEN小干扰RNA(siR-PTEN)后,RT-qPCR和Western blot检测沉默效率;流式细胞计量术检测siR-PTEN在氧化应激诱导后心肌细胞的凋亡。结果与对照组相比,H_2O_2显著增加心肌细胞LDH释放(P0.05)、细胞凋亡率显著上升(P0.05)、PTEN mRNA和蛋白表达显著上调(P0.05),且呈浓度依赖性;siR-PTEN减少心肌细胞LDH释放和降低细胞凋亡率(P0.05)。结论 PTEN沉默表达可抑制氧化应激反应导致的大鼠心肌细胞损伤。     

基因沉默技术在斑马鱼研究中的应用

模式生物斑马鱼主要应用于探索遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域的分子机制,常用的研究策略是DNA诱变和基于RNA的基因沉默.但化学诱变技术和传统反义核酸技术存在缺陷,目前在应用中已受到很大限制.反义morpholino技术具有稳定、方便的特点,广泛应用于斑马鱼基因功能的研究.新兴的锌指核酶基因敲除技术不依赖于胚胎干细胞使其前景更为广阔.     

FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性

目的: 本实验研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性的影响。方法: 构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况。 体外应用不同浓度的化疗药物伊马替尼处理BCR/ABL-BaF3细胞,予Annexin V标记检测细胞凋亡情况。建立白血病动物模型,联合应用FAK shRNA及伊马替尼进行处理,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠骨髓及脾脏的分布情况。结果: 成功建立FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达。体外实验发现5 μmol/L 伊马替尼处理时,空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(9.76±1.97%和(21.90±3.20%,差异显著(P<0.05);予50 μmol/L 伊马替尼处理时,2组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(56.10±6.00)%和(82.10±5.70)％,差异显著(P<0.05)。白血病动物实验中,与空白对照组相比,生存分析结果显示FAK基因沉默组小鼠的生存时间明显延长。白血病细胞输注后第60 d,与空白对照组相比,白血病细胞在FAK基因沉默组小鼠骨髓和脾脏的分布明显减少。结论: FAK基因沉默能明显增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。     

SOCS1基因沉默增强DC疫苗对肺癌动物模型的治疗效果

尽管树突状细胞(dendritic cell,DC)是机体内最有效的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),但由于逃逸机制的存在,基于DC的肿瘤疫苗效果并不如人意。因此,采用一定方法增强DC提呈抗原的能力是提高疫苗效能的关键。本研究中,采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),沉默DC中细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor of cyto- kine signaling 1,SOCS1)的表达,使之提呈抗原的能力显著提高,从而有效激发针对肿瘤的特异免疫应答,疫苗的治疗效果得以明显增强。     

慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默

目的: 利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因, 建立RelB基因低表达的骨髓致耐受DC, 为自身免疫病的防治提供新方法.方法: 设计小鼠RelB基因干扰的靶序列R5, 合成并克隆到慢病毒载体上, 与慢病毒的包装材料在293FT细胞中包装成病毒颗粒, 收集病毒上清, 测定病毒滴度, 然后包装慢病毒感染DC, RT-PCR和免疫荧光方法检测, 灰度扫描并用软件分析RelB基因的表达水平, 未成熟DC作对照组, 选择T6包装病毒为RNAi的阴性对照.结果: RT-PCR和免疫荧光方法发现R5病毒感染的DC RelB基因表达水平与未成熟DC基因表达水平接近, 低于成熟DC的表达水平(P<0.05), 而实验对照T6组病毒感染的DC其RelB基因表达水平高于未成熟DC(P<0.05)和R5病毒转染DC组(P<0.05).结论: 小鼠骨髓DC表达的RelB基因被慢病毒载体有效沉默, 有望成为DC免疫治疗的新载体.     

NGAL基因沉默对人卵巢癌细胞株A2780凋亡的影响及机制

目的探讨人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)基因沉默对人卵巢癌细胞株A2780凋亡的影响及机制。方法构建针对NGAL基因的siRNA真核表达载体,转染入A2780细胞中,实验分为3组:空白对照组(Control)、转染NGAL-siRNA沉默组(NGAL-siRNA)和转染阴性对照组(NC-NGAL)。免疫荧光检测NGAL在A2780细胞及IOSE80正常卵巢细胞的表达情况。通过RNA技术沉默NGAL后,运用qRT-PCR及Western blot检测沉默NGAL基因效率。CCK-8法检测细胞活力,TUNEL染色及流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测NF-κB、Caspase-3蛋白表达。结果 NGAL在A2780细胞呈高水平表达。NGAL-siRNA组NGAL基因及蛋白表达都受到明显的抑制(P0.01)。与Control组相比,NGAL-siRNA组细胞凋亡率及Caspase-3蛋白表达明显增加,细胞活力及NF-κB蛋白表达明显下降(P0.01),而NC-NGAL组各项指标与Control组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论沉默人卵巢癌细胞株A2780中NGAL基因表达,抑制细胞生长并促进细胞凋亡,与上调Caspase-3蛋白表达和下调NF-κB蛋白表达相关。     

siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性

目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.