急性白血病病人外周血NK细胞检测的临床意义

目的探讨急性白血病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞检测的临床意义。方法用流式细胞术检测18例正常对照及54例急性白血病病人外周血NK细胞占淋巴细胞百分比,NK细胞膜活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A及穿孔素、颗粒酶的表达。结果(1)白血病初治组NK细胞数量显著低于正常对照组(P0.05),缓解组、复发组与正常对照组均无显著性差异(P0.05);(2)初治组、复发组活化性受体NKG2D均显著低于正常对照组(P0.05);初治组、缓解组、复发组抑制性受体NKG2A与正常对照组无显著性差异(P0.05)。(3)初治组、复发组的穿孔素表达均显著低于正常对照(P0.05)。结论 NK细胞数量减少及NKG2D、穿孔素表达减少可能与白血病病人发病及复发有关。     

血液系统恶性肿瘤病人外周血NK细胞及其受体检测的临床意义

目的探讨血液系统恶性肿瘤病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)细胞及其受体检测的临床意义。方法用流式细胞术检测18例正常对照及20例淋巴瘤、22例急性白血病、16例MDS病人外周血NK细胞占淋巴细胞百分比,NK细胞膜活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A及穿孔素、颗粒酶的表达。结果 (1)初治淋巴瘤和白血病组NK细胞数量显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05),MDS组与正常对照组无显著性差异(P0.05);(2)初治淋巴瘤组、白血病组、MDS组活化性受体NKG2D表达均显著低于正常对照组(P0.05),差异有统计学意义;淋巴瘤组、白血病组、MDS组抑制性受体NKG2A与正常对照组无显著性差异(P0.05)。(3)初治淋巴瘤组和白血病组的穿孔素、颗粒酶表达均显著低于正常对照(P0.05),差异有统计学意义。MDS组穿孔素、颗粒酶表达与对照组无显著性差异(P0.05)。结论淋巴瘤、白血病病人免疫功能减低与NK细胞数量减少及NKG2D、穿孔素、颗粒酶表达减少有关,MDS病人免疫功能减低可能只与NKG2D表达减低有关。     

NK细胞及其受体表达与再生障碍性贫血的相关性研究

目的 研究再生障碍性贫血(AA)病人外周血NK细胞及其受体表达的变化，探讨NK细胞在AA发病机制中的作用。方法 利用流式细胞术检测28例AA病人(其中SAA 9例，NSAA 19例)外周血NK细胞功能，包括NK细胞数量，活化性受体NKG2D,抑制性受体NKG2A,穿孔素，颗粒酶β的表达，T淋巴细胞亚群及与造血指标的相关性分析，另有18例健康志愿者为对照组。结果 AA病人外周血NK细胞数，NKG2D,颗粒酶表达减少，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);NSAA病人活化性受体NKG2D表达与血红蛋白含量(r=0.979,P=0.007)、血小板数(r=0.943,P=0.018)有相关性；颗粒酶表达与血红蛋白含量(r=0.942,P=0.018)、网织红细胞数(r=0.906,P=0.029)有相关性；SAA病人的穿孔素表达与网织红细胞数有相关性(r=0.907,P=0.046); NSAA病人NK细胞的活化性受体NKG2D表达与CD3+T淋巴细胞有相关性(r=0.984,P=0.005);NK细胞的胞浆颗粒酶表达与CD3+T淋巴细胞(r=0.865,P=0.042),CD...     

乙型肝炎病毒相关性肝硬化患者外周血NK和NKT细胞功能特点及意义

目的探讨乙型肝炎病毒相关性肝硬化(HBV-LC)患者外周血自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)功能相关分子表达特点及意义。方法收集代偿期HBV-LC患者(HBV-CLC)、失代偿期HBV-LC患者(HBV-DLC)和同期体检健康者(HC)各25例作为研究对象。流式细胞术检测各组外周血NK和NKT细胞比例、数量变化,活化标志物(CD69、HLA-DR)、激活性受体(NKG2D、NKp30、NKp46)和抑制性受体(NKG2A、CD158a、CD158b)以及细胞毒分子[穿孔素、颗粒酶A/B、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、IFN-γ]表达。结果与HC和HBV-CLC患者比较,HBV-DLC患者外周血NK细胞比例和数量均显著降低(P0.01),但高表达HLA-DR(P0.01);与HC患者比较,HBV-DLC患者外周血NKT细胞比例、数量均显著降低(P0.05),但高表达CD69和HLA-DR(P0.05);此外,相比于HC,HBV-CLC患者外周血NKT细胞比例降低(P0.05),但数量和活化标志物的表达差异并无统计学意义(P0.05)。各组间抑制性受体和大部分激活性受体(NKG2A、CD158a、CD158b和NKp30、NKp46)的表达差异无统计学意义(P0.05);相比于HC,HBV-LC患者外周血NK细胞NKG2D表达显著降低而NKT细胞毒分子(穿孔素、颗粒酶A、TRAIL、IFN-γ)表达显著升高(P0.05),HBV-DLC患者外周血NK细胞部分细胞毒分子(穿孔素、TRAIL)表达升高(P0.05);相比于HBV-CLC患者,HBV-DLC患者外周血NK细胞穿孔素表达减少(P0.05),NKT细胞虽NKG2D表达升高但数量和IFN-γ表达均降低(P0.05)。此外,相比于HC和HBV-CLC患者,HBV-DLC患者外周血NK细胞杀伤能力受到显著抑制(P0.01)。结论 HBV-LC患者尤其HBV-DLC患者外周血NK和NKT细胞功能特点发生显著改变,或许能为HBV-LC患者免疫防治提供新的视角和理论基础。     

肿瘤患者自然杀伤细胞受体NKG2A和NKG2D的表达

目的通过研究肿瘤患者外周血自然杀伤（NK）细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况，探讨二者表达失衡与肿瘤免疫逃逸的关系。方法采用流式细胞术检测40例肿瘤患者和10名正常对照者外周血NK细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况。用全自动五分类血液分析仪测定各病例的血常规。结果肿瘤患者和正常对照组白细胞数值差异无统计学意义；肿瘤患者淋巴细胞比率低于对照组，而NK细胞明显高于对照组；肿瘤患者NK细胞表面抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2D均明显高于对照组，但肿瘤患者NKG2D荧光强度呈降低趋势。结论肿瘤患者NK细胞表面NKG2A／NKG2D表达失衡，可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。     

分娩发动前后体内NK细胞、NKT细胞表型分析

目的研究分娩发动前后蜕膜及外周血中NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况,探讨其在产程发动中的作用。方法选取正常孕足月孕妇分为分娩发动经阴道分娩组（以下简称分娩组20例）和分娩未发动行选择性剖宫产术组（以下简称剖宫产组20例）,分离蜕膜及外周血中单个核细胞后采用流式细胞学技术分别检测CD56＋细胞、NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况。结果外周血单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋细胞构成下降、CD56＋NKG2D＋细胞构成增加,NK细胞、NKT细胞表面NKG2D表达上升。蜕膜单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋和CD56＋NKG2D＋细胞构成及NK细胞表面NKG2A和NKG2D表达均下降,NKT细胞表面NKG2A和NKG2D表达无显著差异。结论临产前体内NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体表达的变化可能在在产程的发动中起着重要作用。     

NKG2家族研究进展

NKG2家族是NK细胞上的一类重要受体,包括NKG2A,NKG2B,NKG2C,NKG2D,NKG2E,NKG2F,NKG2H等成员[1],都定位于12p12.3-p13.1的NK基因复合体中[2],均为C型凝集素样结构.该家族的大多数成员均与CD94结合成异源二聚体进行表达,唯有NKG2D与NKG2F不与CD94结合.NKG2家族成员按功能可分为活化性受体和抑制性受体两大类,分别传递正性和负性信号,调控NK细胞的细胞毒作用和细胞因子的释放,使NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中发挥重要作用.     

两种扩增体系NK细胞生物学特性比较及治疗异基因造血干细胞移植后白血病复发的初步研究

目的比较不同扩增体系NK细胞生物学特性的差异以及治疗异基因造血干细胞移植后(allo-HSCT)白血病复发的疗效。方法分别采用CD3/CD52单抗扩增法和饲养层细胞扩增法诱导供者来源NK细胞大量扩增, 检测扩增前后NK细胞表型、因子分泌、细胞毒的变化规律;选取16例allo-HSCT后复发白血病患者, 8例输注CD3/CD52单抗扩增NK细胞, 8例输注饲养层细胞扩增NK细胞, 观察患者的治疗反应和长期生存情况。结果①与CD3/CD52单抗扩增体系相比, 饲养层细胞扩增体系NK细胞纯度较高、NK细胞表面活化性受体DNAM-1及NKp30表达较高、抑制性受体CTLA-4表达较低, 而两种NK细胞NKG2D/CD25/CD69/Trail/PD-1/TIM-3/TIGIT表达差异无统计学意义。②两种扩增体系NK细胞Ki-67指数均明显增加, 以饲养层细胞扩增NK细胞尤为明显;饲养层细胞扩增NK细胞穿孔素及颗粒酶B表达水平均明显高于CD3/CD52单抗扩增NK细胞。③16例allo-HSCT后复发白血病患者NK细胞输注过程中均未观察到明显不良反应。NK细胞输注后中位随访时间为2554(917...     

NKG2A、NKG2D在食管鳞癌不同病理分期的表达及其相关性分析

目的 分析不同病理分期食管鳞癌患者血清中自然杀伤细胞表面抑制性受体A(NKG2A)和自然杀伤细胞表面活化性受体D(NKG2D)表达水平的特点,探讨NKG2A和NKG2D在食管鳞癌不同病理分期的表达意义,并研究NK细胞、NKG2A、NKG2D与病理分期的相关性.方法 用流式细胞仪分析92例食管鳞癌患者及50例健康志愿者外周血NK细胞数量及其NKG2A和NKG2D的表达情况.结果 与正常对照组相比,食管鳞癌患者外周血NK细胞表达增加[(9.97±4.25)% vs.(16.22±8.91)%,t′=-5.646,P<0.01],NK细胞表面NKG2A的表达水平升高[(35.19±17.73)% vs.(47.35±18.88)%,t=-3.742,P<0.01],NKG2D的表达水平降低[(83.20±3.85)% vs.(80.60±9.09)%,t′=1.925,P=0.019];食管鳞癌患者NKG2A/NKG2D的比值与其病理分期呈正相关性(r=0.333,P<0.01),行线性回归分析得F=7.413,P=0.008,按α=0.05水准,回归方程为:Y(NKG2A/NKG2D的比值)=0.105X(食管鳞癌病理分期)+0.347;R2=0.276.结论 食管鳞癌患者机体NK细胞数目增多,NKG2A/NKG2D比值与食管鳞癌病理分期进展呈正相关;降低NKG2A,提高NKG2D的表达水平,能增强NK细胞对肿瘤的杀伤活性,从而为食管鳞癌的免疫治疗开创新的思路.     

结肠直肠癌患者围手术期NK细胞活化性受体NKG2D与其配体MICA/B的表达

目的观察结肠直肠癌(CRC)患者手术前后自然杀伤细胞(NK细胞)活化性受体NKG2D与其配体MICA/B的表达,探讨NKG2D-MIC系统与肿瘤逃避免疫监视的关系。方法流式细胞术检测45例CRC患者和35例健康体检者(对照组)外周血NK细胞活化性受体NKG2D的表达,组织MICA/B的表达;ELISA检测血清MICA(sMICA)的浓度。结果 CRC组术前NKG2D、MICA/B的表达均降低,sMICA浓度增高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后NKG2D的表达无显著增高,sMICA浓度无显著降低,与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 CRC患者血清高水平的sMICA,抑制了NKG2D-MIC介导的抗肿瘤免疫,导致CRC患者NK细胞抗肿瘤免疫低下。NKG2D低表达,sMICA高浓度的情况术后短期内不能迅速逆转。     

NKG2D-IL-21融合基因修饰的结肠癌细胞体外刺激NK细胞活化的研究

目的观察含NKG2D-IL-21融合基因的重组表达载体转染结肠癌细胞后对NK细胞活化的影响。方法首先利用DNA限制性内切酶鉴定插入真核表达载体(pcDNA3.1-NKG2D-IL-21)的NKG2D和IL-21基因序列,并通过脂质体介导质粒转染结肠癌细胞株CT-26。流式细胞术胞内染色法检测CT-26内NKG2D-IL-21融合蛋白的表达,酶联免疫吸附实验鉴定细胞培养上清NKG2D-IL-21蛋白的含量。最后将经基因转染的CT-26细胞与小鼠脾脏NK细胞共培养,流式细胞术检测NK细胞表面活化性受体CD69的表达。结果 NKG2D-IL-21融合基因稳定插入pc DNA3.1载体。CT-26细胞经外源性NKG2D-IL-21融合基因转染后,表达含有NKG2D和IL-21的融合蛋白。分泌NKG2D-IL-21融合蛋白的CT-26细胞具有明显促进NK细胞表达CD69的活性。结论重组pcDNA3.1-NKG2D-IL-21真核表达载体可作为一种新型DNA疫苗。     

乳腺癌患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及意义

目的 分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值，明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法 应用流式细胞术检测108例乳腺癌和70例乳腺良性疾病患者样本中CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达；采用受试者工作特征(ROC)曲线评估各指标对乳腺癌的诊断效能，比较不同临床病理特征乳腺癌患者颗粒酶B和穿孔素的表达及治疗前后各指标的变化。结果 乳腺癌患者T淋巴细胞亚群与NK细胞中颗粒酶B和穿孔素表达均高于对照组，差异均有统计学意义(P <0.05)。ROC曲线分析结果显示，CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素阳性率的曲线下面积(AUC)大于0.5。CD3⁺T细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P <0.05),CD8⁺T细胞中颗粒酶B也与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P...     

IL-2和IL-15诱导扩增的脐带血NK细胞生物学特性研究

本研究探讨脐血CD3-CD56+NK细胞及其在IL-2、IL-15诱导扩增后的免疫表型、细胞毒活性等生物学特性的改变。分离脐血单个核细胞,在无血清培养条件下,分别加入IL-2或(和)IL-15,培养14 d,流式细胞术检测CD3-CD56+NK细胞亚群水平以及NK表面CD16、CD62L、NKG2D、NKG2A、NCR44、NCR46、颗粒酶B、穿孔蛋白的表达;用WST-1法检测NK细胞对K562细胞毒活性。结果表明,扩增14 d后IL-2、IL-15、IL-2/IL-15 3组NK细胞分别扩增了10.78±2.51、10.42±3.72、10.54±6.24倍,3组之间无显著差异;扩增后的NK细胞表达CD16的比例显著减低,IL-2和IL-15组之间差异显著;细胞因子扩增后CD62L表达无改变;IL-2有下调NKG2A、NCR46表达的作用,IL-15的作用则相反;两种细胞因子均有上调NKG2D、穿孔蛋白、NCR44表达的作用,且细胞因子之间也存在差异;IL-15有上调NK细胞颗粒酶B表达的作用;经细胞因子扩增的NK细胞毒活性显著增高,但细胞因子之间作用无显著差异。结论:在无血清培养条件下,IL-2和IL-15均能有效地扩增脐血中NK细胞。虽然2种细胞因子扩增后的CD3-CD56+NK细胞与功能相关的免疫表型呈现出不同的改变特征,但细胞毒活性均显著增加,且2种细胞因子之间作用无显著差别,协同作用不明显;NK细胞毒活性是各种活性分子共同作用的结果。     

NKG2D和NKG2A及相应配体MHC-I A/B和HLA-E在急性白血病的表达及意义

本研究旨在初步探讨NK细胞受体NKG2D和NKG2A在初发ALL和AML患者NK细胞、CD3+T细胞的表达其及相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞表达差异性和免疫学意义.用流式细胞术检测NK92细胞对8种白血病细胞系的杀伤效率,并检测60例初发急性白血病患者(ALL和AML各30例)骨髓中NKG2D和NKG2A在NK和CD3+T细胞的表达及其相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞的表达.结果表明,NK92对不同白血病细胞系的杀伤效率存在差异.ALL患者NK细胞和CD3+T细胞的NKG2D及NKG2A阳性表达率与AML患者相比均无显著差异(p>0.05),但是ALL患者白血病细胞MHC-I A/B和HLA-E阳性表达率均明显高于AML患者(p<0.05).结论:ALL与AML患者免疫细胞功能的差异性可能与白血病细胞配体表达的不同有关,而与本身NK及T细胞表达的杀伤和抑制性受体无关.     

急性白血病患者非血缘脐血干细胞移植后NK细胞及其表面受体的早期重建

本研究探讨非血缘脐血移植（unrelated cord blood stem cell transplantation,UCBT）后早期NK细胞及其表面受体重建的特点和规律及其对临床的重要性。对11例接受UCBT的急性白血病患者使用流式细胞术分别检测UCBT后受者早期（植活后90天内）NK细胞及其表面受体的重建以及T细胞和B细胞的免疫重建情况。结果表明：UCBT后NK细胞重建较早,植活时外周血中NK细胞数即高于正常水平;植活后30天达峰值,60天时绝对值达峰值水平。NK表面活化性受体NKG2D的重建早,植活时即高表达,并逐步上升,约60天达峰值（82．55±9．10）％;NK细胞的另一种活化性受体NKp46也获得早期重建,至植活后90天仍维持在高水平。NK细胞抑制性受体NKG2A在UCBT后表达较活化性受体低并持续至移植后90天。UCBT后T细胞的重建较晚,表达水平低。结论：急性白血病患者UCBT后早期NK细胞的重建较早;NK细胞表面活化性受体特别是NKG2D的重建早于抑制性受体,提示NK细胞的活化可能在UCBT后早期移植物抗白血病（GVL）作用中承担了重要角色。     

原因不明复发性流产患者蜕膜NK细胞亚群特征研究

目的通过分析原因不明复发性自然流产(URSA)患者流产蜕膜组织中NK细胞亚群表型特征,探讨蜕膜NK细胞在URSA发病中的作用。方法选取URSA患者26例为URSA组,20例同期正常妊娠行人工流产者作为正常早孕组,采用流式细胞术分析蜕膜组织NK细胞亚群表型、比例及其抑制性受体CD94/NKG2A表达情况。结果蜕膜中CD3-CD56+NK细胞约占淋巴细胞的70%,是妊娠子宫蜕膜中淋巴细胞的主要类型,URSA组蜕膜NK细胞比例与正常早孕组无明显差异;正常早孕组蜕膜NK细胞主要为CD56brightCD16-亚群,约占80%;而URSA组CD56brightCD16-亚群比例为(72.2±15.2)%,明显低于正常早孕组,而CD56dimCD16+亚群比例(15.3±6.7)%,明显高于正常早孕组,均有统计学差异(P<0.05)。URSA组蜕膜CD56brightCD16-细胞亚群CD94/NKG2A表达显著低于正常早孕对照组(P<0.01)。结论 URSA的发生可能与其蜕膜NK细胞CD56brightCD16-和CD56dimCD16+亚群比例失衡有关,而且蜕膜CD56brightCD16-细胞亚群抑制性受体CD94/NKG2A表达明显降低,可能引起NK细胞异常激活,参与URSA妊娠母胎免疫耐受的破坏。     

难治性多发性骨髓瘤患者T细胞亚群与NK细胞表达水平

选取2011年1月~2013年12月我院收治的64例初治淋巴癌患者,通过流式细胞术了解其化疗前、中和结束后外周T淋巴细胞亚群和NK细胞的表达水准。化疗后随访分完全缓解组6例,部分缓解组35例,难治性患者23例,另选58例健康者为健康对照组。结果(1)与正常对照组相比,完全缓解组MM患者Th(CD3+CD4+)细胞、Ts(CD3+CD8+)细胞和NK(CD3-CD16+CD56+)细胞虽均略有下降,但差别均无统计学意义(P0.05)。(2)部分缓解组的患者中,Th(CD3+CD4+)细胞下降明显,差别有统计学意义(P0.05);Ts(CD3+CD8+)细胞与NK(CD3-CD16+CD56+)细胞虽亦有所降低,但差别不具有显著性(P0.05)。(3)难治组的MM患者中,Th(CD3+CD4+)细胞、Ts(CD3+CD8+)细胞和NK(CD3-CD16+CD56+)细胞均呈明显下降。Th(CD3+CD4+)细胞、Ts(CD3+CD8+)细胞和NK(CD3-CD16+CD56+)细胞如果在治疗过程中和治疗后下降与否直接影响到疾病预后。     

双表达外源性4-1BBL/RANTES的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究

目的探讨K562细胞表达外源性蛋白4-1BBL/RANTES后,对T细胞、NK细胞有无活化作用,为进一步构建人工抗原提呈细胞提供前提。方法采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和RANTES基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-RANTES。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、RANTES分子的K562细胞(K562/4-1BBL/RANTES)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/RANTES细胞用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达;对NK细胞同时检测了活化性受体NKG2D的表达情况。结果受K562/4-1BBL/RANTES细胞刺激后,CD3+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞的活化性受体CD69的表达与未受刺激前相比,均有明显上调;但与单纯K562细胞刺激组相比,无显著差异。另外,CD8+T细胞CD69的表达及NK细胞NKG2D的表达无明显变化。结论将4-1BBL和RANTES共表达于K562细胞,不具备活化淋巴细胞的效应。     

NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的作用

1991年Houehins等人在对NKG2家族cDNA序列分析时，首次分离得到NKG2D。NKG2D是表达于大多数NK细胞、CD8^＋T细胞、γδT细胞及活化的巨噬细胞的活化性受体，通过识别感染细胞及应激细胞表面诱导产生的配体，并与之结合，从而杀伤靶细胞发挥免疫监视的作用。     

刺激NKG2D配体表达在血液肿瘤免疫治疗中的意义

NKG2D是表达在自然杀伤细胞（NK细胞）表面的重要的活化性受体。它能够识别不同的NKG2D配体分子,激活NK细胞的抗肿瘤活性。大多数正常组织不表达NKG2D配体,而病毒感染或者基因毒性药物等细胞压力可以通过DNA损害的途径刺激NKG2D配体分子表达,从而增强肿瘤细胞对NK细胞的敏感性。本文主要阐述刺激NKG2D配体表...