华支睾吸虫排泄分泌抗原McAb的制备及双抗夹心ELISA的初步建立

目的 以华支睾吸虫排泄分泌抗原(ESA)免疫小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,并建立一种可检测ESA的双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法。方法 用ESA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株,制备高效价单克隆抗体并鉴定;单抗经HRP标记和配对筛选,建立双抗夹心ELISA并分析其特异性及灵敏度。结果 成功制备出抗华支睾吸虫ESA McAb:B7、F1;抗体类型均为IgG₁,抗体滴度高,特异性好,以筛选到的两株单抗建立双抗夹心ELISA法,最佳线性范围为0.014~0.248 μg/mL(R²=0.996 9),最低检出限为0.014 μg/mL。结论 初步建立了检测华支睾吸虫ESA的免疫诊断方法。     

肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验。结果该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应。检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染EHEC O157模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g。结论成功研制出EHEC O157胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考耐药机制的初步研究

目的研究大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性产生的机制。方法本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将E.coli O157∶H7诱导成为氟苯尼考高度耐药菌株,采用无抗生素压力下连续传代培养或SDS方法将耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,使用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR,通过外排泵抑制剂与氟苯尼考联合使用,检测E.coli O157∶H7是否存在对氟苯尼考的主动外排作用。结果经过36代的耐药诱导,敏感菌株对氟苯尼考产生了高度耐药(MIC为256μg/mL)。质粒检测结果显示,耐药诱导菌株出现2个质粒,大小分别约为3 500bp和1 200bp,floR基因位于质粒DNA中。经连续传代培养或SDS法进行耐药消除,耐药诱导菌株对氟苯尼考的敏感性提高,但其质粒和floR基因均未丢失。结论 E.coli O157∶H7氟苯尼考敏感菌和耐药菌均存在对氟苯尼考的质子驱动型外排泵和ATP水解依赖型外排泵主动外排作用。     

肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测。方法以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型。腹水抗体ELISA效价达1∶3.2×106。以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1∶1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L。用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性。结论该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7（E.coliO157∶H7）脂多糖（LPS）抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖（O-SP）,并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。     

抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7(E.coliΟ157∶H7)特异性单克隆抗体(MAbs)。方法福尔马林灭活的E.coliΟ157∶H7免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术建立分泌抗E.coliΟ157∶H7MAbs的杂交瘤细胞株,对配对较好的6株MAbs用ELISA法测定其免疫球蛋白类及亚类,用ELISA法、凝集法和Westernblot鉴定MAbs的特异性。结果6株MAbs免疫球蛋白均为小鼠IgM。这些MAbs均能与27个E.coliΟ157∶H7菌株发生凝集反应,与部分弗劳地杆菌发生凝集反应,与11株鼠伤寒沙门氏菌、7株伤寒杆菌、2株痢疾杆菌、致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、出血性大肠杆菌Ο26∶H11和Ο111、肠集聚性大肠杆菌、42株非定血清型大肠杆菌、霍乱弧菌Ο1群和Ο139群不发生凝集反应;ELISA结果显示6株MAbs与粪链球菌、变形杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯杆菌均无交叉反应;ELISA和Westernblot结果显示,3株MAbs针对E.coliΟ157∶H77酚相脂多糖。结论6株MAbs具有较高的特异性,有可能用于制备检测E.coliΟ157∶H7的病原检测试剂。     

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备

目的 本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法 利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞,制备单克隆抗体,对单克隆抗体进行胶体金标记后制备检测试剂盒,并确定其灵敏度、特异性等技术指标。结果 经数轮筛选,获得1株阳性杂交瘤细胞株,抗体效价达到1∶256 00。胶体金标记试纸条灵敏度量达到10⁶ CFU/mL。特异性测试结果表明,胶体金标记试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染的牛乳样均无阳性反应,只与无乳链球菌乳样出现阳性结果。结论 该胶体金标记免疫层析试纸条,具有实际应用价值,将为牛乳腺炎的筛查检测提供新型、便捷的技术产品。     

夹心ELISA检测微小隐孢子虫抗原方法的建立及初步应用

目的 建立检测隐孢子虫的夹心ELISA方法。方法 本试验以纯化的抗隐孢子虫IgG、IgY分别作为包被抗体和捕获抗体,棋盘滴定法确定夹心ELISA的最适工作条件。用基于18SrRNA的PCR方法评估饱和蔗糖溶液、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方法预处理样品对夹心ELISA检测效果的影响。结果 建立的夹心ELISA捕获抗体、抗原、检测抗体、酶标二抗最佳工作浓度分别是1∶800、2.5 μg/mL、1∶100和1∶5 000,最适捕获抗体包被、抗原抗体反应、酶标二抗反应条件分别为37 ℃作用1 h后4 ℃过夜、37 ℃作用30 min、45 min;最适终止条件是2 mol/L H₂SO₄,50 μL/孔;TMB室温显色10 min;特异性试验结果显示仅可以检出隐孢子虫抗原,而与常见肠道寄生的球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵无交叉反应。批间和批内变异系数均小于10%。3种方法前处理粪便用于ELISA检测与nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,以饱和蔗糖溶液漂浮法处理检测样品的效果最佳。与爱德士的隐孢子虫检测试剂盒比较,结果显示,本方法敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6×10³个/mL),整个试验过程比试剂盒多用15 min,但特异性和重复性均一致,且本试验方法更加经济实用。结论 该方法简便,快速,灵敏,可用于临床粪样中隐孢子虫病原检测或隐孢子虫流行病学调查研究。     

免疫捕获PCR法快速检测大肠埃希氏O157∶H7的研究

目的建立两种免疫捕获PCR法快速检测E.coliO157∶H7,并探讨其灵敏度和特异性。方法运用免疫磁珠集菌(IMS)和抗体包被扩增管(mACT)两种方法富集待测样品中E.coliO157∶H7,再应用巢式PCR法检测编码E.coliO157∶H7O抗原的rfbE基因,对13株E.coliO157菌和10株非E.coliO157菌进行检测。结果应用两种icPCR检测,所有E.coliO157∶H7和E.coliO157NM菌株均为阳性结果,而其它包括与O157抗血清能交叉凝集的菌株检测结果均为阴性;对于含有48×102cfu/ml以上浓度的E.coliO157∶H7菌悬液,两种方法,所有试验管都能检测到特异性扩增;并证实了这两种方法可用于检测鲜牛奶中E.coliO157∶H7,样品中E.coliO157∶H7的含量只要不少于101cfu/ml,经过6小时增菌均能检测出来。结论IMS-icPCR和mACT-icPCR用于检测E.coliO157∶H7,是快速、灵敏且高特异的方法。     

寨卡病毒NS1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

目的 高效表达和纯化重组的寨卡病毒NS1蛋白,制备抗NS1蛋白的单克隆抗体。方法 构建含有寨卡病毒NS1基因的原核表达质粒,利用大肠杆菌大量表达重组NS1蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠并进行细胞融合,筛选制备高纯度的单克隆抗体。结果 在大肠杆菌中高效表达了重组NS1蛋白,重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,筛选出3株分泌针对寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B8、7D11和3E2,纯化的单克隆抗体与重组NS1蛋白有良好的特异性反应。结论 利用重组NS1蛋白免疫制备了抗NS1的单克隆抗体,为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供了基础。     

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的 建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法 通过对10³ CFU/m~10⁶ CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果 空肠弯曲菌在10³ CFU/mL~10⁶ CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5 μg/mL,5 μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论 EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。     

霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157∶H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌和非O157:H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157∶H7。     

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的 建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法.方法 根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测.结果 该方法扩增目的基因片段分别为327 bp、247 bp、494 bp、384bp和779 bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104 cfu/mL.结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测.     

实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

目的 结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法 根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定。通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限。结果 恒温63 ℃条件下,20~60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为10² CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达10¹ copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×10¹ CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×10¹ CFU/g~4.4×10⁸ CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力。     

抗出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗出血性大肠杆菌O157：H7(E．coli O157：H7)特异性单克隆抗体(MAbs)。方法福尔马林灭活的E．coli O157：H7免疫BALB／c小鼠，利用细胞融合技术建立分泌抗E．coli O157：H7 MAbs的杂交瘤细胞株，对配对较好的6株MAbs用ELISA法测定其免疫球蛋白类及亚类，用ELISA法、凝集法和Western blot鉴定MAbs的特异性。结果6株MAbs免疫球蛋白均为小鼠IgM。这些MAbs均能与27个E．coli O157：H7菌株发生凝集反应。与部分弗劳地杆菌发生凝集反应，与11株鼠伤寒沙门氏菌、7株伤寒杆菌、2株痢疾杆菌、致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、出血性大肠杆菌O26：H11和O111、肠集聚性大肠杆菌、42株非定血清型大肠杆菌、霍乱弧菌O1群和O139群不发生凝集反应；ELISA结果显示6株MAbs与粪链球菌、变形杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯杆菌均无交叉反应；ELISA和Western blot结果显示。3株MAbs针对E．coli O157：H7酚相脂多糖。结论6株MAbs具有较高的特异性，有可能用于制备检测E．coli O157：H7的病原检测试剂。     

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（real-time PCR）技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7实验室诊断技术进展

肠出血性大肠杆菌O157：H7（E．coli O157：H7）是肠出血性大肠杆菌（EHEC）的一个血清型，主要引起人的食源性疾病，以突发性腹痛、腹泻、血便为主要症状，严重时并发肾功能衰竭，病死率高。E．coli O157：H7广泛分布于自然界，在生猪、猪肉、牛及牛肉及其粪便中分离率极高，对公众健康构成严重威胁。因此，早期发现及时治疗和预防是控制该病的关键。E．coli O157：1-17实验室诊断以细菌培养、分离及生化和血清鉴定为主。近年来出现的新型免疫学方法和聚合酶链反应（PCR）对E．coli O157：H7诊断具有较高的敏感性和特异性。本文就E．coli O157：H7检测技术的研究进展综述如下。     

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及其生物学特性研究

目的 为了解郑州地区牛携带大肠杆菌O157∶H7的情况。方法 应用本实验室已建立的大肠杆菌 O157∶H7多重PCR方法对其进行了检测,并对临床分离的动物源大肠杆菌O157∶H7的生物学特性及携带的毒力基因情况进行了分析。结果 所采集的样品中共分离鉴定出2株大肠杆菌 O157∶H7,分别命名为L1和L2,其检出率为1.4%;临床分离菌株的生化试验结果均符合大肠杆菌的常规生化特性;L1和L2菌株的生长曲线一致,均比标准株的迟缓期短,较早进入对数生长期;L1菌株在48 h可形成成熟完整的生物被膜,L2菌株在36 h形成成熟完整的生物被膜;L1和L2菌株均携带有hlyA和eaeA毒力基因,同时L1还携带Stx2毒力基因。结论 该结果为大肠杆菌O157∶H7流行病学调查提供了相关数据,对郑州地区大肠杆菌O157∶H7有效的监测奠定了基础。