鼠疫耶尔森菌小肽基因sORF34缺失株毒力及短期免疫保护效果评价

目的 探索小肽基因34(sORF34)缺失对鼠疫耶尔森菌毒力影响,并评价sORF34缺失株免疫保护活性。方法 基于鼠疫耶尔森菌201株和鼠疫耶尔森菌EV76疫苗株利用λ-Red一步法构建小肽基因缺失株。比较鼠疫小肽基因缺失株和亲本株之间的毒力差别,并采用皮下免疫方式对小鼠进行免疫,与EV76疫苗株比较,评价体液免疫、保护率等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,小肽基因缺失株构建成功。通过皮下LD₅₀测定、生存曲线测定,表明小肽基因缺失株较亲本株毒力下降。鼠疫201ΔsORF34和EV76ΔsORF34皮下免疫后可刺激机体产生抗F1-IgG,其中鼠疫201ΔsORF34免疫组抗体滴度与EV76疫苗株免疫组差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34免疫组较EV76疫苗株免疫组抗体滴度低;鼠疫EV76ΔsORF34株可刺激机体产生低滴度抗LcrV-IgG,而EV76和201ΔsORF34株不能刺激机体产生抗LcrV-IgG。初免后42 d使用致死剂量鼠疫201株进行皮下攻毒和滴鼻攻毒,3组保护率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 小肽基因缺失株经皮下途径感染BALB/c小鼠的毒力下降,鼠疫EV76ΔsORF34株较EV76疫苗株残存毒力进一步下降,但保护率差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34株有作为鼠疫减毒活疫苗候选株的潜力。     

齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫疫源地内鼠疫主要宿主动物和指示动物携带非鼠疫耶尔森菌的调查研究

目的 探讨齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫疫源地内鼠疫的主要宿主动物(鼠类)和指示动物(家犬)携带小肠结肠炎耶尔森菌的情况,掌握小肠结肠炎耶尔森菌在鼠疫自然疫源地内的生态学分布特征方法 采集的啮齿动物和犬类标本分离小肠结肠炎耶尔森菌,并进行血清分型、生物分型及毒力基因检测结果 从62份啮齿动物标本检出43株小肠结肠炎耶尔森菌,携带率35.5％;从171份犬类标本检出96株小肠结肠炎耶尔森菌,携带率26.3％;138株小肠结肠炎耶尔森菌为生物1A型;1株小肠结肠炎耶尔森菌为生物3型、血清O∶3型结论 啮齿动物较犬类小肠结肠炎耶尔森菌的携带率高。非致病性小肠结肠炎耶尔森菌菌株为优势菌型。在鼠疫疫源地内研究小肠结肠炎耶尔森菌的分布及生物学特征对该病的预防控制具有重要意义,也有助于探讨致病性耶尔森菌在自然界长期保存、变化的机理以及相互关系。     

基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌

目的 实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法 本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25 ℃和37 ℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论 应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。     

陕西省鼠疫耶尔森菌MLVA分型研究

目的 掌握陕西省鼠疫耶尔森菌分离株的MLVA基因分型特征,阐明不同疫情年份菌株间的遗传进化关系,为今后陕西省鼠疫的监测防治工作提供科学依据。方法 采用MLVA(14+12)方法,对分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫耶尔森菌进行基因分型,利用BioNumerics(Version7.6)软件对分型结果进行聚类分析。结果 66株鼠疫耶尔森菌分为A、B、C群,根据分离时间聚集成为相应群,A群包含42株菌,其中39株菌分离自2000-2001年,B群包含16株菌,其中15株分离自2006年,C群含8株菌,其中6株分离自1987-1988年。基因型分为19种,8个基因型为多菌株基因型,其他型为单菌株基因型。结论 陕西省鼠疫菌MLVA基因型具有多态性,不同疫情年份菌株主导的基因型不同,MLVA分型能够很好区分陕西省不同年代鼠疫菌株,可用于鼠疫菌株的溯源分析。     

云南省金沙江中下游流域致病性耶尔森菌调查研究

目的 了解云南省金沙江中下游流域鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌3种致病性耶尔森菌的分布及流行现状。方法 选择云南省金沙江中下游流域5个县，采集鼠盲肠及犬肛门拭子标本，通过冷增菌后提取增菌液DNA并对foxA、ail、inv、caf1等特异基因进行PCR检测，基因阳性可疑标本进行菌株分离纯化后进行菌落PCR鉴定，对实验结果进行统计分析。结果 采集标本1 631份，其中鼠盲肠段标本985份、犬肛门拭子标本646份。自鼠肠道中共分离到小肠结肠炎耶尔森菌24株，分离率为2.44%(24/985),自犬肛门拭子中共分离到14株，分离率为2.17%(14/646),小肠结肠炎耶尔森菌总分离率为2.33%(38/1 631),且38株小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因检测均为阴性；自昭通永善县犬肛门拭子中分离到唯一1株假结核耶尔森菌，分离率为0.15%(1/646);未分离到鼠疫耶尔森菌。结论 云南省金沙江中下游流域鼠和家犬中携带非致病性小肠结肠炎耶尔森菌，云南省首次自鼠疫指示动物犬中分离到假结核耶尔森菌，未发现鼠疫耶尔森菌的相关线索。     

表达鼠疫菌F1抗原的重组芽孢的制备及口服免疫效果观察

目的 利用枯草杆菌芽孢展示外源蛋白的呈递技术,研究表面展示鼠疫菌保守抗原F1蛋白的重组芽孢,分析评价重组芽孢的免疫原性。方法 将枯草杆菌CotB基因构建到pDG1664质粒,再将鼠疫菌保守序列F1蛋白编码基因连接到CotB基因的下游,构建成重组质粒。然后将外源基因CotB-F1同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中。经PCR、Western Blot方法鉴定重组芽孢中鼠疫F1蛋白的表达。用上述重组芽孢以无佐剂口服方式免疫小鼠。采用ELISA方法检测重组芽孢免疫小鼠的免疫效果。结果 本研究制备出表面表达CotB-F1融合蛋白的重组枯草杆菌芽孢。用重组芽孢和野生型芽孢口服免疫BALB/c小鼠。实验结果表明,重组芽孢免疫组产生了针对鼠疫F1抗原的特异性抗体。重组芽孢免疫小鼠能产生有效的免疫应答。结论 本研究制备出表面展示鼠疫F1蛋白的枯草杆菌芽孢,建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,为发展口服鼠疫疫苗奠定了基础。     

甘肃黄鼠疫源地鼠疫宿主动物致病性耶尔森菌调查分析

目的 了解甘肃阿拉善黄鼠疫源地内鼠疫宿主动物致病性耶尔森菌感染状况,为探索该疫源地鼠疫流行状态提供依据。方法 2016-2018年现场采集阿拉善黄鼠鼠疫疫源地会宁县、平川区鼠疫宿主动物阿拉善黄鼠及花鼠、大仓鼠、沙土鼠、子午沙鼠、中华鼢鼠、小灰鼠、达乌尔鼠兔、小家鼠、灰仓鼠的回盲部及内容物、舌根部、血清标本,分别进行耶尔森菌分离及鼠疫F1抗体的检测。结果 会宁县共采集阿拉善黄鼠及花鼠、大仓鼠、沙土鼠、子午沙鼠、中华鼢鼠舌根部标本274份,未检出耶尔森菌,回盲部及内容物标本275份,检出1株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,其毒力型别为(ail- ystA- ystB+ yadA- virF- rfbc-),检菌率为0.18%;平川区共采集阿拉善黄鼠及沙土鼠、子午沙鼠、中华鼢鼠、小灰鼠、达乌尔鼠兔、小家鼠、灰仓鼠舌根部标本213份,回盲部及内容物标本219份均未检出耶尔森菌。阿拉善黄鼠血清312份,鼠疫F1抗体结果均为阴性。结论 甘肃黄鼠疫源地鼠类肠道内可能存在耶尔森菌群,检出的小肠结肠炎耶尔森菌的地点与阿拉善黄鼠鼠疫菌的地点一致。     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

四川省鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及地区分布研究

目的 对四川省鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)做规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRSIPR)基因分型和地区分布研究,为四川鼠疫防治提供科学依据。方法 对132株鼠疫菌培养和提取核酸,应用3对CRISPR引物对被试菌株DNA进行PCR扩增、测序和分析,确定四川省鼠疫菌的CRSIPR基因型。结果 132株鼠疫菌共发现17种spacer,包括YPa 9种、YPb 5种、YPc 3种,新发现的1种space阵列。所有鼠疫菌株被分为2个CRISPR基因簇(Cc3',Ca7),3个基因型(37'型、22型和sc01型)。其中石渠县青海田鼠型菌株基因型为37'型,石渠县人间鼠疫的菌株为22型,德格县旱獭型菌株基因型为22型,巴塘县、理塘县、雅江县和新龙县旱獭菌株基因型为sc01型。结论 四川省鼠疫菌菌株具有明显的地区分布特征。     

肠炎沙门菌rfbG基因缺失株的构建及其生物学特性研究

目的 探究rfbG基因对肠炎沙门菌毒力的影响,评价肠炎沙门菌缺失rfbG基因后作为减毒活疫苗的潜力。方法 利用自杀质粒介导的同源重组技术,无痕构建肠炎沙门菌Z11ΔrfbG缺失株,并对其生物学特性进行分析。结果 成功构建肠炎沙门菌Z11ΔrfbG缺失株,与野生株相比,缺失株Z11ΔrfbG生化特性没有发生变化,在LB液体培养基中生长速率较慢;缺失株生物被膜形成能力显著弱于野生株,其感染J774A.1细胞后,产生的细胞毒性亦显著低于野生株。此外,缺失株可与吖啶橙溶液发生凝集,但与O₉血清不发生凝集。结论 rfbG基因缺失显著降低了肠炎沙门菌Z11的毒力,且缺失株符合粗糙型菌株的特点,Z11ΔrfbG不仅具有作为沙门菌减毒活疫苗或载体的潜质,也具有作为DIVA疫苗的潜力,为肠炎沙门菌减毒活疫苗的开发研究奠定了基础。     

猪链球菌2型二元信号转导系统ciaR基因敲除突变株的构建及生物学功能研究

目的构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33二元信号转导系统1094HK/1095RR的反应调节因子ciaR基因敲除突变株(ΔciaR),并研究ΔciaR的生物学功能。方法和结果基于同源重组原理筛选ciaR基因缺失株,PCR分析及Southern杂交结果均显示突变株构建成功。通过检测OD600值绘制生长曲线,发现突变株在37℃和40℃其OD600值均明显低于野生株;与40mmol/L过氧化氢共作用15min后涂板计数,突变株存活率明显低于野生株;不同pH值的培养基中培养,发现在pH5.0的酸性环境中突变株OD600值明显低于野生株;野生株与突变株对BALB/c小鼠攻毒(约1×109CFU/只),各10只,两组16h后均死亡9只。结论成功获得05ZYH33ciaR基因敲除突变株;发现删除ciaR基因会导致细菌的生长繁殖能力减弱,抗氧化应激能力下降,在酸性环境生长存活能力下降;但对小鼠毒力无差别。     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

Phenotypical Characterization of Mongolian Yersinia pestis Strains

Although Mongolia is regarded as one of the possible places of plague radiation, only few data are available from Mongolian Yersinia pestis strains. In this study a total of 100 Mongolian Y. pestis strains isolated from wild mammals and their parasites between the years 1960 and 2007 were analyzed for their phenotype. All strains grew well on selective Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin agar and were positive for the F1-antigen, the F1-gene (caf1), and the plasminogen activator gene (pla). Biochemical analyses using the API20E? system identified 93% of the strains correctly as Y. pestis. The BWY in-house system consisting of 38 biochemical reactions was used to differentiate among Y. pestis subspecies pestis biovars Antiqua and Medievalis and also between the subspecies microtus biovars Ulegeica and Caucasica. Antibiotic susceptibility testing according to Clinical and Laboratory Standards Institute-guidelines identified one strain as being multiresistant. This strain was isolated from a wildlife rodent with no anthropogenic influence and thus suggests naturally acquired resistance.     

广东省65株耶氏菌的系统鉴定与鼠疫疫源地性质的探讨

目的鉴定65株耶氏菌,了解菌株的生物学特性,抗原抗体与鼠疫菌的相关性,探讨疫源地的现状和性质。方法65株菌用3种致病性耶氏菌诊断血清,分别做玻片、试管凝集试验、生化试验、生长特性,挑选14株菌做毒力因子、毒力基因、致病性、交叉免疫原性、动物试验和血清学、药敏试验。结果 63株小肠结肠炎耶氏菌血清型42株O∶3、21株O∶9,中间型1株,假结核血清II型1株;VW+2株,VW±10株,VW-2株;14株菌F1Ag、F1Ab全阴;小肠结肠炎5株菌均有2个毒力基因(ail、ystA)阳性,VW+和VW±对小白鼠、家兔有致病性,动物感染一种耶氏菌后有交叉免疫力,抗原、活菌交叉吸收鼠疫抗血清后血清学IHA、RIHA没有交叉性,常用抗菌素敏感。结论目前动物感染小肠结肠炎菌普遍,猪感染最高,局部已爆发流行,假结核菌偏低,鼠疫处于静息期。     

分子生物学方法鉴定四川省德格县鼠疫菌株

目的对四川省德格县更庆乡上压巴地区从自毙喜马拉雅旱獭体内分离到2株疑似鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)进行实验室诊断及鉴定。方法采用PCR技术,检测鼠疫菌特异基因,并进行基因分型。结果鉴定的2株菌具有鼠疫菌的特异标识序列3a和鼠疫菌的质粒基因Pla、calf、LcrG;DFR谱中均缺失DFR1、DFR2、DFR13、DFR23。结论本次鉴定的2株菌均为喜马拉雅旱獭型鼠疫杆菌。     

猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33 ofs基因敲除突变株构建及其生物学特性研究

目的探究猪链球菌血清浑浊因子ofs基因在强致病性2型猪链球菌致病过程中的作用。方法利用同源重组基因敲除方法构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为ofs编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,同源重组筛选ofs基因敲除突变株,通过组合PCR、Southern杂交和DNA测序对疑似突变株进行验证。生物学功能实验研究比较ofs突变株和野生株05ZYH33在革兰氏染色、菌落溶血活性、生长速率和毒力等方面的差异。结果组合PCR、Southern杂交和DNA测序结果均证实ofs基因敲除突变株05ZYH33Δofs构建成功,体外实验结果显示ofs基因缺失后菌株在革兰氏染色和菌落溶血活性及形态、生长速率等方面未发生改变,但小鼠毒力实验数据结果表明敲除突变株Δofs的毒力降低。结论猪链球菌2型ofs基因与细菌的毒力相关,本实验构建的突变株05ZYH33Δofs为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。