细粒棘球绦虫Eg95基因疫苗和重组抗原诱导小鼠免疫应答的比较研究

目的观察比较细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗诱导小鼠的免疫应答状况。方法实验组和对照组小鼠分别注射Eg95重组抗原(rEg95)、费氏佐剂(FCA)、pcDNA3-Eg95基因疫苗、pcDNA3质粒和生理盐水,收集各组血清用酶联免疫吸附(ELISA法)检测抗体IgG和IgG2a亚类水平;采集脾细胞用四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖反应。结果rEg95免疫组小鼠在第二次免疫后开始检测到抗Eg95抗原的IgG,并随着免疫次数的增多,血清抗体效价升高,在第1次免疫后第10周时,免疫抗体滴度可达到1∶25,600。Eg95基因疫苗免疫的小鼠产生抗体滴度随免疫次数的增加而升高,最高可达1∶3,200,但是低于Eg95重组蛋白免疫小鼠产生的抗体滴度水平。pcDNA3-Eg95免疫组产生IgG2a亚类抗体水平明显高于对照组和rEg95组。在第四次免疫后,进行淋巴细胞转化试验,MTT法检测证实rEg95和pcD-NA3-Eg95免疫的小鼠,其脾细胞均可在体外被特异性刺激增生。结论细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗均可诱发小鼠产生特异性免疫应答。     

细粒棘球蚴Eg10基因的克隆、表达及免疫特性研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴分离株Eg10基因,并研究其重组蛋白的免疫特性。方法将细粒棘球蚴Eg10基因亚克隆于表达载体pET28a,转化重组质粒至大肠埃希菌BL21进行融合表达,His-bind树脂纯化系统纯化重组融合蛋白,以之作为抗原免疫小鼠。48只ICR小鼠随机均分为4组,A、B组为对照组,分别注射不含抗原的磷酸盐缓冲液(PBS)和福氏佐剂+PBS,每鼠皮下注射100μl。C、D组为免疫组,注射用福氏佐剂乳化的重组抗原Eg10,抗原量分别为0.1mg/μl和0.5mg/μl,每鼠皮下注射100μl。各组小鼠每隔2周免疫1次,共免疫3次。于免疫前和免疫后2、4、6、8和10周采血以获得抗血清。通过蛋白质印迹(Westernblotting)分析和ELISA检测重组抗原的免疫学特性。结果成功构建含目的片段Eg10的基因工程菌株。Westernblotting分析结果表明,免疫血清能识别重组抗原Eg10。ELISA检测结果显示,用重组蛋白免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。统计学分析表明,免疫后C、D组抗体水平逐渐升高,至第8周抗体滴度达最高值,分别为(1.143±0.253)和(1.254±0.070);A、B组抗体一直维持在较低水平。第2、4、6、8和10周,A、B与C、D组间抗体水平差异有统计学意义(均P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论成功表达细粒棘球蚴重组蛋白Eg10,该蛋白有一定的免疫原性。     

细粒棘球绦虫Eg95疫苗研究进展

囊型包虫病（Cystic echinococcosis，CE）是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病，是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。现已证实全国有31个省市区存在包虫病感染病例，有100多万包虫病现症患者，受威胁人口达几千万，包虫病畜超过4000万头，每年新发病畜达800多万头，年经济损失超过10亿元。该病已成为西部牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因。随着现代社会的发展，人口流动的增加，宠物犬和经济动物狐狸的养殖数量日益增多，导致包虫病蔓延扩散。     

细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建

目的 构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)。 方法 分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板, PCR扩增获117 bp 的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和 471 bp 的Eg95基因序列。将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261, 经酶切、 PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95。电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗, 卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定。 结果质粒pSMEg95经双酶切、 PCR扩增及测序鉴定, 证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261, 并将此重组质粒导入BCG菌, 经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗 (rsBCG-Eg95)构建成功。 结论 构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95。     

细粒棘球绦虫Eg7-1基因克隆与表达

自细粒棘球λg11 cDNA文库中筛选出一诊断抗原基因Eg7-1.PCR扩增基因片断,直接插入携带3-T的载体p~(CR2.1)内。在lNVαF’内扩增目的基因。经Bam HI和HinsⅢ酶切后,将目的基因亚克隆到表达质粒PRSET b内,转化大肠杆菌BItl(DE3)。SDS—PAGE和免疫印迹检测到表达产物(40kDa)。该重组抗原与曼氏血吸虫病人血清及正常人血清无交叉反应。     

细粒棘球绦虫Eg95基因工程疫苗研究进展

细粒棘球蚴病(echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)的中绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病.手术及药物治疗都因其局限性而受到限制,有保护作用的疫苗将成为控制该病流行的有效工具.目前最为成功的棘球蚴病疫苗为Eg95疫苗,作者综述了细粒棘球绦虫Eg95基因工程疫苗的研究进展.     

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。     

细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗体外瞬时表达及对小鼠诱导的免疫应答

目的　检测细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗(pcDNA3 Eg95)体外瞬时表达,探讨其诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。　方法　pcDNA3 Eg95经脂质体转染HeLa细胞瞬时表达。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Eg95抗原信使RNA(mRNA)在HeLa细胞中的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(Westernblot ting)检测Eg95蛋白的瞬时表达情况。pcDNA3 Eg95基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测IgG和IgG2a水平,四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应。　结果　RTPCR检测结果显示,pcD NA3 Eg95瞬时表达组有Eg95抗原基因mRNA表达,ELISA和Westernblotting检测结果表明,可在HeLa细胞中特异性表达Eg95蛋白。用pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫BALB/c小鼠,第3周出现特异性IgG免疫应答,持续升高至第10周,显著高于对照组。从第2周开始,小鼠血清IgG2a应答即为阳性,且长时间(至第10周 )维持较高水平,与pcD NA3空质粒组比较,其差异具有非常显著性意义(P<0.01)。用原核表达的Eg95重组蛋白刺激免疫小鼠脾细胞,有明显的T细胞增殖反应。pcDNA3 Eg95基因疫苗免疫组刺激指数明显高于pcDNA3空质粒组(P<0.01)。结论　pcDNA3 Eg95基因疫苗可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细     

细粒棘球绦虫FABP与Eg95融合基因的表达与抗原性鉴定

目的构建细粒棘球绦虫脂肪酸结合蛋白(FABP)和Eg95两个保护性抗原基因的融合基因,并研究其重组蛋白的免疫学特性。方法以细粒棘球绦虫青海绵羊株保护基因FABP和Eg95的cDNA为模板,通过编码4个甘氨酸残基的连接序列,用非对称聚合酶链反应扩增融合基因FABP·Eg95,克隆至表达载体pET28a(+)中,在大肠埃希菌BL21(DB3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。通过Ni-IDA亲和层析获得高纯度目的蛋白,利用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫反应性。结果获得的融合基因FABP·Eg95长约795bp,双酶切和测序鉴定结果均显示pET-28a(+)-FABP-Eg95重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95在大肠埃希菌BL21(DB3)中获得高效表达,表达相对分子质量(Mr)约为31000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,经亲和层析获得目的蛋白。Western blotting分析结果显示,重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清有良好的免疫反应性,而不与健康人血清和血吸虫病患者血清反应。结论 FABP·Eg95融合基因构建成功,纯化的重组蛋白具有一定的抗原性。     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性研究

目的探讨细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)亲肌肉抗原重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值。方法ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2w皮下免疫1次,在第3次免疫后2周,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20w剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平。结果与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为94.46%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG、IgG1、IgG3和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05)。结论细粒棘球绦虫亲肌肉抗原重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

细粒棘球蚴重组抗原rEgferritin诱导宿主抗感染免疫应答的初步研究

目的 初步探讨细粒棘球蚴重组铁蛋白rEgferritin免疫小鼠产生的抗细粒棘球蚴感染的免疫机制.方法 rEgferritin免疫ICR小鼠3次、同时设立佐剂组和对照组,第12w用细粒棘球蚴原头蚴对3组小鼠进行攻击感染,5个月后剖杀小鼠,检查各组小鼠腹腔内包囊个数,根据公式计算保护力.分别于0w,12w,32w取血,制...     

细粒棘球绦虫Eg18基因的克隆 表达和重组抗原免疫检测的初步评价

目的克隆、表达细粒棘球绦虫Eg18基因,评价重组蛋白的免疫反应性。方法根据已知Eg18基因序列,利用RT-PCR方法从青海绵羊肝棘球蚴原头节提取的总RNA中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,转化大肠埃希菌BL21（DE）,IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化,用免疫印迹试验（Western blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）初步评价其与棘球绦虫及其他蠕虫感染血清的反应性。结果 RT-PCR扩增产物编码的蛋白质序列与GenBank中的Eg18和Em18完全相同。重组蛋白与多种蠕虫病人血清中的IgG和IgG4均有交叉反应,但检测IgG4时,与其他蠕虫的交叉反应显著降低。结论 Eg18/Em18是细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同抗原,其特异性IgG4是泡型棘球蚴病较特异的诊断标志物。     

pIL-12质粒DNA对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响

目的探讨pIL-12质粒DNA免疫对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响。方法将pIL-12质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c鼠,免疫后8w用Eg原头节进行攻击感染,感染后18w剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比;用EgAg或ConA刺激培养脾细胞,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平;流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照。结果pIL-12质粒DNA免疫组的减蚴率为44.85%,脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,IL-2、IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组。结论pIL-12质粒DNA可诱导细粒棘球蚴感染小鼠产生一个保护性的免疫反应。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗诱导小鼠体液免疫应答的动态观察

目的观察细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95疫苗免疫小鼠体液免疫应答的动态变化。方法将疫苗分别采用经口灌胃和鼻内接种法免疫BALB/c鼠,分别于免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周采血,分离血清,用ELISA法测定IgG及其亚类和IgE水平。结果经口灌胃免疫组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8、6、6、6、6和10周达最高水平;鼻内接种组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8、8、10、8、6和10周达最高水平。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白的免疫反应性

目的 利用基因工程方法表达细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白（rAgB）,并分析其免疫反应性。 方法 将rAgB基因片段插入原核表达载体pET41a（+）中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,获得重组蛋白rAgB-GST。用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析柱（GST-sepharose 4B）纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况。用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫反应性,并用免疫胶体金包虫诊断试剂盒作为对照。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET41a-rAgB构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白rAgB-GST的相对分子质量（Mr）为40 800,纯化蛋白含量为78.4%。Western blotting分析结果显示,重组蛋白rAgB-GST检测细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清的阳性率分别为79.2%（95/120）和51.1%（23/45）,但与卫氏并殖吸虫病患者、华支睾吸虫病患者血清以及健康人血清反应均为阴性。rAgB-GST的敏感性和特异性分别为79.2％（95/120）和81.0%（98/121）,均略高于免疫胶体金棘球蚴病诊断试剂盒的敏感性(72.8%,75/103）和特异性（76.9%,30/39）。 结论 重组rAgB-GST蛋白可被细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清识别,有较好的免疫反应性。     

细粒棘球蚴egG1Y162疫苗对小鼠免疫应答的研究

目的 观察细粒棘球蚴egG1Y162疫苗免疫小鼠后机体的免疫应答状况。方法 实验组、GST对照组、佐剂组和正常组小鼠分别注射egG1Y162疫苗、谷胱甘肽巯基转移酶(GSTs)、佐剂(FCA)和生理盐水(NS),在免疫第0、2、4、6、8和10周,收集各组血清用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测抗体滴度,并检测各组血清抗体IgG的动态变化。第10周用四甲基偶氮唑蓝实验(MTT法)检测免疫小鼠脾淋巴细胞体外刺激后的增殖反应,用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)双染色法检测脾细胞凋亡率。结果 egG1Y162疫苗免疫组小鼠在第2周免疫后检测到抗体,在免疫第10周,抗体滴度可达到1∶25 600。血清抗体IgG在免疫第2~10周不断升高,并在免疫第10周达到最高水平。MTT法显示egG1Y162疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外能被egG1Y162疫苗特异性刺激增生。疫苗刺激后疫苗组增殖水平显著高于对照组、佐剂组和正常组(P<0.05)。AnnexinV-FITC和PI双染色法结果显示实验组小鼠脾细胞原液和ConA刺激细胞凋亡发生率均显著低于对照组(P< 0.01),每组ConA刺激脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液培养(P< 0.01)。结论 细粒棘球绦虫egG1Y162疫苗可诱导小鼠产生高效价抗体并可刺激脾淋巴细胞增殖活化、抑制脾细胞凋亡,特异性抗体反应和脾淋巴细胞增殖活化促进机体产生体液免疫反应和细胞免疫反应,共同协调诱导机体产生免疫应答反应。