p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体。方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察。结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中。结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具。     

EV71临床毒株分离及其VP1单克隆抗体制备

目的 对手足口病肠道病毒71型 (EV71) 流行临床株进行分型和鉴定,制备抗EV71外壳蛋白VP1的特异性单克隆抗体,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法 从患者咽拭子中分离出流行的EV71毒株,原核表达纯化该毒株EV71 VP1衣壳蛋白,以此蛋白为免疫原制备VP1的特异性小鼠单克隆抗体,采用免疫荧光法（ELISA）观察抗体能否特异性识别EV71感染的细胞。结果 测序结果显示分离出的EV71病毒株为肠道病毒C4亚型。筛查出12株分泌针对VP1蛋白的抗体杂交瘤细胞株,将其中结合特异性和结合力最强的一株命名为11T12。复苏的11T12活化后接种于液体石蜡免疫的小鼠腹腔,收集腹水经过protein-G柱纯化后对抗体的效价进行ELISA评价,结果显示纯化抗体稀释10万倍后仍可以结合蛋白,证实成功制备了抗EV71 C4亚型外壳蛋白VP1单克隆抗体。抗体结合特征分析结果显示该抗体具有特异性识别能力。结论 从感染的临床样本中分离到一株C4型EV71毒株,以该病毒VP1蛋白为免疫原获得一株相应的单克隆抗体11T12,该单克隆抗体的获得为病毒的检测、试剂盒的研发提供了核心材料。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

夫西地酸钠抗肠道病毒EV-A71的活性分析

目的 分析夫西地酸钠在细胞水平上的抗肠道病毒活性并分析其抗EV-A71的作用机制。方法 通过空斑分析测定夫西地酸钠在RD细胞中抗EV-A71和CV-A16的量-效曲线;通过加入时间分析（time of addition）、病毒吸附及内吞实验、反转录-定量PCR（RT-qPCR）测定病毒RNA水平在复制周期中的变化、携带GFP的病毒RNA（EV-A71-GFP RNA）转染合并荧光观察以及双报告基因分析初步确定夫西地酸钠阻断EV-A71复制的作用机制。结果 夫西地酸钠可以显著抑制EV-A71和CV-A16在RD细胞中的复制,MOI为0.001时IC₅₀ 分别为3.56 μmol/L和5.41 μmol/L。夫西地酸钠抑制EV-A71复制主要发生在复制早期阶段,降低了病毒RNA的丰度和病毒蛋白的合成水平,但不影响病毒的吸附和内吞;与未经药物处理的对照组相比,EV-A71感染5 h和8 h时,夫西地酸钠导致EV-A71 RNA相对丰度降低了大约70%;EV-A71-GFP RNA在292A细胞中的翻译明显受到夫西地酸钠的抑制,GFP阳性细胞明显减少;夫西地酸钠对EV-A71 5′-UTR所驱动的报告基因翻译抑制程度为30%。结论 夫西地钠酸具有抗肠道病毒活性,主要通过直接或间接抑制病毒基因组RNA复制以及干扰病毒蛋白合成或加工而发挥抗EV-A71活性。     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

膀胱平滑肌细胞乙酰胆碱M3受体干扰RNA慢病毒载体的构建

目的 构建膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle cells,BSMCs） M₃型受体干扰RNA慢病毒载体。方法 合成4条M₃受体干扰序列,构建GV118-sh-M₃慢病毒载体,测序验证序列。将GV118-sh-M₃慢病毒载体与质粒pHelper1.0、pHelper 2.0三个载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用荧光法检测4组病毒滴度。体外原代培养BSMCs,4组GV118-sh-M₃慢病毒（KD1、KD2、KD3和KD4）转染BSMCs,观察绿色荧光蛋白表达并通过RT-PCR、Western blotting法检测各组干扰效率。结果 成功构建4个GV118-sh-M₃慢病毒载体,测序结果符合设计序列。4组GV118-sh-M₃慢病毒滴度分别为2×10⁸、6×10⁸、5×10⁸和5×10⁸ TU/mL。分别转染BSMCs后,KD1组绿色荧光蛋白表达量最高且干扰效率最高。结论 成功包装并筛选了GV118-sh-M₃慢病毒载体,为后续进一步研究干扰M₃受体在神经源性膀胱中的作用奠定了基础。     

微小RNA-181a在肝癌组织的表达及其对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 探讨微小RNA-181a在肝癌组织的表达水平及其对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 选取西安市第九医院2016年8月—2018年3月的肝癌患者68例作为观察组。荧光定量PCR检测比较微小RNA-181a的表达水平。培养肝癌细胞hepG2,通过转染的方法使hepG2内的微小RNA-181a进行过表达（过表达组）和抑制表达（低表达组）,用CCK-8法检测体外细胞48 h内的扩增情况,裸鼠活体成像检测体内的扩增情况。Western-blot检测生长因子EGF、VEGF和TGF-β的表达量。Transwell验证微小RNA-181a的表达对细胞侵袭能力的影响。结果 与对照组肝组织相比,观察组肝癌组织的微小RNA-181a的表达量更低（P<0.05）。第24小时开始,过表达组的细胞增殖率低于正常表达组和低表达组,低表达组裸鼠体内的荧光强度高于正常表达组和高表达组（P<0.05）。低表达组EGF、VEGF和TGF-β的蛋白表达量高于正常表达组和过表达组（P<0.05）。48 h后,低表达组（51个/cm²）侵入细胞的数量多于正常表达组（35个/cm²）,多于过表达组的12个/cm²。结论 微小RNA-181a的表达水平能够调控肝癌细胞的增殖速率和侵袭能力。     

干扰EV71病毒2Apro基因的siRNA具有潜在的抗病毒作用

目的: 探讨以肠病毒71(entrovirus 71, EV71) 2A蛋白酶(2Apro)基因为靶序列合成的siRNA是否具有潜在的抗病毒作用。方法: 用Lipofectamine 2000脂质体分别将40、60、80 nmol/L FITC标记的BLOCK iT Fluorescent Oligo转染RD细胞,通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率。将化学合成的3个siRNA 2Apro (siRNA 69、294、319)和阴性对照的乱序si RNA(siRNA SCS)转染RD细胞,siRNA 2Apro为实验组,siRNA SCS为阴性对照组,另设模拟转染组,仅用脂质体处理;用EV71分别感染各组RD细胞,观察细胞形态学改变,荧光定量PCR和蛋白质印迹检测病毒RNA和VP1蛋白。结果： 当siRNA浓度为60 nmol/L时转染效率最高,达87%。细胞形态学结果显示,与对照组比较,实验组细胞只发生了轻微的病变。荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示,siRNA 2Apro组的病毒RNA和VP1蛋白明显低于对照组(P<0.01)。结论： 以EV71 2Apro基因为靶序列化学合成的siRNA能有效地抑制病毒的复制。     

肠道病毒71型能诱导THP-1巨噬细胞的自噬和凋亡

目的 探讨肠道病毒71型（EV71）诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡及其相关信号通路。方法 设置EV71处理组和DMEM对照组,EV71处理组是用感染复数0.1感染THP-1巨噬细胞2、8和16 h,对照组是用DMEM培养基作为阴性对照即是0 h组。CCK-8检测EV71对THP-1巨噬细胞增殖和毒性的影响;荧光定量PCR法检测EV71在细胞内病毒核酸变化情况;透射电镜观察THP-1巨噬细胞内超微结构变化;Hoechst 33342染色法和AnnexinV/PI 双染法检测EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡的情况; 免疫印迹法分析EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡相关蛋白水平的变化;用3-MA和Ac-DEVD-CHO抑制剂分别检测EV71对THP-1巨噬细胞自噬和凋亡的影响。结果 EV71作用THP-1巨噬细胞2、8和16h的细胞存活率逐渐下降（P<0.05）;细胞内病毒核酸拷贝数逐渐增多（P<0.01）;可见细胞内自噬小体和病毒颗粒;总细胞凋亡率逐渐增加（P<0.01）;与对照组比较,EV71处理组LC3转化量（LC3-II/LC3-I）逐渐增多,而p62蛋白逐渐减少,cleaved caspase 3蛋白增多,Bcl-2和caspase-3蛋白减少（P<0.01）,而cleaved caspase-8无差异（P>0.05）;与PBS对比,在8 h时3-MA明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬,LC3-II/LC3-I比值减少,而p62蛋白增多（P<0.01）;与DMSO对比,Ac-DEVD-CHO明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡,凋亡率分别为15.5%和7.7%（P<0.01）。结论 EV71能感染THP-1巨噬细胞并在其中复制,且能诱导自噬和凋亡,其可能与激活LC3/p62自噬途径和caspase凋亡途径有关。     

缺硒饲养ICR小鼠加快肠道病毒71型在体内的复制研究

目的观察硒蛋白对手足口病病原体肠道病毒71型（EV71）在感染动物体内复制的影响情况。方法将30只雌性ICR小鼠分为常规饲料组、缺硒饲料组和加硒饲料组,各种饲料饲养小鼠6周后,通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP—MS）测定小鼠外周血中硒的含量以及荧光定量PCR方法测定动物体内肠道病毒EV71的载量．然后用病毒空斑实验测定病毒滴度并用酶促法来测定主要硒蛋白酶的活性。结果通过测定外周血中硒的含量发现,缺硒饲料组的ICR小鼠硒含量为0．081μg／g,显著低于常规饲料组0．135μg／g和加硒饲料组的0．128μg／g,差异有统计学意义（P〈0．01）;用荧光定量PCR方法测定EV71载量,加硒饲料组ICR小鼠体内EV71核酸扩增Ct值,明显高于缺硒饲料组（P〈0．05）;ICR小鼠体内主要硒蛋白酶（GPX1）的活力在缺硒饲料组的动物体内显著低于加硒饲料组：病毒空斑实验结果表明,缺硒饲料组的ICR小鼠体内EV71病毒复制活力显著高于其他两组。结论缺硒可能导致硒蛋白GPX1合成减少或其活力降低从而加快EV71在宿主内的复制。     

Transfection and expression of HCV-NS5B gene in Huh-7 cells

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＮＳ5ＢｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ ,ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｎｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ 5Ｂ(ＮＳ5Ｂ)ｉｎＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｒｅｗｅｒｅＮＳ5Ｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎ…     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.