诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB 、5-氮胞苷(5-aza)及SalB联合5-aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞,收集条件培养液对其进行分组诱导:①SalB(终浓度为250 μg/L),②5-aza组(终浓度为10 μg/L),③SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液,⑤未加诱导剂的阴性对照组.选取MSCs进行诱导,诱导周期为4 w.倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4 mRNA的相对表达量.结果 细胞形态学显示,诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示,诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低,SalB联合5-aza组蛋白表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示除阴性对照组外,其他四组表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组.结论 SalB联合5-aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT;上调心肌早期基因NKX2.5、GATA-4mRNA的表达,证实其能够向心肌细胞分化能力;条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白,不能诱导其分化.     

间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导研究

间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞,能在多种诱导条件下形成心肌细胞。化学因素:化学小分子可以通过改变间充质干细胞DNA甲基化和组蛋白修饰(乙酰化、甲基化和磷酸化等)等表观遗传特性;物理因素:电磁场和力学因素可以诱导间充质干细胞;生物因素:生长因子、激素等对心肌细胞的发育起着重要作用等这些诱导条件,在体外环境下成功诱导间充质干细胞分化为心肌细胞。该文阐述不同的诱导条件对间充质干细胞向心肌细胞分化的影响和相关机制。     

骨髓基质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

骨髓基质干细胞不仅有一定的自我更新能力,可以分化为骨、软骨和脂肪等多种类型的基质细胞,在一定外界环境条件下还能实现跨系统分化,分化成心肌细胞,是目前认为较有希望成为心肌梗死替代治疗的干细胞。现就骨髓基质干细胞的生物学特性、向心肌细胞分化的诱导因素及临床应用进展进行综述。     

体外模拟心肌微环境下骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 :探讨粒细胞集落刺激因子 （G CSF）和干细胞因子 （SCF）预处理对骨髓间充质干细胞 （MSCs）向心肌细胞分化的影响。方法 :MSCs均采用全骨髓法提取 ,通过换液传代逐渐纯化细胞 ,取传 4代的MSCs,在共培养前用DAPI标记 ,心肌细胞在培养的第 3d与MSCs共培养。对照组 :未施加任何干预的MSCs与心肌细胞共培养 ;实验组 :联合使用G CSF和SCF对大鼠在体动员 ,提取其MSCs与心肌细胞共培养。共培养前测定心肌细胞的活力 ,在共培养第 3、4、5d用免疫荧光标记肌钙蛋白T ,分析DAPI MSCs向心肌细胞分化的百分率。结果 :在共培养的第3、4、5d ,G CSF和SCF处理的DAPI MSCs的分化率分别为 （1.2 4± 0 .16 ） %、（3.4 6± 0 .2 1） %、（7.2 1± 0 .11） % ,均显著高于对照组的 0、（1.2 7± 0 .13） %、（1.32± 0 .2 5 ） %。结论 ::G CSF和SCF对MSCs具有促分化作用。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 获取成年大鼠胫骨干骨髓，采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代，观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果 大鼠骨髓基质细胞贴壁旱集落生长，5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞（MSCs）的生长特点及在体外诱导条件下分化为神经元样细胞的能力，并寻找最佳诱导时间。方法无菌条件下，收集大鼠股骨骨髓，分离出MSCs进行培养、扩增、纯化。用神经妥乐平（NT）进行诱导。在不同时间用巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色鉴定阳性细胞。结果MSCs经诱导后呈神经元样形态。免疫组化鉴定显示Nestin阳性细胞表达在诱导第3天时最多，为48．20％±5．61％，NSE阳性细胞表达在第5天时最多，为31．50％±7．32％。结论MSCs在体外诱导条件下可经神经前体细胞转化为神经元样细胞，且第5天为最佳诱导时间。     

永生型骨髓间质干细胞体外诱导为心肌样细胞的实验研究

目的　采用骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞 ,为心力衰竭的干细胞移植治疗提供新的细胞材料。方法　抽取贵州香猪骨髓液 3ml,按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞 ,连续传代 4个月 ,得到永生型细胞 ,经 5 氮胞苷 (5 azacytidine)刺激后 ,进行RT PCR ,基因测序 ,免疫组化 ,电镜超微结构鉴定。结果　骨髓间质干细胞经 5 氮胞苷刺激后 ,部分细胞呈梭形。RT PCR ,基因测序结果表明细胞有心房利钠肽 (ANP) ,脑利钠肽 (BNP) ,心肌特异性肌球蛋白重链 (cardiac MHC) ,β肌球蛋白重链 (beta MHC) ,α骨骼肌肌动蛋白 (α skeletalactin)表达 ,结蛋白 (desmin) ,肌球蛋白重链 (MHC) ,心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ (cTnTⅠ )免疫组化阳性。电镜示梭形细胞有明显的肌丝 ,细胞核呈单椭圆形 ,位于细胞中央。结论　骨髓间质干细胞经 5 氮胞苷刺激后 ,从基因 ,蛋白 ,超微形态上已有心肌细胞特点 ,表明在体外环境下可向心肌细胞转化 ,有望成为心力衰竭干细胞移植治疗的细胞材料     

机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究

目的研究机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的影响。方法诱导多能干细胞形成拟胚体后将拟胚体分为四组:对照组(未行牵张处理),牵张组1(5-6天行24小时牵张),牵张组2(5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张),牵张组3(5-6天行24小时牵张,7-10天再行72小时牵张),通过对小鼠诱导多能干细胞施加20%形变率的机械牵张力后,于第15天,分别计数每组跳动克隆数目从而初步在上述四组中选出诱导效率最高组,此后用荧光免疫染色、Westernblot、RT-PCR和激光共聚焦法,进一步鉴定对照组和初步筛选出的牵张组最终分化效率和细胞成熟度差异。结果机械牵张刺激下,分化15天时,牵张组2的跳动克隆数上升(P<0.05),初步筛选出牵张组2可以提高分化效率;统计α-MHC免疫荧光染色面积发现牵张组2是对照组的2.1倍(P<0.05);牵张组2TroponinI的蛋白表达量为对照组的1.7倍(P<0.05);半定量PCR结果发现,心肌细胞标志基因β-MHC,MLC-2v及心肌细胞早期转录因子Nkx2.5的表达量分别提高了6.7倍、4.4倍和11.4倍(P值均<0.05);激光扫描共聚焦显微镜对分化来的单个心肌细胞进行α-actinin观察发现,牵张组2有利于心肌细胞的伸展和成熟。结论初步验证机械牵张力作为一种刺激诱导因素,20%拉伸形变率,牵张组2(贴壁的拟胚体5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张)的处理方法可以显著促进诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率,为以后的深入研究和临床应用提供了实验基础。     

脂肪组织来源基质细胞的心肌样细胞分化

脂肪组织来源基质细胞具有多向分化潜能、易获得性、易于分离培养和较强的再生能力等突出优点,已成为一种新的组织工程干细胞来源.现就脂肪组织来源基质细胞生物学特性、影响分化因素、向心肌样细胞分化及治疗缺血性心脏疾病等方面进行综述.     

三七皂甙治疗脑血管病的研究进展

脑卒中的发病率高于心脏病和癌，居三大死因之首位，开发保护脑组织缺血性损伤的药物是亟待解决的问题。脑缺血后脑细胞内Ca^2＋超载，通过各种途径加重脑损伤，缺血后Ca^2＋内流是缺血性脑损伤的共同经路^[2]。Ca^2＋通道阻滞剂具有脑保护效应，可阻滞Ca^2＋内流，进而减少兴奋性氨基酸的释放和减少氧自由基的产生。目前尚无成熟的治疗方案来防止卒中的发生及神经功能的丧失。     

体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的:体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化(BMSCs)为肝样细胞,提高分化效率.方法:将第一代BMSCs随机分为诱导组和对照组.诱导组加肝细胞生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、抑瘤素M等进行诱导培养,观察细胞形态,检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(A1b)、细胞角蛋白18(CK18)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和细胞色素P450 2b9(CYP2b9)的mRNA表达,A1b合成以及A1b和CK18蛋白标记细胞阳性率.结果:诱导组第3天出现多边形细胞,5—7d上皮样细胞呈岛状分布,14 d呈铺路石状.对照组细胞为长梭形.第7,14,21天,诱导组细胞AFP,A1b,CK18 mRNA和A1b蛋白检测阳性;第14,21天,细胞表达TAT和CYP2b9 mRNA.对照组除AFP mRNA呈弱阳性外,其余均为阴性.第7,14,21天,诱导组CK18阳性率分别为71.4%.75.9%,80.6%:A1b阳性率分别为75.0%,79.7%.81.1%.而对照组第7天CK18和A1b阳性率仅2.3%,1.7%,与诱导组相比有显著差异(P_(CK18)=1.97×10~(-5),P_(A11b)=3.08×10~(-6)).结论:BMSCs在体外可以被诱导分化为肝样细胞,诱导率最高可达80%以上.     

骨髓基质干细胞向肝细胞的定向分化及体内移植

目的:研究骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外向肝细胞的定向分化和体内移植后对小鼠受损肝脏的修复作用.方法:在体外培养体系中用肝细胞提取液(HE)模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学和吲哚靛青绿(ICG)染色检测其分化程度.将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs移植入小鼠体内,免疫组织化学方法显示BMSCs在肝脏的分布,血清酶学检测肝脏受损小鼠移植后7,14,28d谷草转氨酶(AST,nkat/L)、谷丙转氨酶(ALT,nkat/L)和碱性磷酸酶(AKP,nkat/L)的含量变化.结果:在体外BMSCs可由HE诱导分化成肝细胞,但HE诱导组α1-抗胰蛋白酶(4d:52.5±3.9vs76.8±4.5,P<0.05;14d:60.3±6.1vs85.4±7.6,P<0.05;21d:80.5±8.0vs105.7±8.6,P<0.05)和白蛋白(4d:43.2±6.5vs71.6±7.6,P<0.05;14d:61.5±10.4vs93.6±13.9,P<0.05;21d:80.6±17.1vs128.3±22.2,P<0.05)表达量少于HGF诱导组;体内移植后BMSCs整合于肝实质内;肝脏受损小鼠移植BMSCs后,血清中ALT(7d:493.43±120.02vs696.81±140.03,P<0.01;14d:558.45±130.03vs780.16±151.7,P<0.01;28d:583.45±138.36vs880.18±170.53,P<0.01)、AST(7d:1521.97±186.7vs2342.14±208.38,P<0.01;14d:1590.32±200.04vs2692.21±238.38,P<0.01;28d:1625.33±208.38vs2872.24±281.72,P<0.01)和AKP(7d:1.24±0.22vs1.78±0.18,P<0.01;14d:1.21±0.21vs2±0.19,P<0.01;28d:1.32±0.19vs2.27±0.2,P<0.01)比损伤组小鼠相应值均有下降,但仍高于正常对照组.结论:BMSCs在体外可由HE诱导分化成肝细胞,在体内移植后可促进小鼠受损肝脏的修复.     

Differentiation of rat bone marrow stem cells in liver after partial hepatectomy

AIM: To investigate the differentiation of rat bone marrow stem cells in liver after partial hepatectomy. METHODS: Bone marrow cells were collected from the tibia of rat with partial hepatectomy, the medial and left hepatic lobes were excised. The bone marrow stem cells (Thy CD3-CD45RA- cells) were enriched from the bone marrow cells by depleting red cells and fluorescence-activated cell sorting. The sorted bone marrow stem cells were labeled by PKH26-GL in vitro and autotransplanted by portal vein injection. After 2 wk, the transplanted bone marrow stem cells in liver were examined by the immunohistochemistry of albumin (hepatocyte-specific marker). RESULTS: The bone marrow stem cells (Thy CD3-CD45RA- cells) accounted for 2.8% of bone marrow cells without red cells. The labeling rate of 10μM PKH26-GL on sorted bone marrow stem cells was about 95%. There were sporadic PKH26-GL-labeled cells among he-patocytes in liver tissue section, and some of the cells expressed albumin. CONCLUSION: Rat bone marrow stem cells can differentiate into hepatocytes in regenerative environment and may participate in liver regeneration after partial hepatectomy.     

兔骨髓基质细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的方法

目的 探讨将骨髓基质细胞（MSCs）诱导成为胰岛素分泌细胞（IPCs）的方法。方法 体外培养新西兰兔骨髓及胰腺基质细胞和SD大鼠胰腺基质细胞，利用含有胰腺基质细胞培养基的混合培养基诱导培养MSCs。结果 以兔及SD大鼠胰腺基质细胞培养基均可诱导兔MSCs生成IPCs。结论 兔及SD大鼠的胰腺基质细胞培养基均可将兔MSCs诱导分化为IPCs。     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为肠神经细胞的体外研究

目的探讨不同方法诱导大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)分化为肠神经细胞的可能性,并探索适宜的诱导方法。方法体外培养并鉴定BMSC,流式细胞法检测CD90和CD45。传代至第6代后行神经诱导分化。先以10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导24h,然后分2组：胶质细胞源神经营养因子(GDNF)组以10ng/ml GDNF,在胎肠培养基(FGCM)条件下诱导10d；维甲酸组以0．5 mmol/L维甲酸、10μmol/L ZnSO_4和FGCM诱导10d。免疫荧光法检测神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、蛋白基因产物(PGP9．5)、一氧化氮合酶(nNOS)和血管活性肠肽(VIP)的表达。所得数据行t检验。结果流式细胞检测BMSC呈高表达,其标志为CD90,而不表达造血细胞标志CD45。诱导10d后,GDNF组和维甲酸组均有部分细胞在形态上表现出神经元样改变,免疫荧光染色NSE、NF、PGP9．5、nNOS、VIP阳性,GFAP阴性。GDNF组NF、PGP9．5、nNOS、VIP阳性比例显著高于维甲酸组(75．6％±8．4％比48．5±7．5％；57．7％±6．5％比35．7％±7．2％；46．6％±5．4％比30．5％±6．6％；72．3％±6．7％比40．4％±7．4％；P＜0．01)。结论在体外BMSC可被诱导分化为肠神经样细胞并表达肠神经递质,GDNF在胎肠培养基条件下诱导肠神经样细胞比例高于维甲酸。     

犬骨髓基质干细胞体外诱导分化为肌源性细胞的研究

目的 :探讨成年犬骨髓基质干细胞 (MSSCs)体外诱导分化为肌源性细胞的可行性。方法 :用贴壁法体外分离MSSCs ,实验组 5 氮胞苷诱导 ,对照组加入等量的培养基 ,用相差显微镜、免疫组织化学和电镜方法观察、鉴定培养细胞。结果 :实验组培养细胞诱导后 4周 ,多数培养细胞由梭形变为杆状 ,免疫组织化学检查结蛋白、平滑肌肌动蛋白和肌钙蛋白Ⅰ染色阳性 ;对照组多数培养细胞为梭形 ,免疫组织化学检查结蛋白染色弱阳性 ,平滑肌肌动蛋白染色弱阳性 ,肌钙蛋白Ⅰ染色阴性 ;电镜下实验组培养细胞内可见肌丝样结构 ,对照组培养细胞无明显肌丝样结构。结论 :成年犬MSSCs体外可诱导分化为肌源性细胞。     

利拉鲁肽诱导骨髓间充质干细胞定向分化及移植治疗1型糖尿病大鼠的研究

目的 体外研究利拉鲁肽诱导骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分化为胰岛素分泌细胞（IPCs）,并在体内进一步观察IPCs移植对1型糖尿病（T1DM）大鼠的治疗作用.方法 （1）体外采用密度梯度离心联合差壁培养法分离、纯化大鼠BM-MSCs,进一步分为未诱导组、高糖＋尼克酰胺诱导组、胰高血糖素样肽1（GLP-1）诱导组和利拉鲁肽诱导组;（2）倒置显微镜下观察各组细胞形态变化,双硫腙染色鉴定诱导后细胞,荧光定量PCR检测巢蛋白（Nestin）、胰十二指肠同源盒1（PDX-1）、葡萄糖转运蛋白2（Glut-2）、葡萄糖激酶（GK）、胰岛素和胰高血糖素等基因,细胞免疫荧光检测胰岛素和胰高血糖素等蛋白;（3）将180 ～ 220 g的30只雄性SD大鼠以60 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素制备T1DM模型,造模成功后按随机数字表法分为对照组（T1DM组,n=8）、未诱导的BM-MSCs移植组（BM-MSCs组,n=9）和经利拉鲁肽诱导的BM-MSCs移植组（LIRA＋ BM-MSCs组,n=9）,给予相应干预8周,待血糖基本稳定后,选取4只正常、同龄、雄性SD大鼠作为对照,行腹腔注射的葡萄糖耐量试验（IPGTT）进一步观察移植后细胞对高糖刺激的反应性.结果 （1）利拉鲁肽诱导后BM-MSCs形态逐渐变圆,呈明显的聚集性生长状态,双硫腙染色为阳性;与高糖＋尼克酰胺诱导组比较,利拉鲁肽诱导组细胞Nestin mRNA表达下调（0.003 8±0.000 4比0.007 5±0.003 0,P＜0.05）,胰岛素（0.000 20±0.000 03比0.000 08±0.000 02）和胰高血糖素（0.001 1±0.0004比0.000 7±0.000 1）等mRNA表达上调（F=7.26、10.06、4.92,均P＜0.05）,PDX-1、Glut-2、GK mRNA表达亦上调;利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组细胞胰岛素或胰高血糖素蛋白表达均呈阳性.（2）体内实验示,与T1DM组比较,LIRA＋ BM-MSCs组和BM-MSCs组大鼠8周末血糖均明显降低[分别为（28.0±1.2）、（8.9±1.1）、（14.5±0.9）mmol/L,F=719.61,均P＜0.05];IPGTT提示移植IPCs后的大鼠血糖在30 min时升至峰值,150 min时降至空腹水平,血糖变化曲线与正常组类似.结论 体外利拉鲁肽可以在一定程度上促进BM-MSCs分化成为IPCs,且移植后的IPCs能够在体内进一步发挥降糖作用.     

小鼠骨髓基质细胞成内皮细胞分化及其缺血区存活能力研究

目的 探讨体外培养的骨髓基质细胞的部分生物学特性、成内皮细胞分化能力及在缺血区存活能力？方法 2005年1月至11月，第三军医大学新桥医院全军心血管内科中心分离5～6周龄的小鼠胫骨、股骨，预冷的DMEM／F12培养基冲洗出骨髓，密度梯度离心分离出骨髓单核细胞，接种后12～16d形成单层贴壁的成纤维样细胞：体外诱导分化鉴定分离的细胞：建立下肢缺血模型，荧光标记的体外扩增的骨髓基质细胞被移植入缺血组织，移植后1周，荧光显微镜及HE染色，检查荧光强弱分布与HE染色密度的时空关系。结果 体外传代培养的基质细胞诱导后分泌NO，移植1周在缺血区检测到大量荧光阳性细胞存活。结论在本实验条件下，体外培养的骨髓基质细胞生长稳定，传代后的细胞增殖较快，表现出较早期细胞特点，在体外能分化为血管内皮细胞，可望用作缺血性心脏病的细胞治疗的供体细胞。     

骨髓间充质干细胞定向诱导为肝细胞的研究进展

肝细胞移植治疗、肝组织工程以及生物人工肝等新兴技术的发展,为肝病患者带来了新的治疗方案;不过,这些新技术应用时会遇到一个共同的瓶颈--细胞来源不足.虽然肝细胞可以有多种来源,但是以干细胞的发展最为迅猛,随着近年来干细胞分离、培养、鉴定及其增殖技术的发展和成熟,利用干细胞解决肝细胞的来源问题已经引起了广泛关注.此文总结了骨髓间充质干细胞诱导为肝细胞的研究现状、可能影响因素以及分化机制.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞样细胞

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及特异性诱导为肝细胞样细胞的能力。方法 骨髓标本来源于健康志愿者的胸骨,年龄2～35岁,采用淋巴细胞分离液(密度1.077)分离人MSCs,并分别采用HGF、FGF4、HGF FGF4以及无生长因子四种处理因素体外诱导第三代人MSC向肝细胞样细胞分化。通过流式细胞术分析鉴定.MSCs的纯度,于诱导培养的0、7、14、21、28天时留取细胞检测CK18、AFP和白蛋白的表达情况,同时进行糖原染色验证细胞功能。结果 用淋巴细胞分离液分离出的人MSCs纯度可达90％,采用HGF、FGF4及HGF FGF4三种处理因素均可在体外诱导人MSCs特异分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的细胞。结论 人MSCs能在体外扩增并定向诱导为肝细胞样细胞。