血管内皮生长因子治疗缺氧缺血性脑损伤的研究进展

血管内皮生长因子(VEGF)是一种广泛存在于机体组织的细胞因子,一直作为增加血管通透性最强的物质之一被广泛研究与应用。近年来,国内外研究发现VEGF具有神经保护作用,它可以抑制脑细胞的凋亡,促进神经元、神经胶质细胞的生长、存活。不同的给药时间以及给药途径在很大程度上影响其作用的发挥。现就VEGF治疗缺氧缺血性脑损伤的研究概况予以综述。     

血管内皮生长因子基因治疗心血管疾病的研究进展

心血管病的基因治疗为不断发展的分子医学领域提供了巨大的机会和挑战。血管内皮生长因子（VEG）也称血管内皮致有丝分裂国子，发现20余年来，对它的认识进展较快。对其基因、转基因治疗的研究近来有了新的较大进展。临床应用VEGF基因治疗选择性心血管疾病正在不断地接近实现。IVEG及其基因的特性80年代由Dvorak等发现的＼qZGF，起初被认为是一种使血管渗漏的因子，并取名为血管渗透因子。80年代后期又有人发现它有强力的血管生成作用一刺激内皮细胞移行和复制一l。VE（｝F是一种热稳定的二聚蛋白，许多细胞能产生＼工GF。在缺氧组…     

腺病毒介导的血管内皮生长因子165对兔外周血管生成作用的研究

目的：检验以腺病毒为载体的 血管内皮生长因子165（Ad-VEGF165)基因的表达规律及能否促进缺血骨骼肌血管生成。方法：将兔右股动脉离断后,在缺血肌肉组织中直接注入Ad-VEGF165或磷酸盐缓冲液（PBS）,5周后,以血管造影、免疫组化检查及单光子发射计算机断层（SPECT）显像检测局部缺血组织血管新生情况。用酶联免疫分析法（ELISA）检测血浆和肌肉组织中Ad-VEGF165的表达。结果：Ad-VEGF165注入缺血肌肉组织后24h达到表达高峰,1周时降至基线水平,血浆及对侧健康的肌肉组织中无目的基因表达,治疗缺血肢体侧枝血管（P＜0．01）、血管密度（P＜0．05）及相对血流（P＜0．01）均明显高于对照组。结论：缺血肌肉组织中直接注入Ad-VEGF165可诱导局部VEGF蛋白表达,促进缺血部位的血管生成,增加血流量。     

3日龄大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织VEGF表达变化探讨

目的:探讨3日龄未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑白质中VEGF的表达变化规律,研究VEGF在早产儿脑损伤发病机理中的作用,为干预治疗打下理论基础。方法:92只体重6.5～10.5g新生3日龄SD大鼠,随机分为实验组(缺氧缺血)50只和对照组(假手术)42只,实验组死亡10只,对照组死亡2只,故进入实验的两组均为40只。实验组大鼠右侧颈总动脉结扎,术后予以低氧(6%O2+94%N2)处理4h,以建立动物模型。对照组仅分离右侧颈总动脉,不予以结扎和缺氧处理。术后12、24、48、72h及7d处死8只大鼠,取脑组织,制备光镜石蜡标本。VEGF的表达采用免疫组化方法。采用全自动图像分析系统分析VEGF阳性单位表达的AU值。结果:对照组和实验组大鼠神经元、内皮细胞、软脑膜细胞、胶质细胞等均可见VEGF表达。表达变化以胼胝体和脑室周围白质部位明显。对照组VEGF的表达较弱,且随时间的增加,表达没有明显变化,组间比较差异无统计学意义(P0.05)。实验组于缺氧缺血12h表达开始增加,缺氧缺血24h表达达到高峰,7d时恢复至正常,组间各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。实验组VEGF的表达在12、24、48、72h与对照组比较差异有统计学意义(P0.05),7d与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤中,VEGF蛋白的表达于缺氧缺血12h开始增加,于24h达到高峰,7d降至正常,说明VEGF在其发病机制中有一定作用。     

大鼠心肌缺血的血管内皮生长因子基因治疗

目的：应用血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）基因治疗心肌缺血,方法：雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠２０只,结扎冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。心脏多点注射构建的ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链反应,ＶＥＧＦ免疫组织化学染色,心肌碱性磷酸酶染色及血管计数等方法检测了ＶＥＧＦ基因在缺血心肌中的表达及生物学作用。     

新生儿缺氧缺血性脑病血清及脑脊血管内皮生长因子的变化

目的观察缺氧缺血性脑病（HIE）患儿血清及脑脊液（CSF）血管内皮生长因子（VEGF）的动态变化,探讨其与疾病早期诊断、病情程度及预后的相关性。方法确诊为HIE的足月新生儿60例（轻度组20例、中度组20例、重度组20例）,对照组20例,为同期入院的无窒息、无缺氧缺血疾病,需排除颅内感染而行腰穿CSF检查的新生儿。60例HIE患儿及20例对照组新生儿均于入院时按照腰椎穿刺的常规操作各采集CSF标本1ml,同时各抽取静脉血1ml,采用酶联免疫法检测血清及CSF中VEGF。结果3组HIE患儿血清VEGF含量均明显高于对照组（P〈0．01）,不同程度HIE患儿血清VEGF含量差异也均有统计学意义,随着病变程度的增加而升高;各组HIE患儿及对照组患儿CSF中VEGF含量差异无统计学意义（P〉O05）;HIE患儿CSF中VEGF与血清中VEGF含量无显著相关（t=0.181,P〉0．05）。结论血清VEGF的高表达对HIE的早期诊断、病情程度判断及预后评估具有重要参考价值,而CSF中VEGF含量与HIE的病情无关。     

血管内皮生长因子基因治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究

应用血管内皮生长因子 (VEGF) ,对肢体缺血性疾病进行基因治疗的实验性研究 ,同时寻找适用于临床的、有效衡量肢体血液循环状况的检测指标。应用股动脉及其分支分离剔除术 ,造成新西兰兔下肢闭塞性血管病模型 ,术后立即于缺血骨骼肌部位多点注射 pcDNA3 .1 /VEGF16 5质粒 (n =1 2只 ) ,pcDNA3 .1空质粒 (n =8只 ) ,生理盐水(n =2 2只 )。选取不同时间点 ,行颈动脉插管造影 ,测量胫动脉压 ,检测双后肢膝关节的单位时间血流量、血流速度和红细胞浓度 ,检测肝肾功能 ,并进行病理取材 ,观察病理变化。结果显示 :术后对照组出现肢体缺血性坏死的动物数明显多于基因治疗组 ;血管造影显示 ,术后基因治疗组远端动脉充盈早于对照组 ,新生血管数目也明显多于同时期对照组 ;VEGF基因治疗组术后动脉血压的恢复也较对照组快。病理切片观察对照组骨骼肌出现萎缩坏死、间质纤维组织增生等缺血性病理改变的程度较基因治疗组重 ,质粒组新生血管明显多于对照组。结果提示 :利用肌肉细胞能够自主摄取裸DNA的特性 ,用重组VEGF质粒进行基因治疗 ,有效改善了缺血肢体的血液供应 ,并未出现严重不良反应     

血管内皮生长因子165反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 探讨应用血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）反义ＲＮＡ治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建和鉴定反义ＶＥＧＦ１６５真核表达载体;将其转染入人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ４４,检测其转染前、后的生物学性状;比较转染前、后ＳＨＧ４４细胞的裸鼠皮下致瘤性;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果 成功构建反义ＶＥＧＦ１６５真核表达载体并在ＳＨＧ４４细胞获得表达,该细胞     

大鼠心肌缺血的血管内皮生长因子基因治疗

目的：应用血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ, ＶＥＧＦ） 基因治疗心肌缺血。方法：雄性Ｗｉｓｔａｒ 大鼠２０ 只,结扎冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。心脏多点注射构建的ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链反应,ＶＥＧＦ免疫组织化学染色,心肌碱性磷酸酶染色及血管计数等方法检测ＶＥＧＦ 基因在缺血心肌中的表达及生物学作用。结果：转移ＶＥＧＦ基因后在大鼠缺血心肌中有ＶＥＧＦｍＲＮＡ 高表达, ＶＥＧＦ 免疫组化染色可见ＶＥＧＦ蛋白表达水平升高。心肌碱性磷酸酶染色显示,转移ＶＥＧＦ基因能够促进缺血心肌新生血管的形成。结论：ＶＥＧＦ基因能够在大鼠缺血心肌中获得表达,并发挥其促进新血管形成的作用。为ＶＥＧＦ 基因治疗心肌缺血奠定基础。     

血管内皮细胞生长因子165基因转染对兔骨缺损修复的影响

目的 构建pcDNA3．1-血管内皮细胞生长因子（VEGF）165质粒,观察其对兔骨缺损修复的影响。方法构建成重组真核表达质粒pcDNA3．1-VEGF165;采用30只新西兰大白兔,制备双侧桡骨骨缺损模型,实验组以体积等大的明胶海绵置于创腔,局部直接注射稀释的质粒液200ng;对照组以同量生理盐水代替质粒液,同法处理。于术后1、2、4、6、8和12周行X线照片后获取标本,观察缺损局部组织修复及新生血管并计算微血管密度（MVD）。结果pcDNA3．1-VEGF165质粒构建成功,测序正确。术后X线：1周时两组无明显差别,实验组2周骨痂形成、骨质修复,12周时骨质已正常,对照组表现为修复迟缓;HE染色：实验组2周大量新生血管形成、通血,4周成骨细胞大量增殖、骨小梁形成,12周骨皮质改建完成,骨髓腔再通;对照组经历过程类似,但相对时间延迟,12周时骨髓腔及皮质改建尚未完成。2周时对照组及实验组MVD分别为56．1±6．1、69．1±5．4,均较1周时42．2±6．4、47．0±7．5时增加,组间及组内间差异有统计学意义（t=8．0347,P=0．0000）。结论骨缺损局部直接应用PcDNA3．1-VEGF165质粒液后,可表达并上调VEGF165,具有促进局部微血管形成、加快骨缺损修复的作用。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子基因转移对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法携带VEGF165基因的腺病毒(Ad-VEGF165)感染PD模型大鼠纹状体后,采用大鼠旋转行为观察、免疫组织化学方法和高效液相色谱技术检测VEGF165基因转移的PD大鼠行为学变化、黑质纹状体酪氨酸羟化酶(TH)、层黏蛋白(laminin)和胶质纤维原性酸性蛋白(GFAP)的表达以及纹状体区多巴胺(DA)及代谢产物含量变化。并与重组腺病毒载体(Ad-Lacz)组及磷酸盐缓冲液(PBS)组进行比较。结果Ad-VEGF165成功感染PD大鼠并高表达目的基因和蛋白。感染Ad-VEGF165的大鼠获得行为学改善,其黑质和纹状体TH阳性细胞数和纤维密度与对侧半球的比值(0．42±0．11和0．56±0．10)高于Ad-LacZ组(0．20±0．10和0．28±0．09)和PBS组(0．22±0．13和0．24±0．08),P<0．01;纹状体区血管和胶质细胞数量均明显增多;Ad-VEGF165感染组大鼠纹状体区DA及代谢产物含量与对侧比值也高于对照组。结论Ad-VEGF基因转移能保护PD大鼠多巴胺能神经元,血管和胶质细胞的增生可能参与了VEGF对在体多巴胺能神经细胞的保护机制。     

血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础     

血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因转染的骨髓间充质干细胞(MMSC)移植治疗肺动脉高压(PH)的疗效和机制.方法 体外分离培养SD大鼠MMSC,将含有增强型绿色荧光蛋白的VEGF质粒转进MMSC.将SD大鼠随机分为4组:正常对照组、PH模型组;MMSC移植组,转基因移植组.一次性项背部皮下注射野百合碱(50 mg/kg),复制PH模型,观察21 d后,MMSC移植组及转基因移植组分别给予浓度为5×106个细胞/ml和5×105个细胞/ml的MMSC悬液1 ml静脉注射,模型组及正常组均给予等量L-DMEM液注射.移植后30 d,观察4组大鼠一般情况、生存率、右心室收缩压(RVSP)、右心室肥大指数(RVH)、血气及肺小动脉的微观结构变化.结果 移植后30 d,MMSC移植组及转基因移植组大鼠的RVSP分别为(30.2 ±2.1)和(29.2±1.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),RVH分别为(37.9 ±3.2)%和(27.2±3.4)%,肺小动脉中膜厚度(MT)分别为(21.3±3.4)和(14.3±2.8)μm,肺小动脉管腔横截面积与血管总横截面积的比值(V/T)分别为(39.3 ±4.3)%和(43.0 ±1.5)%.上述指标与PH模型组相比差异均有统计学意义(P<0.01);其中MMSC移植组与转基因移植组间RVH、MT及V/T的差异有统计学意义(P<0.05).另外,MMSC移植组与转基因移植组动脉血气各指标较PH模型组均明显改善(P<0.05).同时观察到肺内损伤血管修复和血管新牛现象.结论 转染有VEGF165基因的MMSC移植可有效减轻并逆转野百合碱诱导的PH进程,此作用较单纯移植MMSC的治疗效果更加明显.其作用机制可能与血管修复及血管新生有关.     

血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞心肌移植对心肌梗死后大鼠心功能及血管新生的作用

目的建立重组人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,探讨该细胞心肌移植对缺血性心脏病心功能及血管新生的影响,并比较联合治疗与单独基因或细胞治疗的疗效差异。方法采用密度梯度离心-贴壁培养法获取Wistar近交系大鼠MSC,用脂质体将pcDNA3.1-hVEGF165转入该细胞,通过ELISA、RT—PCR和Western印迹检测后者VEGF的表达情况;以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型,随机分成4组(每组12只),心肌梗死模型建立2周后,联合组在心肌梗死区移植转染VEGF165基因的MSC,细胞组移植等量的MSC,基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液;另取12只未结扎冠脉的大鼠为假手术组。细胞移植4周后,用Buxco系统检测心功能;然后处死动物,取心肌标本,测量心肌梗死面积;用5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)、肌钙蛋白T免疫组化双染法确定移植细胞的存活与分化;用Ⅷ因子染色法检测血管新生,RT-PCR法检测VEGF165基因的体内表达情况。结果(1)pcDNA3.1-hVEGF165基因通过脂质体转染大鼠MSC后获稳定表达;(2)移植4周后,联合组心肌梗死面积(27．8％±3．0％)明显低于细胞组(37．0％±10．1％)与基因组(37．1％±5．2％,均P<0．05),心功能改善优于细胞组与基因组;(3)联合组心肌梗死区毛细血管密度(每视野40．2个±5．5个)高于细胞组(27．2个±6．3个,P<0．01)和对照组(18．5个±5．8个,P<0．01),较基因组(35．8个±7．7个)亦有增加的趋势(P=0．189);(4)Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心肌梗死区心肌细胞数量不同程度的多于对照组;(5)联合组VEGF基因的体内表达(hVEGFmRNA相对含量0．18±0．04)高于基因组(0．10±0．03,P<0．01)。结论转染VEGF基因的MSC移植可使鼠冠脉结扎造成的心肌梗死面积缩小、心功能明显改善,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗,为缺血性心脏病的细胞基因联合治疗提供了理论依据。     

rAAV1介导血管内皮生长因子基因表达对大鼠脑缺血新生血管形成及神经功能恢复的影响

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗对大鼠脑缺血的治疗作用及其机制.方法 成年雄性SD大鼠64只,分为对照组和治疗组,每组均32只,采用立体定向微量注射的方法将相同滴度的rAAVl-VEGF(治疗组)和rAAVl-Lacz(对照组)注入大鼠侧脑室,21 d后制作大脑中动脉区缺血再灌注(MCAO)模型,于不同时间点对各组动物进行神经损伤程度评分(NSS),以免疫定量分析法榆测各组大鼠脑组织中VEGF的表达量、以免疫组织化学染色检测脑内VEGF的表达部位和微血管密度(MVD),并行vWF和BrdU的免疫荧光双重标记,采用尾静脉注射FITC-葡聚糖法行脑微血管灌注成像,并对各组缺血半暗带区域的脑微血管灌注情况进行评估.结果 (1)治疗组的NSS评分有明显改善;(2)VEGF可在脑内多个结构表达,其VEGF表达量是对照组的27倍;(3)治疗组MVD为157±13、对照组为89±9(P<0.05),且治疗组半暗带区域可见大量BrdU阳性的内皮细胞,而对照组未见;(4)缺血半暗带区域微血管显影面积为(152 617±13 076)μm2/mm2,对照组为(91 658±6577)μm2/mm2(P<0.05).结论 rAAVI-VEGF可介导VEGF在大脑内表达,并对脑缺血大鼠神经功能的恢复具有促进作用,其治疗机制可能与VEGF促进新生血管形成并改善脑组织供血有关.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能     

纳米粒子介导血管内皮生长因子基因治疗兔心肌缺血的疗效

目的观察纳米粒子介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染的可行性,了解心肌缺血动物模型经心肌直接注射VEGF基因纳米粒子后新生血管以及心功能改善情况。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载VEGF165基因质粒,制备纳米级粒子混合物,检测其载药量、体外释放情况及粒径;培养乳鼠心肌细胞,转染VEGF165基因纳米粒子(VEGF纳米粒子),应用RT-PCR法检测VEGF mRNA水平,ELISA法检测VEGF蛋白表达水平;将VEGF纳米粒子悬浮液注射至活体家兔心肌内,96h后心肌注射部位取材,电镜观察其向心肌组织内传递基因的可行性;建造兔心肌缺血模型,分别将VEGF纳米粒子(12只)、VEGF165裸质粒(12只)或生理盐水(对照组,8只)注射至缺血部位心肌,1个月后心脏超声监测,然后处死,组织学切片观察心肌组织中毛细血管生成情况。结果制备的纳米粒子载药量为1·87%,粒径为50~300nm;RT-PCR和ELISA结果提示纳米粒子可将目的基因转移至培养的心肌细胞中;体内实验显示心肌细胞胞质内及胞核内可见大量被吞噬的纳米粒子;术后1个月超声检查显示,VEGF纳米粒子组室壁运动幅度(1·87mm±0·32mm)、左室射血分数(60%±10%)较裸质粒组(1·59mm±0·24mm,50%±6%)及对照组(0·93mm±0·40mm,40%±8%)改善更加明显,各组之间差异均有统计学意义(均P<0·05);组织学检查显示,在100倍光镜视野下心肌内毛细血管数VEGF纳米粒子组(57个±12个)明显高于裸质粒组(41个±14个)及对照组(24个±8个),各组之间差异有统计学意义(均P<0·05)。结论纳米粒子可作为VEGF基因向心肌组织转运的载体,在兔心肌缺血模型经心肌直接注射VEGF165基因纳米粒子,能够促进心肌内毛细血管新生,达到改善心功能的目的。