致敏树突状细胞介导CTL抗骨髓瘤免疫的实验研究

目的比较两种树突状细胞(骨髓瘤致敏DC和未致敏DC)诱导的细胞毒T淋巴细胞抗自身骨髓瘤的细胞免疫.方法用多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓CD34+细胞诱生DC,将MM患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC.MTT法检测骨髓瘤抗原致敏和未致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率.结果骨髓瘤冻融物致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率远大于非致敏DC.结论患者骨髓瘤冻融物致敏的DC能有效诱导自身T细胞抗骨髓瘤免疫.     

致敏树突状细胞介导CTL抗骨髓瘤免疫的实验研究

目的比较两种树突状细胞(骨髓瘤致敏DC和未致敏DC)诱导的细胞毒T淋巴细胞抗自身骨髓瘤的细胞免疫：方法用多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓CD34^ 细胞诱生DC,将MM患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC。MTT法检测骨髓瘤抗原致敏和未致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率。结果骨髓瘤冻融物致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率远大于非致敏DC。结论患者骨髓瘤冻融物致敏的DC能有效诱导自身T细胞抗骨髓瘤免疫。     

骨髓瘤冻融物致敏树突状细胞诱导特异性细胞免疫反应

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者肿瘤冻融物致敏的树突状细胞(DC)诱导T细胞对不同靶细胞产生的细胞毒作用.方法GM-CSF、IL-4和TNF-α体外联合诱导生成MM患者自身DC,患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC诱导自身淋巴细胞;MTT法检测致敏DC对不同靶细胞(患者骨髓瘤细胞、K562细胞株)的杀伤率及其与效靶比的关系.结果当效靶比为20:1时,骨髓瘤细胞冻融物致敏的DC加IL-2诱导的自身T细胞对骨髓瘤细胞有明显的溶解作用,而它对K562细胞则无明显影响.结论MM患者肿瘤冻融物致敏的DC能有效地诱导自身T细胞对其骨髓瘤细胞的特异性杀伤作用.     

多发性骨髓瘤患者外周血树突状细胞分离、培养及鉴定

目的 研究多发性骨髓瘤（MM）患者外周血树突状细胞（DC）的分离、培养和鉴定。方法 用塑料贴壁的外周血单个核细胞（PBMNC）来源或者免疫磁珠阴性选择分离途径，建立体外培养技术，从MM患者外周血中获取DC。结果 （1）在含粒-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4的无血清培养基（AIM-V）中，37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中培养5～7d，可获得具有典型DC形态学特征的细胞。2种分离途径得率比较无统计学意义（n=5，P〉0．05）。（2）同种混合淋巴细胞反应及自体抗原呈递试验证实，MM患者外周血来源DC具有很强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力及呈递自体抗原的能力。外周血来源DC培养5～7d后流式细胞仪分析表明，部分细胞表达成熟DC特征性标记CD1a。部分表达共刺激分子CD80及CD86，高表达HLA-DR分子，几乎不表达单核细胞特异性标记CD14。重组人白细胞介素-3或／及重组人干细胞因子加入培养体系并不增加MM患者外周血DC得率。免疫表型也无明显改变。提示DC来源于PBMNC中单核细胞，而非CD34^＋造血祖细胞。结论 贴壁分离法及免疫磁珠法均可获取充足数量的DC。     

M蛋白致敏树突状细胞诱导的抗骨髓瘤细胞效应

目的:探讨M蛋白致敏树突状细胞(DC)诱导激活的自体T细胞对骨髓瘤细胞特异性免疫杀伤效应.方法:取多发性骨髓瘤(MM)患者外周血单核细胞经GM-CSF、IL-4和TNF-α体外联合诱导生成DC,用DEAE-纤维素提取法自MM患者血清中分离、纯化M蛋白.以M蛋白冲击致敏DC(同时设未致敏的DC为对照),流式细胞术分析DC免疫表型,并与自体T淋巴细胞进行混合淋巴细胞反应.51Cr释放法测定T细胞对不同靶细胞(患者骨髓瘤细胞、U266细胞)的杀伤活性.结果:经M蛋白致敏的DC激发自体T细胞增殖的能力明显强于未致敏的DC(P＜0.05);同时负载M蛋白DC激活的T细胞杀伤活性也明显强于对照组(P＜0.01),而两组T细胞对U266细胞均无明显杀伤活性.结论:M蛋白致敏DC能有效诱导自体T细胞对骨髓瘤细胞的特异性杀伤作用.     

骨髓瘤冻融物致敏树突状细胞诱导特异性细胞免疫反应

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者肿瘤冻融物致敏的树突状细胞(DC)诱导T细胞对不同靶细胞产生的细胞毒作用。方法GM-CSF、IL4和TNF-α体外联合诱导生成MM患者自身DC，患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC诱导自身淋巴细胞；MTT法检测致敏DC对不同靶细胞(患者骨髓瘤细胞、K562细胞株)的杀伤率及其与效靶比的关系。结果当效靶比为20：1时，骨髓瘤细胞冻融物致敏的DC加IL-2诱导的自身T细胞对骨髓瘤细胞有明显的溶解作用，而它对K562细胞则无明显影响。结论MM患者肿瘤冻融物致敏的DC能有效地诱导自身T细胞对其骨髓瘤细胞的特异性杀伤作用。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。     

抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪（FACS）分析各组DCs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达；MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为（65．9％±3．1％，92．8％±3．4％），分泌高水平IL-12（279．6±1．7）pg／mL及IFN-γ（892±31）pg／mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平（1146±31）pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。     

树突细胞疫苗治疗多发性骨髓瘤的研究进展

随着分子生物学、免疫学、临床医学等相关学科的发展,越来越多的治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法被采用,但是目前仍然缺乏一种彻底治愈MM的方法。树突细胞(DC)是目前功能最强的抗原呈递细胞,与肿瘤的发生、发展密切相关。近年来,利用DC疫苗治疗MM已进行了很多尝试并在动物实验和临床试验中取得了一定的疗效。现就DC免疫治疗MM的机制以及MM疫苗的各种类型、制备方法和应用前景予以综述。     

抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

 【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪（FACS）分析各组DCs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达；MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为（65．9％±3．1％，92．8％±3．4％），分泌高水平IL-12（279．6±1．7）pg／mL及IFN-γ（892±31）pg／mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平（1146±31）pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。     

雄黄对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞基因表达谱的作用

目的：应用cDNA芯片研究雄黄作用多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞后对其基因表达的影响。方法：应用包含4096条人类基因的cDNA表达谱芯片,检测雄黄作用于RPMI8226细胞前及48h后基因的表达。结果：在mRNA水平上,164条基因显著改变,53条基因上调,111条基因下调。结论：雄黄作用RPMI8226细胞株后可引起一系列基因改变,许多基因涉及了多发性骨髓瘤的发病机制,其中BTG1,TXNIP及ALK1基因可能与RPMI8226细胞的分化和凋亡有密切关系。     

粒-巨噬细胞集落刺激因子对小鼠体内树突状细胞增殖和活化的影响

目的：研究粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在体内对树突状细胞（DC）增殖和活化的影响。方法：将Balb／c小鼠随机分为GM-CSF处理组和对照组,致死量γ射线照射后移植入绿色荧光蛋白（GFP）标记的骨髓来源的造血干细胞（HSC）,GM-CSF处理组隔天皮下注射0．1μg直至处死,对照组隔天皮下注射PBS。应用流式细胞仪分析和比较两组移植后1,2,3及4周小鼠脾脏内DC的数目、活化状态和随时间变化的DC动力学。结果：移植后各时间点GM-CSF处理组小鼠脾脏内DC数目明显高于对照组（均P〈0．05）,其中最大高出倍数为5倍;GM-CSF处理组DC的CD40,CD80和CD86均高于处理组;骨髓移植后第1周,小鼠脾脏内即出现HSC来源的DC,第2周数目开始上升,至第3周达到高峰,第4周开始下降。结论：GM-CSF对体内HSC分化为DC具有促进作用,并且可促进体内DC的成熟与活化。     

VEGF基因转染骨髓间充质干细胞对大鼠心梗区血管新生的影响

目的：探讨转染血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因的骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）心肌移植及其对大鼠心梗区血管新生的影响。方法：以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型,实验动物随机分为4组（n=12）。冠脉结扎2周后,联合组（A组）于心梗区移植转染VEGF基因的MSC,细胞组（B组）移植等量的MSC,基因组（c组）注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组（D组）注射等容积培养液,移植4周后通过Ⅷ因子染色检测血管新生,RT-PCR检测VEGF基因的体内表达。结果：Ⅷ因子染色示A组动物心梗区毛细血管密度明显高于B组和D组,较C组亦有一定程度的升高;RT—PCR显示VEGF基因的体内表达从高到低依次为A组、C组、B组、D组。结论：BMMSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体。     

CRRT在抢救MODS中的应用

目的：观察连续性肾脏替代治疗（continuous renal replacement therapy,CRRT）对危重症患者的疗效。方法：患者分为CRRT组（A组）和普通透析组（B组）。A组7l例多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）患者进行175台次CRRT,B组30例慢性肾功能衰竭患者进行普通血液透析。患者在治疗前后分别抽血检测尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血钾、血钠、血氯、二氧化碳结合力（CO2 CP）、pH,HCO3^-,PCO2和PO2等指标,分析治疗前后各指标的改变。结果：所有患者治疗后一般情况、水电解质和酸碱紊乱情况得到改善。组内比较显示,患者治疗后BUN,Scr,血钾（均P〈0．01）、血钠均下降（A组P〈0．05,B组P〈0．01）,C02CP升高（A组P〈0．01,B组P〈0．05）。组间比较显示,BUN,Scr,血钾（均P〈0．01）、血氯、CO2CP（均P〈0．05）有明显的差异,表明A组的疗效比B组更佳。另外,A组30例伴急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的患者经过CRRT后pH,PO2和HCO3^-明显上升（P〈0．01）,PCO2明显下降（P〈0．05）,CRRT后患者的生存时间明显延长。9例中毒患者使用CRRT加血液灌流,有7例完全缓解,2例死亡。对于有出血倾向或术前48h的患者使用肝素浸泡血液滤器法后,没有发生出血或出血加重的情况。结论：CRRT与普通透析相比,在清除毒素和纠正电解质酸碱失衡方面疗效更佳,对提高患者PO2、减轻CO2潴留,改善脑水肿和肺功能效果明显,MODS患者的死亡率很高,早期使用CRRT治疗对抢救MODS等危重症和改善患者预后起着积极有效的作用。     

皮下注射胰岛素抑制胰岛β细胞凋亡预防NOD鼠糖尿病

目的：观察皮下注射胰岛素免疫干预对非肥胖糖尿病（non-obese diabetic,NOD）鼠胰岛炎、B细胞凋亡和糖尿病的影响,并探讨其诱导免疫耐受的机制。方法：60只NOD雌鼠随机分为胰岛素处理组（n=34）和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）对照组（n=28）,分别于4周、12周、20周、28周皮下注射中效胰岛素优泌林N（Humulin N）6U（60μL）＋不完全弗氏佐剂（incomplete Freund＇s adjuvant,IFA）60μL,对照组予PBS（60μL）＋IFA（60μL）。于12周龄观察胰岛炎和胰岛B细胞凋亡;检测胰岛Fas和FasL的表达;测定血清IL-4和IFN-γ浓度,以及胰岛内I-Aβ^x7,IL-1β,IFN-γ,Fas,IL-4 mRNA的表达水平。结果：NOD鼠皮下注射胰岛素加IFA组30周龄和52周龄时发病率仅为21．4％和28．6％,而皮下PBS加IFA组为71．4％和85．7％（P〈0．05）。胰岛素组胰岛炎积分比对照组低,但差异无统计学意义（P〉0．05）。胰岛素组胰岛Fas抗原表达和B细胞凋亡率均比PBS对照组低（均P〈0．05）。胰岛素组胰岛内I-Aβ^x7,IFN-γ,IL-1β,FasmRNA表达较PBS对照组低（均P〈0．05）,而IL-4mRNA表达较对照组高（P〈0．05）;胰岛素组血清IL-4比PBS组高,IFN-γ比PBS组低（均P〈0．05）。结论：皮下注射胰岛素能诱导NOD鼠的免疫耐受而预防糖尿病的发生,但不能阻断胰岛炎的进展。皮下注射胰岛素能诱导调节性T细胞产生,使全身和胰岛局部T细胞由,Th1向Th2转型,从而抑制Fas介导的B细胞凋亡而预防糖尿病。     

心胸腺联合移植结合胸腺内注射供体胸腺细胞诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受

目的：研究供体胸腺细胞经胸腺注射对大鼠心脏及胸腺移植的影响。方法：将SD大鼠的胸腺细胞注入Wistar大鼠胸腺内,2周后行心脏及心胸腺联合移植（SD→Wistar）,观察移植心存活时间和病理排斥反应,检测血中及移植心中IL-2及IL-4水平。结果：单纯心脏移植及心胸腺联合移植在环孢素短期（7d及14d）应用下,可延长移植心及胸腺的存活时间,但不能诱导耐受;经胸腺注射供体胸腺细胞后,行单纯心脏移植及心胸腺联合移植,在短期环孢素作用下,移植心及胸腺均获长期存活;在移植物长期存活组IL-4保持较高水平,而IL-2处于较低水平。结论：经胸腺注射胸腺细胞可以诱导对同种异体心脏及胸腺的耐受;胸腺移植有利于耐受的诱导和维持。     

血管活性肠肽和表皮生长因子对支气管上皮细胞与嗜酸性粒细胞黏附功能的影响

目的：观察肺内调节肽对嗜酸性粒细胞（EOS）与支气管上皮细胞（BEC）黏附功能的影响。方法：选择血管活性肠肽（VIP）和表皮生长因子（EGF）两种调节肽作为研究对象，观察它们对BEC白细胞介素（ILs）分泌及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。结果：VIP、EGF可使O3应激的BEC分泌ILs能力下降，并下调气道上皮ICAM-1的表达。结论：VIP、EGF抑制BEC与EOS的黏附。对气道炎症起负性调节作用，有利于减轻局部的损伤。     

恶性骨肿瘤的保肢治疗

目的：探讨肢体恶性骨肿瘤保肢治疗的疗效。方法：对40例肢体恶性骨肿瘤患者行保肢治疗。患者术前均进行新辅助化学治疗。肿瘤切除后分别采用人工假体置换、瘤段灭活再植及同种异体骨关节移植等方法行保肢治疗。结果：40例患者均获随访，随访时间4—82（平均34．8）个月。术后8例发生并发症。参照Ennecking术后功能评定标准进行功能评估，优良率为72．5％。结论：保肢手术是治疗肢体恶性骨肿瘤的较理想方法，恰当的手术方法及新辅助化学治疗可延长了患者的生命，提高患者的生活质量。     

妊娠合并系统性红斑狼疮的临床分析

目的：探讨妊娠与系统性红斑狼疮（SLE）病情的相互影响及SLE患者妊娠时机的选择及妊娠期的处理。方法：回顾性调查我院收治的31例妊娠合并SLE患者,其中选择性妊娠18例,非选择性妊娠13例,妊娠期予不同剂量泼尼松控制病情。分析比较2组患者妊娠期病情的变化和妊娠的结局。结果：选择性妊娠组中6例在孕期出现狼疮活动,非选择性妊娠组的13例均出现较为严重的狼疮并发症。非选择性妊娠组的妊娠丢失率、早产率较选择性妊娠组显著增高（P〈0．05）,而新生儿存活率及新生儿体质量则较选择性妊娠组显著下降（P〈0．05）。结论：对妊娠合并SLE患者而言,妊娠和SLE互为不利因素;在SLE病情缓解期选择妊娠并合理治疗将使母婴安全性明显增高。     

大鼠鞘内注射单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体介导人前脑啡肽原基因的表达及对甲醛炎性痛的镇痛效应

目的：大鼠鞘内注射介导人前脑啡肽原基因（HPPE）单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV—Ⅰ）扩增子载体．观察LacZ和HPPE在脊髓神经元细胞中的共表达及对甲醛炎性痛的镇痛效应。方法：纯种雄性SD大鼠随机分为pHSVIRES—HPPE—LacZ载体组（SHPZ）,pHSVIRES—LacZ空白载体组（SHZ）,生理盐水组（NS）,又分为分别注射SHPZ,SHZ和NS后3d,1周,2周,3周,4周,5周时观察镇痛效应组,并对1周组观察HPPE转染表达,每组6只。采用改良Yaksh法对大鼠进行鞘内置管后,将构建好的含HPPE的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体注入大鼠鞘内,通过X-gal染色原位检测报告基因LacZ的表达,逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法检测HPPE的表达,放射免疫法检测脊髓组织脑啡肽浓度,并观察转染含HPPE基因载体对大鼠甲醛炎性疼痛的镇痛效应。结果：pHSVIRES—HPPE—LacZ在体感染大鼠中枢神经细胞后,用X—gal染色、RT—PCR和放射免疫检测方法均证实外源脑啡肽基因能有效表达。对甲醛诱发的炎性疼痛中,疼痛加权评分（PIS）于1周,2周,3周,4周时在第1相和第2相与对照组比较有显著差异,于第5周时第2相PIS接近对照组,对甲醛的镇痛效应可被鞘内注射纳洛酮拮抗。结论：SHPZ能成功地将外源HPPE转染到脊髓神经元细胞中,使之有效表达,提示扩增子载体SHPZ是良好的慢性疼痛转基因治疗工具;HPPE的表达产物可对甲醛炎性痛产生镇痛效应。