蛋白A-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建与表达

绿色荧光蛋白 (GFP)是一种生物发光蛋白。GFP作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用。本实验将gfp基因与蛋白A基因重组 ,在大肠杆菌中融合表达为A GFP蛋白。根据gfp基因与质粒载体pRIT2T的序列 ,设计一对引物 ,以PCR技术扩增gfp基因序列 ,克隆到表达载体pRIT2T的EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点 ,与载体中的A蛋白基因融合。重组质粒转化大肠杆菌Top10 ,菌落在 36 5nm紫外光下呈现明亮的绿色荧光。本研究成功构建并表达了GFP与蛋白A的重组质粒 ,为开展GFP的研究及应用提供了生物工程工具的前体。     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

用于耐药基因体内转移研究的双荧光标记供体菌的构建

目的构建红色荧光基因标记基因组、绿色荧光基因标记RK2质粒的双荧光标记供体菌,以实现对耐药质粒在动物体内接合转移的可视化观察。方法利用RED重组技术,以Td-Tomato基因作为表达红色荧光蛋白(RFP)的基因,将Td-Tomato基因插入asl基因中间,并敲入到大肠杆菌K12基因组中制备成K12Td-tomato细菌。同时构建带有EGFP基因标记的RK2质粒EGFP-RK2,并电转K12Td-tomato细菌感受态细胞,实现双荧光标记供体菌的构建。结果构建的K12Tdtomato:RK2 (EGFP)供体菌能够稳定的同时发出绿色和红色荧光,并且荧光的表达是自发的,不需要底物的诱导。结论利用基因组技术可以构建双荧光标记的供体菌,为对耐药基因在生物体内的转移扩散研究提供了可行性。     

胚胎植入前遗传学诊断方法的进展

胚胎植入前遗传学诊断已经在辅助生殖技术中应用十余年了。荧光原位杂交和聚合酶链式反应是胚胎植入前遗传学诊断的两大基本技术。本文综述了胚胎植入前遗传学诊断方法的一些进展，包括荧光聚合酶链式反应、间期染色体转换、定量聚合酶链式反应、多重聚合酶链式反应、质谱分析、全基因组扩增及DNA芯片技术等。这些技术的发展可使胚胎植入前遗传学诊断成为更广泛使用的临床工具。     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子病毒感染NIH3T3细胞的研究

目的：鉴定NIH3T3细胞中绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子基因（egfp-hRI）的表达情况。方法：采用上清感染法,将产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子反转录病毒的PA317细胞上清感染NIH3T3细胞,使反转录病毒介导的绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子载体（pLNCX-EGFP-C1-hRI）稳定整合于NIH3T3细胞。用荧光显微镜检测目的基因的表达,采用蛋白质印迹（Western blot）法检测目的基因在NIH3T3细胞的表达。结果：在荧光显微镜下可见绿色荧光在细胞浆内表达,Western blot法检测到目的基因表达。结论：建立表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的NIH3T3细胞株。     

HBV核心抗原EGFP融合蛋白表达质粒的构建及在Hep G2细胞中的表达

目的探讨采用构建的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白的可行性.方法克隆HBV核心抗原基因进入真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体法转染HepG2细胞后在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白表达,并行RT-PCR及细胞免疫组化分析融合蛋白的表达.结果重组pHBc-EGFP质粒可在HepG2细胞内瞬时表达HBV核心抗原和增强型绿荧光蛋白融合蛋白.结论pHBc-EGFP质粒构建成功,增强型绿荧光蛋白的表达可报告HBV核心抗原表达.     

环境镉离子生物检测工程菌株的构建及应用

目的 以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，和重金属镉特异性启动子PcadA构建成基因工程重组体，用于重金属镉的特异性检测。方法 采用聚合酶链（PCR）方法从质粒pPcadA上扩增得到重金属镉离子特异性诱导启动子PcadA，以绿色荧光蛋白基因为报告基因，以大肠埃希菌．枯草杆菌穿梭载体pNW33N构建了绿色荧光蛋白镉离子诱导表达载体。以枯草芽孢杆菌1A751为宿主菌，采用感受态转化法将表达载体导入1A751，成功构建镉离子检测菌株。结果 通过酶切鉴定、PCR和DNA序列分析，重组载体构建成功，并在有镉离子存在的环境中得到表达。结论 该工程菌株能够以绿色荧光蛋白基因为报告基因检测培养体系中最低浓度达0．1μmol／L的镉离子；利用该菌株有望建立起一种方便快捷的重金属镉的检测方法，有较高的应用价值。     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

FISH技术在产前诊断中的应用

荧光原位杂交(FISH)是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术,目前广泛用于产前诊断各种染色体异常,不仅可以用于羊水或绒毛细胞来筛查非整倍体同时可以用于母亲外周血分离胎儿有核红细胞及宫颈冲洗收集滋养细胞等细胞数少、不适合常规染色体分析的染色体异常的检测。FISH技术还发展到植入前遗传学诊断对单个细胞进行染色体检查选择适宜的胚胎植入宫腔从而避免患儿的出生。     

胚胎植入前遗传学诊断方法的进展

胚胎植入前遗传学诊断已经在辅助生殖技术中应用十余年了。荧光原位杂交和聚合酶链式反应是胚胎植入前遗传学诊断的两大基本技术。本文综述了胚胎植入前遗传学诊断方法的一些进展 ,包括荧光聚合酶链式反应、间期染色体转换、定量聚合酶链式反应、多重聚合酶链式反应、质谱分析、全基因组扩增及DNA芯片技术等。这些技术的发展可使胚胎植入前遗传学诊断成为更广泛使用的临床工具。     

FISH技术在产前诊断中的应用

荧光原位杂交(FISH)是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术,目前广泛用于产前诊断各种染色体异常,不仅可以用于羊水或绒毛细胞来筛查非整倍体,同时可以用于母亲外周血分离胎儿有核红细胞及宫颈冲洗收集滋养细胞等细胞数少、不适合常规染色体分析的染色体异常的检测.FISH技术还发展到植入前遗传学诊断对单个细胞进行染色体检查选择适宜的胚胎植入官腔从而避免患儿的出生.     

硅纳米载体转染成人角质形成细胞的初步研究

目的 探讨硅纳米颗粒作为基因转染载体转染成人角质形成细胞的可行性，为后续的基因治疗和创面修复研究打下基础。方法自制硅纳米颗粒，与增强型绿色荧光蛋白基因（质粒pEGFP-N1）结合后，在氯化钠修饰下转染成人离体角质形成细胞，观察转染后细胞的绿色荧光蛋白表达，计算转染率。结果 硅纳米颗粒能有效地与pEGFP-N1 DNA结合后转染成人离体角质形成细胞，转染率约为20%～30%。结论 硅纳米颗粒可作为基因转染载体，能有效地转染成人离体角质形成细胞。     

绿色荧光蛋白基因与乙肝病毒e抗原基因在家蚕细胞中的表达

用绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｅ抗原基因融合，构建了家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）重组转移载体ｐＢｍＧＨｅ，使融合基因处于多角体基因（ｐｌｈ）启动子控制之下。共转染后得到的重组病毒ｒＢｍＧＨｅ能在家蚕细胞中表达约５０ｋＤａ的ＧＦＰ／ＨＢＶｅ融合蛋白。被感染的细胞在紫外光下发射出美丽的绿色荧光。用ＥＬＩＳＡ检测，ＨＢｅＡｇ抗原活性滴度达到１１２８００。这种既能发射绿色荧光又具有抗原活性的双功能融合蛋白为研制一种新型的发光免疫诊断试剂开辟了一条新路。     

pEGFP-smac重组质粒的构建及在sw-480结肠癌细胞中的表达

目的构建一种含凋亡激活因子(second mitochondrial activator of caspase,SMAC)的重组质粒pEGFP-smac,观察其在结肠癌细胞中的表达,为探讨SMAC在结肠癌中抗凋亡作用的分子机制,为结肠癌的治疗提供理论依据。方法从sw-480结肠癌细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增SMAC全长基因后,与绿色荧光表达质粒pEGFP-N1构建pEGFP-smac重组质粒,转染sw-480细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定。结果 RT-PCR产物及含有重组质粒的菌落PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(720 bp)处均有目的条带出现;重组质粒成功转染sw-480细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-smac上的SMAC基因在sw-480细胞中正确表达。结论成功构建pEGFP-smac重组质粒,可为进一步研究SMAC蛋白的功能提供重要的分子工具。     

染色体易位的植入前遗传学诊断

染色体易位是一种较常见的遗传 性疾病，目前尚无有效的治疗方法。近年有研究采用植入前遗传学诊断技术，通过第一极体、第二极体或卵裂球活检，结合荧光原位杂交技术分析其染色体核型，对易位携带者的配子或胚胎进行筛选植入。应用该技术后，易位携带者的流产率显著下降，分娩正常胎儿几率明显上升。就植入学遗传学诊断技术应用于染色体易位诊断的研究进展进行简要综述。     

实时荧光定量PCR技术及在植入前遗传学诊断中应用

实时荧光定量聚合酶链反应技术是一种基于荧光共振能量转移原理进行核酸定量的新型技术，常用荧光检测系统主要包括SYBR GreenⅠ染料、Taqman探针、分子信标探针、蝎子引物探针、杂交探针、LUXTM引物、Amplisensor探针等。目前该技术已成功应用于胚胎植入前遗传学诊断的性别鉴定、基因型分析、基因突变检测和基因表达研究等方面，具有潜在的应用价值。     

含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体,以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中,包装并收集病毒,感染人胰腺癌细胞系Aspc-1细胞后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,同时利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确,包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光,RT-PCR和western blot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体,为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。     

荧光原位杂交在植入前遗传学诊断中的应用

随着辅助生殖技术的发展,植入前遗传学检查技术的进展也日新月异,荧光原位杂交(FISH)技术运用于植入前胚胎染色体异常的检测后,大大提高了体外受精的植入率和临床妊娠率,降低了流产率.目前荧光原位杂交技术主要应用于胚胎植入前遗传学筛查、染色体结构异常及性连锁遗传疾病的性别鉴定.但是,关于植入前遗传学诊断的远期安全性仍有很多...     

FISH在罗伯逊易位携带者胚胎植入前遗传学诊断中的应用

胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是辅助生殖技术中的一种重要手段,染色体异常的诊断是植入前遗传学诊断的一个重要部分.利用荧光原位杂交(FISH)技术对罗伯逊易位携带者体外受精的胚胎行植入前遗传学诊断,可解决生育问题、减少遗传风险,达到优生目的.综述荧光原位杂交技术及近年来该技术在罗伯逊易位携带者胚胎植入前遗传学诊断中的应用.     

晶芯@RT-Cycler636实时荧光定量PCR仪

仪器简介：博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心自主研发的晶芯@RT-Cycler636实时荧光定量PCR仪是致力于生命科学研究和分子诊断应用领域的新型产品。它采用离心式实时荧光检测方式，通过热循环PCR对特异性的靶基因进行扩增并定量。该仪器具有适用范围广，准确性高，体积小巧，操作简便等特点。