人HSP70真核载体的构建及其在胆囊癌细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70，并在胆囊癌细胞SGC996中进行表达。方法构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70，经EcoRⅠ及BarnHⅡ双酶切鉴定并测序；通过脂质体法转染SGC996胆囊癌细胞，经G418抗性筛选获得稳定表达细胞株；用流式细胞术检测其表达情况。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确；体外转染入SGC996细胞中后，可见转染细胞有Hsp70蛋白的表达。结论成功构建了pcDNA3．0-Hsp70真核表达载体，为研究Hsp70在肿瘤免治疗中的作用奠定了基础。     

IFN-γ、IL-12联合CD80基因转染对肝癌细胞免疫效应的影响

目的观察IFN-γ、IL-12对转染CD80基因前后肝癌细胞表面分子CD80的表达,评价CD80分子联合细胞因子对肝癌细胞杀伤效应的影响。方法取HepG2细胞和经逆转录病毒载体介导CD80转染的HepG2/CD80细胞,分别经IFN-γ、IL-12处理后,流式细胞仪检测CDS0分子的表达水平。LDH释放试验检测刺激前后肝癌瘤苗对CTL杀伤效应的影响。结果HepG2细胞表面CD80分子表达水平低,转染后HepG2/CD80细胞的表达增高。经IL-12、IFN-γ细胞因子诱导后,HepG2/CD80细胞表面的CD80基因表达进一步增强。细胞因子联合CD80基因转染提高细胞毒性淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。结论(1)IL-12、IFN-γ刺激转染CD80肝癌细胞共刺激信号的进一步表达。(2)CD80基因转染联合IL-12、IFN-γ明显增强CTL对肝癌细胞的杀伤作用,提示两者存在协同作用。     

小鼠胚胎成纤维细胞介导的IL-12抗S-180肿瘤作用

目的：将IL-12重组载体转染入小鼠成纤维细胞,研究探讨转染后的抗肿瘤作用.方法：取小鼠胚胎获得原代成纤维细胞,应用PEI法将IL-12重组载体转染到小鼠胚胎成纤维细胞,同时设对照.建立肉瘤细胞（S-180）荷瘤小鼠模型,分别接种S-180细胞.于注射瘤细胞后定期给予转染后的成纤维细胞瘤体内注射,并设对照组.于致瘤后第21日处死小鼠,测肿瘤质量; ELISA法检测小鼠血清IL-12及γ-干扰素（IFN-γ）的表达; 检测NK（natural killer cells）细胞活性和脾淋巴细胞增殖情况、CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的克隆能力.结果：抑瘤率、NK细胞活性及淋巴细胞增生反应、血清IL-12、IFN-γ水平、CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于对照组（P〈0.01）.结论：转染后的IL-12重组质粒可进一步增强机体的免疫功能发挥其抗肿瘤的治疗作用.     

肝脏持续过表达IL-15对NK/NKT细胞和T细胞数目和活化状态的影响

目的研究靶向肝脏过表达细胞因子IL-15对机体免疫系统的影响。方法构建IL-15重组表达质粒pLIVE-IL-15,采用高压注射的方式尾静脉注射C57BL/6小鼠,ELISA检测小鼠血清中IL-15的表达水平,流式检测小鼠脾脏和肝脏淋巴细胞亚群变化。结果成功构建pLIVE-IL-15质粒,pLIVE-IL-15质粒高压注射小鼠后血清中能检测到IL-15持续表达。与pLIVE-EGFP对照组相比,pLIVE-IL-15质粒注射鼠天然免疫系统NK细胞和NKT细胞以及获得性免疫系统的CD4+T细胞和CD8+T细胞数目均显著增加(P<0.05)。体内过表达IL-15促进NK细胞高表达CD69和IFN-γ,而NKT细胞活化状态改变不明显,IL-15能显著诱导CD8+T细胞高分泌IFN-γ(P<0.05),而对CD4+T细胞IFN-γ分泌影响较小。结论 pLIVE-IL-15靶向肝脏后能在体内持续表达,并且能调节天然免疫系统和获得性免疫系统反应。     

IFN-γ和TNF-α对乙型肝炎病毒转录后调节机制的影响研究

目的探讨IFN-γ和TNF-α对乙型肝炎病毒转录后调节机制的影响.方法在体外构建含有HPRE片段的pDM138质粒(含有CAT报告基因),应用脂质体介导方法转染HepG2细胞,观察细胞因子对重组质粒载体CAT报告基因活性表达的影响,CAT基因的活性的检测采用ELISA检测试剂盒.结果成功构建了含有HPRE片段的重组质粒载体.转染重组质粒的HepG2细胞CAT活性表达明显增强,而转染空载体的HepG2细胞仅有本底表达,分别为896.5±213.6 和36.7±11.3 pg/ml.IFN-γ和TNF-α对转染重组质粒的HepG2细胞CAT活性表达的影响均具有浓度依赖性,而对空载体CAT活性的表达无影响.转染重组质粒的HepG2细胞在未加入细胞因子时,其CAT表达活性为896.5±213.6 pg/ml;与IFN-γ、TNF-α及IFN-γ+TNF-α孵育后,其CAT表达活性分别为324.4±56.8, 395.8±82.3, 175.3±35.6 pg/ml,与未加入时比较, t=5.19,4.39,6.68,P<0.01,差异有显著性.结论 IFN-γ和TNF-α可能通过抑制HPRE的功能,调控乙型肝炎病毒基因的表达.     

RNA干扰Hsp70基因表达抑制胃癌细胞增殖

目的 构建Hsp70的短发夹状RNA(shRNA),检测其在胃癌细胞株SGC-7901中对Hsp70基因表达的抑制作用以及对肿瘤细胞增殖的影响.方法 根据Hsp70编码基因,设计并合成2对反向重复序列,同时设计1对与目的 基因不相匹配的重复序列作为对照组分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建重组质粒phspl-siRNA,phsp2-siRNA及对照组质粒phsp3-siRNA,分别转染胃癌细胞株SGC-7901,采用RT-PCR和Western blot检测phsp-siRNA对Hsp70基因表达的抑制作用.利用AlamarBlue法检测转染后对胃癌细胞生长的影响.结果 酶切电泳分析和DNA测序证实重组质粒phsp-siRNA构建成功;证实phsp1-siRNA和phsp2-siRNA对内源性Hsp70基因的表达有明显的抑制作用,同时phsp1-siRNA和phsp2-siRNA转染组细胞的生长较对照组受到明显抑制.结论 构建的重组质粒phsp1-siRNA和phsp2-siRNA能特异而有效抑制内源性Hsp70基凶在SGC-7901细胞中的表达,并对细胞生长有明显抑制作用.     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

免疫共刺激分子增强自噬小体疫苗诱导的T细胞应答

自噬小体疫苗DRibble被证实可以有效诱导小鼠和人T细胞应答,为了进一步增强DRibble疫苗诱导人T细胞应答的能力,本研究将免疫共刺激分子OX40、CD80和对照质粒分别转染至表达CMV pp65蛋白的LT3-pp65细胞系中,制备3种类型的DRibble疫苗为:Ctrl/pp65 DRibble、OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble。通过ELISA法检测不同DRibble疫苗诱导树突状细胞表达IL-12的水平,结果显示,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导树突状细胞表达IL-12的水平显著高于Ctrl/pp65 DRibble。进一步将3种DRibble疫苗分别刺激树突状细胞后与扩增的CMV特异性T细胞共培养,通过流式细胞术检测表达IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比。实验结果显示,与Ctrl/pp65 DRibble相比,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD8⁺ T细胞表达IFN-γ的能力显著增高,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD4⁺ T细胞表达IFN-γ的水平也显著高于Ctrl/pp65 DRibble。实验证明免疫共刺激分子OX40和CD80修饰均可以加强DRibble疫苗体外诱导人T细胞应答的能力。     

Akt参与热休克蛋白27保护大鼠心肌细胞过氧化损伤

目的:探讨小分子热休克蛋白27保护大鼠心肌细胞过氧化损伤的机制.方法:①以稳定转染 pCDNA3.1/Hsp27质粒并稳定高表达Hsp27的大鼠心肌细胞株H9c2(H9c2-Hsp27)为研究对象.对照组采用稳定转染pCDNA3.1质粒的H9c2(H9c2-Vector)细胞;②氧化应激诱导和检测:500 μmol/L H2O2处理细胞后进行如下分析:培养上清中的 LDH 活性、细胞形态学改变、细胞内Akt激活水平;③Akt在Hsp27保护 H2O2诱导H9c2损伤中的作用:以Akt抑制剂Triciribine处理H9c2-Hsp27,观察其对Hsp27保护H2O2诱导H9c2形态学变化的影响.结果:①H2O2诱导H9c2细胞向培养上清释放的LDH显著增加(P<0.01),但与对照组相比,Hsp27 高表达显著抑制了 H2O2诱导的LDH释放(P<0.01);②H2O2处理后,H9c2细胞Akt磷酸化水平增加(P<0.01或P<0.05),但与H9c2-Vector比较,H9c2-Hsp27的Akt磷酸化水平进一步增强(P<0.05);③Akt磷酸化被抑制后,Hsp27对H2O2诱导H9c2细胞形态学改变的保护作用消失.结论:Akt激活是Hsp27保护大鼠心肌细胞过氧化损伤的重要机制.     

IL-2/IFN-γ融合蛋白质粒增强HBV DNA疫苗免疫原性的实验研究

目的 评价IL-2/IFN-y融合蛋白基因质粒(pFP)增强HBVDNA疫苗(pS2.S)免疫原性的佐剂作用.方法 构建IL-2/IFN-y融合蛋白和H.BV包膜中蛋白(PreS2 S)编码基因的重组真核表达质粒,根据pFP编码的目的基因序列分子模拟IL-2/IFN-y融合蛋白的空间结构,检测质粒体外转染细胞表达目的基因产物及其生物活性;体内实验采用提高质粒转染效率的在体电脉冲(EP)技术免疫健康BALB/c小鼠,分别以ELISAT及免疫酶联斑点(ELISPOT)方法检测小鼠血清抗HBs及脾脏HBsAg特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞应答水平.结果 pFP能够以融合蛋白的形式正确表达IL-2和IFN-γ,其活性域保持相对独立,其分子模拟的结果得到了质粒体外细胞转染检定实验的证实.EP介导的HBV DNA免疫反应中,pS2.S pFP组血清抗-HBs[(51.2±50.5)mlU/mL,89%]及HBsAg特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞应答[(207±103)IFN-rT细胞SFCs/3×105脾细胞,78吲水平和阳性率均显著高于pS2.S pcDNA3.1组[抗-HBs(14.8±7.6)mlU/mL,64%;IFN-γ T细胞(84±70)SFCs/3×105脾细胞,28%(P＜0.05).结论 实验结果提示Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ的融合蛋白基因表达质粒可提高HBV DNA疫苗的免疫效果,并促进初始T细胞向Th1方向分化.     

肿瘤细胞表达Sema3A对树突状细胞功能的影响

目的:研究肿瘤细胞分泌Sema3A对小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs) 免疫学功能的影响.方法:以Sema3A特异性小干扰RNA片段(Si-Sema)和相应突变片段(Si-mut)分别转染肺腺癌细胞A549,以real-time PCR和Western-blot法检测干扰效果.取未转染和Si-Sema、Si-mut转染细胞的浓缩上清分别作用于DCs,并以流式细胞术分析各组细胞表面MHCⅡ分子及共刺激分子CD40 、CD80的表达;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测DCs表达白细胞介素 (interleukin,IL)-12水平.同时,测定DCs刺激OVA-特异性CD4+T (DO11.10T)细胞表达γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和IL-2水平.结果:与Si-mut转染组相比,Si-Sema转染的A549细胞表达和分泌Sema3A水平明显下降(93.4±7.3% vs 27.8±5.3%,P<0.01);Sema3A缺失引起DCs表达MHCⅡ分子和共刺激分子水平上升,分泌IL-12 p70量明显提高 (449.3±29.3 pg/ml vs 675.7±60.2 pg/ml,P<0.05),刺激抗原特异性T 细胞表达IFN-γ(639.6 ± 41.9 pg/ml vs 905.6 ± 68.0 pg/ml,P<0.05)和IL-2 (1011.7 pg/ml± 81.4 pg/ml vs 1459.0 pg/ml± 96.8 pg/ml,P<0.05)显著增加.结论:肺腺癌细胞A549通过分泌Sema3A,抑制DCs的成熟和免疫学功能,这可能是目前尚未完全了解的肿瘤免疫逃逸机制之一.     

黑色素瘤抗原-1诱导特异性抗肝癌免疫应答

目的:探讨黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)对特异性抗肝癌免疫应答反应的影响。方法:分别用转染pcD-NA3.1-MAGE-1(重组子)、pcDNA3.1(空质粒)以及未行转染的人肝癌细胞SMMC-7721冻融抗原致敏树突状细胞(DC),诱导T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。乳酸脱氢酶释放法检测CTL对SMMC-7721细胞的杀伤活性。48只C57BL小鼠随机分为重组子组、空质粒组和PBS组,每组16只。用pcDNA3.1-MAGE-1预先免疫重组子组小鼠,1次/10d,第3次免疫后第5天ELISA法检测各组8只小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量,第6天各组8只小鼠接种鼠源性肝癌细胞H22,观察其生存时间。结果:未转染、空质粒和重组子组诱导的CTL对靶细胞的杀伤率以及各组小鼠股四头肌MAGE-1mRNA表达的比较差异有统计学意义(F=139.601和538.650,P﹤0.001),重组子组高于未转染和空质粒组。PBS组和空质粒组小鼠脾细胞培养液中IFN-γ和IL-2的含量为0,重组子组小鼠脾细胞培养液中IFN-γ含量为(372.33±10.08)ng/L,IL-2含量为(108.67±12.81)ng/L。3组小鼠荷瘤生存时间比较差异有统计学意义(F=31.837,P<0.001),重组子组小鼠生存时间明显延长。结论:MAGE-1可诱导特异性抗肿瘤免疫应答,从而显著延长荷瘤小鼠的生存时间。     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞与CD4+Th细胞分化的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎患者树突状细胞(dendritic cells,DCs)与CD4+Th细胞亚群分化的关系.方法 分离慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞,以rhlL-4(50ng/mL)、rhGM-CSF(10ng/mL)和rhTNF-α(100μ/mL)诱导培养DC.以流式细胞仪检测DCs表面CD1a、CD83、CD80、CD和HLA-DR分子的表达情况.免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞亚群,PMA+Ionomycin刺激后胞内荧光染色,流式细胞仪检测Th细胞内特征性细胞因子IFN-γ/IL-4以判断Th1/Th2分化.ELISA法检测DCs或Th细胞培养上清中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-4的含量.结果 慢性乙型肝炎患者的DCs表达CD1a、CD83、CD80、CD86和HLA-DR分子的水平明显低于正常人;培养至第7天.慢性乙型肝炎患者DCs分泌的IL-12水平低于正常人,而分泌的IL-6水平高于正常人.与正常人相比,慢性乙型肝炎患者外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的百分比较低,Th细胞培养上清中IFN-γ的量也较低.患者DCs与同种异体的健康人Th细胞共培养,刺激Th1型细胞因子IFN-γ产生的能力低于正常人.结论 慢性乙肝患者体内DCs功能的异常可能导致了外周血Th1分化不足.     

IL-17参与小鼠心脏移植排斥反应的实验研究

目的 研究Th17细胞相关因子白细胞介素17(IL-17)在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义.方法 建立小鼠颈部异位心脏移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组.观察2组供心存活时间,应用RT-PCR检测移植心脏IL-17、核孤独受体γt(RORγt)、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA在移植术后1、2、3、4、5、6、7、8 d的动态表达水平.免疫荧光法观察移植术后第4天移植心脏内CD4+、CD8+T细胞中IL-17的表达情况.结果 RT-PCR检测显示,在急性排斥反应组中,IL-17和RORγt mRNA的表达都早于IFN-γ,在移植术后第2天即可于移植心脏中检测到,其表达量在术后第4天均达到高峰,随后逐渐下降,并分别在术后第6天和第7天无表达.免疫荧光结果显示,急性排斥组移植心脏内有大量CD4+、CD8+T细胞浸润,细胞因子IL-17主要由CD4+T细胞分泌.结论 Th17细胞在移植排斥反应的发生发展中可能起着非常重要的作用,对移植脏器中细胞因子IL-17的检测可作为急性排斥反应早期诊断的预见性和特异性指标.     

人热休克蛋白90β基因沉默质粒的构建及转染效率的观察

目的:构建能表达小发夹RNA,从而特异、有效抑制人Hsp90βmRNA水平的质粒,比较该质粒对不同细胞株的转染效率。方法:合成3条对应于靶基因3个区域的64nt寡聚核苷酸,插入pSUPEREGFP1质粒,用DH5α细菌扩增,用酶切和测序法鉴定。以绿色荧光蛋白表达为标记,比较不同比例脂质体和质粒条件下,HepG2、HUVEC、HeK2933种细胞株的转染效率。结果:构建的pSuper-Hsp90β1、pSuper-Hsp90β2、pSuper-Hsp90β33个重组沉默质粒,插入片段碱基完全正确。在相同条件下,所构建的质粒对HeK293细胞转染效率最高,HepG2细胞最低。结论:利用pSUPER质粒可成功构建人Hsp90β基因沉默质粒,该质粒对细胞株的转染效率可因细胞的不同而有显著差异。     

IFN-γ转基因治疗结肠癌小鼠肝转移的抑制效应

目的:评价IFN-γ转基因方法与肿瘤内注射重组IFN-γ对荷瘤小鼠肝转移的抑制作用。方法:手术显露脾脏后,经脾注入1×107/ml浓度的小鼠结肠癌细胞株CT26单细胞悬液0.1ml,建立小鼠结肠癌肝转移模型;小鼠分成4组(每组12只),术后第2日起分别进行不同的干预。结果:与生理盐水和空载质粒对照组比较,转基因治疗组和外源IFN-γ给药组对抑制肝转移结节的效应明显(P<0.05);转基因治疗组和外源IFN-γ给药组荷瘤小鼠平均生存期分别为(39.5±5.6)天和(40.8±4.7)天,明显长于生理盐水组(29.0±3.5)天和空载质粒组(31.1±4.7)天。结论:IFN-γ转基因治疗对荷瘤小鼠的肝转移有抑制效应,转基因治疗组能够与重组IFN-γ每日给药组取得相似的抑瘤效果。     

人可溶性CD_(14)基因在CHO细胞中的表达

目的 :将人可溶性 CD14 重组基因 ,用真核表达系统进行表达 ,为进一步研究 CD14 的功能打下基础。方法 :用 PCR方法扩增 s CD14 34 8aa片段 ,将产物与载体 p EF1/ His C酶切 ,纯化 ,连接后克隆至大肠杆菌 DH5α中 ,酶切鉴定 ;将重组质粒 p EF1/ His C/ s CD14 34 8aa用脂质体转染法转染至 CHO细胞中 ,用SDS- PAGE、Westen- Blot方法进行检测。结果 :阳性重组子可以切出 10 4 4 bp大小的片段 ,得到重组质粒 p EF1/ His C/ s CD14 34 8aa;转染后的 CHO细胞裂解液 ,Westen- Blot在大小约 530 0 0附近有一条较强的特异性棕色条带 ,说明 s CD14 34 8aa基因在 CHO细胞中得到表达。在 CD14 的 N端有 5个潜在的糖基化位点 ,经真核系统表达 ,表达产物分子量与文献报道基本一致 ,证明重组蛋白糖基化完全。结论 :重组质粒p EF1/ His C/ s CD14 在真核细胞中得到表达     

重组质粒pcDNA-HA/ΔNp73α转染对人树突状细胞功能的影响

目的 研究转染pcDNA-HA/ΔNp73α重组质粒对树突状细胞（DC）功能的影响。方法 采取健康人脐带血,分离单个核细胞,置入含有白介素4（IL-4）和粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI 1640完全培养基中培养。在培养第5、7天时收获DC细胞,加入FITC-anti-CD1a、PE-anti-CD83抗体,采用流式细胞仪检测CD1a、CD83表达情况。将DC分为正常培养至成熟的DC组（空白对照组）、空载体pcDNA-HA转染的DC组（阴性对照组）、ΔNp73α重组质粒转染的DC组（实验组）。分别在转染24、48、72 h后采用荧光显微镜检测转染效率;转染48 h后收获并提取细胞总RNA,采用RT-PCR检测转染后各组ΔNp73α mRNA表达情况;采用Western blotting检测转染DC的ΔNp73α蛋白表达水平;在收获的各组DC细胞中分别加入PE-anti-主要组织相容性复合体（MHC-Ⅱ）、FITC-anti-CD40、PE-anti-CD80单克隆抗体,流式细胞仪检测CD40、CD80、MHC-Ⅱ表达情况;ELISA检测各组DC细胞白介素12（IL-12）分泌水平。结果 CD1a和CD83在培养第7天的表达水平均高于培养第5天（t=16.62、34.75,P＜0.001）。DC于第7天诱导成熟。质粒转染DC后,24 h可见特异性绿色荧光蛋白表达,48 h荧光最强,转染效率为38.2%,在48 h后,绿色荧光的表达逐渐减少。实验组在670 bp处可见阳性条带,为ΔNp73α mRNA阳性表达,而空白对照组和阴性对照组未检测到ΔNp73α mRNA的表达。在实验组中检测到ΔNp73α蛋白的表达,而正常对照组和阴性对照组中未检测到ΔNp73α蛋白的表达。各组CD40、CD80、MHC-Ⅱ表达水平比较,差异有统计学意义（F=12.68、41.18、38.95,P＜0.05）;其中实验组CD40、CD80、MHC-Ⅱ表达水平均高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。各组IL-12表达水平比较,差异有统计学意义（F=37.43,P＜0.001）;其中实验组IL-12表达水平高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。结论 从人脐带血中可成功分离DC;重组质粒pcDNA-HA/ΔNp73α转染DC促进其成熟,将有效提高DC的抗原提呈能力。     

HIV-1感染相关细胞因子激活BC-3细胞中潜伏感染的人类疱疹病毒8型的复制研究

目的:研究证实HIV-1感染相关细胞因子能够诱导原发性渗出性淋巴瘤(PEL)的另一细胞系BC-3中潜伏的人类疱疹病毒8型(HHV-8)发生可溶性周期复制。方法:将TNF-α和HIV-1感染CD4~+ T淋巴细胞常释放的细胞因子IFN-γ、HGF/SF、OSM,连续加入到BC-3细胞中作持续刺激,分别于刺激后的第3天和第7天收集BC-3细胞。采用免疫组化染色法(IHC)检测HHV-8免疫原性蛋白ORF59表达;电子显微镜观察病毒的形成;Northernblot和 定量PCR检查次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录。结果:IFN-γ、HGF/SF、OSM和TNF-α均能不同程度上调ORF26 mRNA表达。其中,IFN-γ刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达上升了6.1倍;ORF59蛋白表达上升到20％,与此同时,BC-3细胞中可观察到成熟的病毒粒子。另外,TNF-α刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达也上升了2.5。结论:TNF-α和HIV-1感染释放细胞因子能够诱导PEL另一细胞系BC-3中潜伏的HHV-8发生可溶性周期复制。     

pcDNA3.1/ SjDLC 和pcDNA3.1/mIFN-γ重组质粒构建及表达

目的 构建日本血吸虫动力蛋白轻链DNA疫苗和小鼠干扰素真核表达质粒,研究其在HeLa细胞及动物体内的表达。方法设计特异性引物,PCR扩增获取动力蛋白轻链(SjDLC)与干扰素-γ(IFN-γ)基因,克隆于pcDNA3.1真核质粒,经双酶切及测序鉴定。将两种重组质粒分别转染至HeLa细胞,Western blot鉴定其表达。真核质粒经左腿股四头肌免疫小鼠,在末次免疫2周后,PCR法检测小鼠肌组织内SjDLC和IFN-γ基因,免疫组织化学法检测基因的表达,MTT法检测T细胞增殖水平。结果PCR和双酶切能检测到280 bp的SjDLC基因及480 bp的IFN-γ基因;Western blot显示在12 kDa和19 kDa处有阳性反应条带,与SjDLC和IFN-γ分子量大小一致,两种基因能在HeLa细胞中表达。PCR及免疫组化显示两种基因能在小鼠肌肉组织中存在和表达。MTT法显示两种质粒均能刺激T细胞增殖。结论成功构建pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/ mIFN-γ真核质粒,两种质粒能在HeLa细胞和动物体内表达。