小鼠囊胚在人羊膜上着床行为的实验研究

目的：探索用人羊膜作为胚胎着床模型支持材料的可行性。方法：将妊娠第上天的小鼠囊胚培养在人羊膜的基础面，并作病理观察。结果：小鼠囊胚能在羊膜上正常脱带、贴附和扩展，其脱带率和贴附率与在培养板中 结果没有差异，但扩展率显著低于在培养板中的值；滋养层细胞对羊膜的基膜有侵入，二者在结构上有交错。结论：人羊膜可用作胚胎体外着床模型的建立，是一种有特殊应用价值的生物膜。     

应用卵裂期废弃胚胎培养建立人胚胎干细胞系的方法探索

目的：探讨应用卵裂期废弃胚胎,采用两种不同培养法建立人胚胎干细胞（hESC）系的方法。方法：将临床IVF及ICSI周期中剩余废弃的卵裂期胚胎继续培养至扩张囊胚,分别用免疫切割法及全囊胚培养法分离出内细胞团（ICM）,接种在用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,用hESC培养液培养、传代,建立胚胎干细胞系。通过胚胎干细胞生物学特性、特异性表面标志物、核型分析及体内外分化全能性等传统方法进行鉴定。结果：132枚废弃的卵裂期胚胎在体外继续培养后,有28枚发育为囊胚,随机分组14枚囊胚采用免疫切割法分离ICM,未得到干细胞系;另14枚采用全囊胚培养法,最终得到1个干细胞系,经鉴定,这些细胞都具有hESC的生物学特性。结论：①部分废弃卵裂期胚胎能够发育至囊胚期,可作为建立hESC系的材料来源之一;②全囊胚培养法建系成功率高于免疫切割法,尤其适用于评分低的囊胚。     

小鼠成纤维细胞饲养层的制备及C57BL/6小鼠胚胎干细胞系的建立

目的：制备小鼠成纤维细胞饲养层并建立C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ESC）系,为进一步建立人ESC系提供依据。方法：取妊娠12.5~14.5 d的胎鼠,组织消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）;收集C57BL/6小鼠3.5 d的囊胚培养于小鼠制作的饲养层上;分离内细胞团(ICM),扩增传代40代以上。观察ESC集落的生长情况。采用碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫组织化学早期胚胎特异性表面抗原(SSEA-1)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)染色和体内分化实验对ESC集落进行鉴定。结果：分离培养后得到的ESC可稳定传代至40代以上,且均呈集落样生长。经AKP、SSEA-1和OCT-4染色后ESC均呈红褐色阳性表达,接种于裸鼠均可形成畸胎瘤;HE染色,有3个胚层组织成分。结论：成功建立了C57BL/6小鼠ESC系。     

抗G418小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的:建立具有G418抗性的3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的ES阳性克隆筛选的饲养层.方法:通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入3T3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR鉴定.结果:经500μg/ml的G418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆.抗性3T3细胞的形态和生长速度与正常3T3细胞没有差异,用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southern blot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗生3T3细胞中.结论:成功地培育了G418抗性的3T3细胞,为进行pTet-on基因转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础.     

人源饲养层对人胚胎干细胞生长的影响

【目的】 选择最佳人源饲养层,并检测不同组织来源的人源饲养层细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌情况,探讨其水平与人胚胎干细胞(hESCs)生长是否相关&#65377; 【方法】 原代培养包皮真皮&#65380;子宫内膜基质&#65380;绒毛&#65380;输卵管&#65380;胎儿真皮&#65380;胎儿肌肉及胎鼠成纤维细胞(MEFs);按组织来源分为7组(MEFs为对照),同期接种同一株hESCs,从饲养层细胞密度&#65380;丝裂霉素作用时间等,寻找不同饲养层适合hESCs生长的最佳条件;按人体组织分6组,ELISA方法检测各种人源饲养层细胞分泌的bFGF&#65377; 【结果】 根据饲养层细胞生长特性,饲养层从优到劣依次为:包皮&#65380;子宫内膜&#65380;绒毛&#65380;输卵管&#65380;胎皮&#65380;胎肌;根据hESCs生长状况,饲养层排序为:包皮&#65380;输卵管&#65380;子宫内膜&#65380;绒毛&#65380;胎肌&#65380;胎皮&#65377;输卵管&#65380;包皮&#65380;绒毛&#65380;胎肌&#65380;子宫内膜&#65380;胎皮分泌的bFGF(pg&#8226;10-5&#8226;mL-1)分别为13.23 ± 3.39,1.99 ± 0.17,1.40 ± 0.17,2.02 ± 1.59,0.38 ± 0.28,0.29 ± 0.29&#65377;输卵管与其它组织细胞分泌的bFGF差异均有统计学意义(P < 0.01);包皮&#65380;绒毛&#65380;胎肌之间差异无统计学意义(P > 0.05),与子宫内膜&#65380;胎皮差异有统计学意义(P < 0.05);子宫内膜与胎皮之间差异无统计学意义(P > 0.05)&#65377; 【结论】 包皮来源的饲养层最佳,输卵管细胞分泌的bFGF量最高,饲养层细胞自身分泌的bFGF和hESCs生长无必然相关性&#65377;     

用于胚胎干细胞分离培养的饲养层的制作

饲养层对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)的培养与建系十分重要。实验选择小鼠原代成纤维细胞(Priimary mouse embmy fibroblasts,PMEF)作为饲养层,这种饲养层能够较好地维持ES细胞未分化状态和二倍体核型。除选用经典的14．5d的孕鼠制做原代成纤维细胞外,我们还选了10d、18d、的孕鼠制成饲养层,通过ES-D3的传代培养结果表明：10-18d的PMEE均可作为饲养层用,10代内的饲养层培养细胞均适宜。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统,本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的...     

鼠抗hEGF抗体的制备,活性鉴定及其在免疫组织化学上的应用

本文利用ｈＥＧＦ作为抗原制备出鼠抗ｈＥＧＦ抗体。该抗体经纯化后用于兔角膜细胞培养，确定其生物学活性作用。通过免疫组织化学上的应用，证明人鳞状皮肤癌组织细胞表面含有ＥＧＦ，并对其应用意义进行了初探。     

大鼠间充质干细胞在小鼠肝损伤中的作用

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)在四氯化碳(CCl4)导致小鼠肝损伤中的作用,为临床进行细胞移植治疗肝脏疾病提供新策略.方法 无菌条件下取雄性Wistar大鼠骨髓,分离培养及流式细胞仪检测MSC;采用CCl4制作雌性BALB/c小鼠肝损伤模型,肝损伤小鼠随机分为MSC移植组和肝损伤对照组.MSC移植组在CCl4损伤后立即经尾静脉注入大鼠MSC,6周后处死小鼠,检测小鼠肝损伤程度和大鼠MSC植入情况.结果 流式细胞仪结果显示:第3代大鼠MSC CD45-/CD90 细胞为94.54%,CD45-/CD44 细胞为91.25%;肝组织学观察显示:MSC移植组肝损伤修复程度明显好于肝损伤对照组;PCR方法证实只有MSC移植组肝内有大鼠Y染色体阳性细胞存在.结论 体外分离培养及扩增的大鼠MSC移植到CCl4肝损伤小鼠体内,可参与肝损伤修复,减轻CCl4导致的肝损伤.     

复苏周期单囊胚移植的影响因素分析

目的研究玻璃化复苏囊胚移植后的妊娠结局与冷冻前囊胚质量、发育速度的相关性,探讨单囊胚移植的可能性。方法回顾分析105例复苏周期单囊胚移植患者的临床资料,观察发育速度、囊胚质量、内细胞团(ICM)/滋养外胚层(TE)评分对妊娠结局的影响。结果第5、6天囊胚间复苏后存活率、移植后妊娠率的差异均无统计学意义(98.0%,54.5%vs 97.0%,52.5%)。优质囊胚移植后妊娠率(44/70,62.9%)显著高于非优质囊胚(12/35,34.3%)。ICM评分为A、B级的囊胚移植后妊娠率差异无统计学意义(70.6%vs 58.0%),但均显著高于C级胚胎(21.1%)。TE评分越低,妊娠率有下降趋势但差异无统计学意义。结论复苏周期单囊胚移植妊娠率与囊胚质量有关,与囊胚发育速度无关。ICM评分而非TE评分与妊娠结果显著相关。复苏周期单个优质囊胚移植后妊娠率高,提示单囊胚移植可行。     

Influence of blastocysts morphological score on pregnancy outcomes in frozen-thawed blastocyst transfers: a retrospective study of 741 cycles

The influence of inner cell mass （ICM） and trophectoderm （TE） score on pregnancy out- comes in frozen-thawed blastocyst transfer cycles was analyzed. A retrospective analysis of 741 cycles of frozen-thawed blastosysts transfer was performed. All cycles were divided into four groups based on the number and morphological score of blastocysts： S-ICM B/TE B group （n=91）, the single blastocyst transfer oflCM B and TE B; D-ICM B/TE B group （n=579）, double blastocysts transfer oflCM B/TE B; D-1CM B/TE C group （n=35）, double blastocysts transfer of ICM B/TE C; and D-ICM C/TE B group （n=36）, double blastocysts transfer ofTE B/ICM C. The pregnancy outcomes were compared among the four groups. As compared with D-ICM B/TE C group, the clinical pregnancy rate, implantation rate and multiple pregnancy rate were increased in D-ICM B/TE B group （74.96% vs. 57.14%, 57.43% vs. 37.14%, and .48.62% vs. 25%, respectively, P〈0.05 for all）. Clinical pregnancy rate and implantation rate in D-ICM B/TE B group were also higher than in D-ICM C/TE B group （74.96% vs. 50%, and 57.43% vs. 33.33%, both P〈0.05）. Multivariable Logistic regression analysis indicated that ICM score was a better predictive parameter for clinical pregnancy （OR=3.05, CI 1.70-5.46, P〈0.001）, while the trophectoderm score was a better one for early abortion （OR=0.074, CI 0.03-0.19, P〈0.001）. Clinical pregnancy rate and multiple pregnancy rate in S-ICM B/TE B group were significantly lower than those in D-ICM B/TE B group （46.15% vs. 74.96%, and 2.38% vs. 48.62%, both P〈0.05）, but there was no si~,,niflcant difference in the implantation rate between the two groups. It was suggested that the higher score of ICM and TE may be indicative of the better pregnancy outcomes. The ICM score is a better predictor of clinical pregnancy than TE, while TE score is a better one in predicting early abortion. Sin- gle ICM B/TE B blastocyst transfer in frozen-thawed cycles can also get satisfactory pregnancy out- comes.     

激光辅助孵化对冻融囊胚移植妊娠结局的影响

目的：探讨激光打孔法辅助孵化对复苏周期中囊胚移植妊娠结局的影响。方法收集复苏周期中行囊胚移植患者的568个周期,其中352个周期于冻存囊胚复苏后,行激光打孔辅助孵化后移植（AH 组）,216个复苏周期囊胚移植未行激光打孔辅助孵化（非 AH 组）;分析两组的生化妊娠率、临床妊娠率、种植率、流产率、继续妊娠率、多胎妊娠率及单卵双胎率。结果两组患者的年龄、不孕原因、排卵日内膜厚度、平均移植胚胎数组间差异无统计学意义。AH 组生化妊娠率、临床妊娠率、种植率、继续妊娠率显著高于非 AH组（P <0.05）,流产率显著低于非 AH 组（P <0.05）,多胎妊娠率及单卵双胎率略高于非 AH 组,但差异无统计学意义。结论复苏周期囊胚移植前采用激光打孔辅助孵化可以提高妊娠率,降低流产率。     

不同饲养层细胞对胚胎干细胞和内细胞团的影响

目的探讨不同饲养层细胞对小鼠胚胎干细胞（ESC）和兔囊胚内细胞团（ICM）的影响。方法分别用成系小鼠胚胎成纤维细胞（SNL）、兔胚胎成纤维细胞（REF）、兔肾脏成纤维细胞（RRF）作为饲养层饲养小鼠ESC和兔囊胚，观察它们的生长状态，并分别检测其碱性磷酸酶活性。结果生长在REF上的小鼠ESC具有最显著的未分化形态，保持未分化时间最长．碱性磷酸酶活性最强。在REF上呈聚集生长的兔囊胚ICM的比例最高。结论REF能维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态及促进兔囊胚ICM聚集生长，可以作为ESC的饲养层细胞。     

猕猴胚胎干细胞的分离培养和鉴定

目的从体外培养成熟囊胚中分离并鉴定猕猴胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell).方法猕猴卵母细胞经体外成熟培养、体外受精和早期胚胎体外成熟培养后,获得猕猴囊胚.当囊胚由透明带自然孵出后,用细玻璃针剥离囊胚中的内细胞团(inner cell mass,ICM)并与饲养细胞进行共培养.由ICM分离,培养并鉴定胚胎干细胞集落.结果由4只FSH超排猕猴中共取得92个处于GV期的猕猴卵母细胞,选取其中的22个用HECM-10培养基培养后,获得6个高质量的囊胚,由此6个囊胚中分离得到3个内细胞团,并由此最终获得1株猕猴ES细胞,即RS5细胞.RS5细胞具高比例核/质比,核仁多,其细胞集落边缘平整,其内各单个细胞清晰.经约5个月的连续传代后,仍保持了正常二倍体的核型,其染色体数目为42条.碱性磷酸酶细胞组织化学染色为阳性,说明RS5细胞为未分化态的胚胎干细胞.经高密度和长时间培养后,RS5细胞可进一步分化为多种类型细胞.结论 RS5细胞株具有自我更新能力和多分化潜能,属于胚胎干细胞.     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

诱导性多潜能干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的制备小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs）滋养层,用于诱导性多潜能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的体外培养。方法取13.5～15.5天胎龄的胎鼠,采用组织消化法分离原代培养成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线进行观察。采用10μg/ml丝裂霉素C预处理P2～P3代MEFs 2～3h制备出细胞滋养层,在该滋养层上进行iPSCs培养,观察iPSCs的集落生成情况,并行碱性磷酸酶细胞染色。结果 MEFs经丝裂霉素C预处理后细胞既不增殖,也不会死亡,仍保持分泌多种生长因子的能力。iPSCs在MEFs滋养层上生长良好,类似于胚胎干细胞一样能形成＂鸟巢＂状集落,并可维持iPSCs正常形态,抑制其分化而不影响活力,碱性磷酸酶染色阳性。结论利用诱导性多潜能干细胞滋养层方法制备的细胞滋养层,能有效支持iPSCs的生长,为进一步开展iPSCs的研究提供了理论依据和实验基础。     

Establishment and characterization of two new human embryonic stem cell lines, SYSU-1 and SYSU-2

Background Human embryonic stem cells can propagate indefinitely in vitro and are able to differentiate into derivatives of all three embryonic germ layers. The excitement surrounding human embryonic stem cells lies largely in their potential to produce specialized cells that can be used for transplant therapies. However, further investigation requires additional cell lines with varying genetic background. Therefore, efforts to derive and establish more human embryonic stern cell lines are highly warranted. Methods Surplus embryos （blastocysts） from donors were used to isolate the inner cell mass by immunosurgery. All cells were cultured continuously on irradiated murine embryonic fibroblasts feed layer and likely human embryonic stem cell colonies were subsequently characterized by cell surface marker staining, karyotyping and teratoma formation. Results Two human embryonic stern cell lines （SYSU-1 and SYSU-2） were established from surplus embryos. The two lines express several pluripotency markers including alkaline phosphatase, SSEA- 4, Tra-1-60, Oct-4, Nanog and Rex-1. They remain in undifferentiated state with normal karyotype after prolonged passages and can form embryoid bodies in vitro and teratoma in vivo. Conclusion Two new human embryonic stem cell lines have been established from surplus embryos. They can be used to understand selfrenewal and differentiating mechanisms and provide more choices for regenerative medicine.     

糖萜素对小鼠NK细胞活性影响的研究

目的 探讨糖萜素对机体NK细胞活性的影响.方法①体外试验,不同浓度糖萜素体外直接作用小鼠脾细胞和YAC-1细胞,用MTT法测定细胞生长代谢和NK细胞活性;②体内试验,以糖萜素饲料和普通饲料分别喂养正常和免疫抑制(环磷酰胺抑制)小鼠,在不同时间段检测NK细胞活性.结果①体外<5 μg/ml的糖萜素浓度,对小鼠脾细胞生长和NK细胞活性无明显影响(P>0.05);②以糖萜素饲料喂养的正常小鼠和免疫抑制小鼠,各时间段NK细胞活性明显高于喂养普通饲料的对照小鼠(P<0.05).结论口服糖萜素能明显增强小鼠NK细胞活性,且使其稳定维持在高水平.