双特异性单链抗体

双特异性单链抗体是新型基因工程抗体，在疾病诊断，治疗上有巨大临床应用潜力。目前已有较多各种双特异性单链抗体成功构建的报道。本文对其概念、制作方法及应用前景进行了综述。     

抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体的表达及初步活性检测

目的:构建和表达抗血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)/抗CD3双特异单链抗体(bscVEGFR2×CD3),及亲和活性测定。方法:设计抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体基因序列,由公司合成并亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),筛选高效分泌表达bscVEGFR2×CD3的克隆株。表达产物经Ni-NTA柱纯化,120 g/L SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。应用流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:bscVEGFR2×CD3重组表达载体测序证实序列正确。bscVEGFR2×CD3能够在CHO细胞中进行分泌表达,筛选出6株高表达克隆株。120 g/L SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)约56 000有1条带,与预期相符,Western blot证明anti-His抗体能与这条蛋白条带发生特异性结合。FCM检测bscVEGFR2×CD3能与CD3+jurkat细胞和VEGFR2+A375细胞特异性结合。结论:成功构建和表达抗VEGFR2/抗CD3双特异单链抗体,该抗体具有与VEGFR2、CD3特异性结合的免疫学活性。     

抗GD2/抗CD16单链双特异性抗体的构建及在大肠杆菌中的表达

利用重叠PCR(overlap-PCR)将抗GD2表面抗原GD2的单链抗体基因m-ScFv和抗CD16的单链抗体基因NM3E2融合在一起,得到新型的单链双特异性抗体基因n-m,双抗的联接肽序列为SerGly4Ser,在肽连的C端引入了6×his以利于纯化。该双特异性抗体基因的序列经测序验证后,连接表达载体pET-22b( ),转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),诱导表达,凝胶成像系统扫描显示表达的外源融合蛋白约占菌体总蛋白的27%。表达蛋白分泌于胞质空间,经超声波破胞后收集上清,经Ni 亲和层析柱分离,纯度可达90%以上。经SDS-PAGE及Westernblotting鉴定表达蛋白的分子量为53KD,与预期的相符。     

双价、双特异性单链抗体

双价、双特异性单链抗体是最近几年才出现的一类新的基因工程抗体分子,它在临床诊断和治疗上有着广泛的应用前景,尤其是在肿瘤和病毒的诊治方面更具突出优势。本文对其性质、制备方法及应用前景作了系统的综述。     

双特异性单链抗体介导的T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 研究并比较两种抗人γ-精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体介导T细胞杀伤前列腺癌细胞的作用.方法 利用流式细胞仪分析双特异性单链抗体(BsAb)及多价双特异性单链抗体(mBsAb)与LNCaP细胞和Jurkat细胞的亲和力;将LNCaP细胞作为靶细胞,分为抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组,利用51Cr释放试验评价两种双特异性单链抗体在体外介导T细胞杀伤靶细胞的能力;将Jurkat细胞种植裸鼠后,建立裸鼠前列腺癌模型,并分为非治疗组、对照组、BsAb组和mBsAb组,进一步评价两种双特异性单链抗体在体内介导T细胞杀伤靶细胞的能力.结果 流式细胞仪结果显示:BsAb和mBsAb均可特异性结合LNCaP细胞和Jurkat细胞,阳性结合率分别为56.3%、55.4%和74%、83%.51Cr释放试验结果显示:在体外,BsAb和mBsAb均可介导T细胞对前列腺癌细胞的杀伤,并且T细胞的杀伤效率与抗体浓度和效应细胞/靶细胞比例呈正相关.与非治疗组和对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T细胞的同时分别接受两种抗体的治疗后,肿瘤生长均明显受到抑制(P＜0.05).另外,体外介导杀伤作用和体内抑制肿瘤生长等方面,多价双特异性抗体的效果明显优于双特异性抗体.结论 同时识别人γ-精浆蛋白和CD3分子的双特异性单链抗体可有效地介导T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用,并且双特异性单链抗体四聚体的形成可明显改善抗体介导杀伤作用的效率.     

肝癌细胞特异性结合抗体的筛选及序列测定

目的通过噬菌体展示技术筛选与肝癌细胞特异性结合的抗体.方法用肝癌细胞系SMMC7721免疫小鼠,提取脾细胞总RNA,构建单链抗体库,从中筛选特异性结合的抗体.结果构建了一个库容量为2×105的单链抗体库,并筛选到1个与肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体-单链抗体.此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低125倍以上.结论本研究成功构建了单链抗体库并筛选到与靶细胞特异性结合的噬菌体-单链抗体.     

双特异性抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用影响的体…

将抗ＣＤ１３与抗ＨＢｓ的单克隆抗体经化学偶联得到的双特异性抗体，观察该双特异性抗体对ＬＡＫ细胞增殖和增强细胞毒性的作用。结果显示双特异性抗体显著提高ＬＡＫ细胞与２．２．１５细胞结合率；促进淋巴细胞增殖．＾１２５Ｉ－ＵｄＲ释放试验检测发现双特异性抗体增强ＬＡＫ细胞对２．２．１５细胞的细胞毒性且与抗体浓度呈正相关 。     

单链抗体在基因治疗方面的应用

单链抗即众所周知的单链可变区片段是将抗体重链可变区和轻链可变区以一个弹性连接肽连接成为一个单个的多肽,它们较好地保持原代抗的亲合和特异性,是一种新的基因治疗的手段。本文对使用单链抗体治疗癌症以及控制传染病的一些新的研究进展作一综述,并对这一技术的进一步应用进行了讨论。     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外成熟

目的 提高人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的亲和力和特异性，方法 以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体为基础，通过合成部分随机化的突变引物和PCR等方法构建HCDR3和LCDR3的混合突库，然后利用噬菌体表面呈现技术对抗体库进行筛选，并利用本实验室建立的单链抗体－碱性磷酸酶系统进行单克隆的鉴定。结果 得到4株亲和力和特异性有明显改善的人源化抗体。结论 构建CDR3突变库是抗体体外成熟的一个有效方法，该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制剂奠定了基础。     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的表达

在以前的工作中 ,我们利用本研究室制备的抗胶质瘤单克隆抗体ＳＺ39通过化学偶联的方法制备了抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体 ,并在体外细胞毒及荷瘤动物体内试验中取得较好疗效[1,2 ] ,但存在着分子量大 ,穿透力弱 ,免疫原性强 ,制备困难等缺点。因此 ,研制小分子 ,低免疫原性的人源化抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体是我们正在开展的研究项目之一。目前我们已构建并原核表达了抗胶质瘤单链抗体ＳＺ39 ＳｃＦｖ。本研究构建并表达的人源化抗ＣＤ3单链抗体 ,旨在为下一步制备高效低毒的抗ＣＤ3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个理想的构件。1　材…     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

单链抗体的生物学特性及其在肿瘤和艾滋病诊断治疗中的应用

单链抗体是一种基因工程小分子抗体 ,其基本结构为VH Linker VL 或VL Linke VH。单链抗体由于具有免疫原性低、在血液中清除快、肿瘤穿透力强和特异性强等优点 ,而在疾病的诊断、治疗和预防及其研究方面有着十分重要的应用价值 ,本文就单链抗体的生物学特性及其在肿瘤和艾滋病诊断治疗中的应用作一综述。     

C-myc标记肽对单链抗体与抗原结合活性的影响

目的 探讨在不同的免疫学检测方法中，与单链抗体相连的亲和标记肽对单链抗体与抗原结合活性的影响。方法 在制备“VH-连接链-VL”型结构抗乙酰胆碱受体单链抗体时，将c-myc标记肽与单链抗体的VL连接，应用先将抗c-myc抗体固定单链抗体的固相放射免疫测定法、直接将单链抗体与乙酰胆碱受体结合的液相放射免疫测定法，分别测定单链抗体与乙酰胆碱受体的结合活性。结果 在固相放射免疫测定法中，单链抗体不能与乙酰胆碱受体结合；在液相放射免疫测定法中，单链抗体则能与乙酰胆碱受体结合。结论 在应用不同的免疫学检测方法中，与单链抗体相连的c-myc标记肽可影响单链抗体与抗原的结合活性。     

HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达

目的：构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白，并诱导表达。方法：提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒，用SfiⅠ、NotⅠ分别酶切，连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达，细胞ELISA鉴定融合蛋白活性。结果：重组质粒经PCR扩增，Eco91Ⅰ单酶切及Eco91Ⅰ／NotⅠ双酶切鉴定，证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上。表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔，细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性。结论：成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体．AP融合蛋白，为其应用奠定了基础。     

噬菌体表面呈现抗人红细胞血型A抗原单链抗体的研究

目的 构建表达抗人红细胞血型Ａ抗原５０Ａ杂交瘤细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法 应用重组噬菌体抗体技术,从５０Ａ杂交瘤细胞中分离、构建单链抗体基因,并将其克隆入噬粒ｐＣＡＴＮＡＢ５Ｅ中,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－Ｂｌｕｅ,辅助噬菌体援救构建５０Ａ噬菌体单链抗体库;采用完整红细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体,鉴定重组噬菌体并进行序列测定分析;免疫印迹试验检测重组单链抗体的特异性抗原活性。结果 用Ｍ１３     

抗乙酰胆碱受体单链抗体对致病性抗体结合活性的抑制作用

为探讨单链抗体 (ScFv )对重症肌无力 (MG )的特异性免疫治疗作用 ,从分离自MG患者胸腺的抗乙酰胆碱受体(AchR )抗原结合片段Fab6 37构建单链抗体ScFv6 37。应用放射免疫测定法测定了ScFv6 37与刺激抗原人AchR的特异性结合活性以及与相关抗原大鼠AchR和电鳐AchR的交叉反应 ,应用竞争性ELISA测定抑制致病性抗AchR完整抗体IgG6 37与人AchR结合活性。结果发现ScFv6 37只能与人AchR结合 ,不能与大鼠和电鳐的AchR结合。对IgG6 37与人AchR结合的抑制率为 17 5 %～ 32 9%。表明单链抗体对AchR具有一定的“保护”作用。     

与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的：从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepC2特异性结合的单链抗体，为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法：以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞，以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞，从人源噬菌体抗体库(Griflfin．l Library)经三轮筛选后，阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆，通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体，通过ABL3130全自动荧光测序仪测序，并通过GeneBank比对进行同源性分析，IPTG诱导可溶性单链抗体表达，并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果：获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后，在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对，并用IMGTF／V-Quest软件进行分析，确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank，序列号为AY686498-AY686499。结论：从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体，为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。     

抗TNF-α人单链抗体的分离纯化及鉴定

目的对通过大容量抗体库中筛选到的4株抗TNF-人单链抗体进行分离纯化及鉴定。方法采用硫氰酸盐洗脱ELISA法评估阳性克隆的亲和力;亲和层析柱纯化抗体;通过ELISA检测抗体的特异性结合活性;用L929细胞检测其体外中和TNF-α的活性。结果用硫氰酸盐洗脱法测定4个噬菌体抗体的相对亲和力与其相应的可溶性抗体相对亲和力相一致;SDS-PAGE电泳结果表明,单链抗体得到成功纯化;ELISA结果表明,纯化的抗体能够特异性结合人TNF-α;体外中和试验证明筛选到的单链抗体能中和TNF-α对L929细胞的毒性。结论从人源大容量噬菌体抗体库中能够筛选到具有中和活性的抗TNF-α人单链抗体。     

从噬菌体抗体库分离抗NKAT4单链抗体

用一噬菌体抗体库分离人杀伤抑制受体特异性的单链抗体。经ＥＬＩＳＡ分析显示,５０个克隆中有１４个与ＮＫＡＴ４蛋白反应呈强阳性。这些克隆的重链可变区胚系为ＤＰ ４７。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ显示表达在上清中的单链抗体为单体。本研究结果表明,从一噬菌体抗体库可比较简便地分离到杀伤抑制受体的特异性单链抗体。