纳米磁流体-单纯疱疹病毒胸苷激酶重组质粒的构建及其对胃癌细胞增殖的影响

目的研究hTERT启动子调控下单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）重组质粒的构建、在人胃癌细胞BGC823中的表达及对胃癌细胞BGC823增殖的影响。方法构建重组质粒pGL3-hTERT-tk和相应的荧光报告质粒pGL3-hTERT-tk-Luc＋：经纳米磁流体PEG-PEI／Fe304转染胃癌细胞BGC823．荧光显微镜观察细胞形态变化和转染效率．免疫组织化学（免疫组化）方法检测目的基因在胃癌细胞BGC823中的表达．M1Tr法检测胃癌细胞BGC823的增殖能力．以上实验均以正常肝细胞L02为对照。结果重组质粒pGL3-hTERT-tk构建成功,其长度为1100bp。荧光素酶标记的阳性、阴性对照及治疗报告质粒pGL3-hTERT-TK-Luc＋均能有效转染高表达端粒酶活性的胃癌细胞BGC823,转染效率为（28．1±2．3）％。免疫组化结果显示,重组质粒组胃癌细胞BGC823的细胞质中可见大量HSV-tk基因编码的表达。MqT检测结果示．转染pGL3．hTERT-tk质粒4d后．BGC823细胞增殖受抑制．其A,,值为0．254±0．011,低于L02细胞的0．322±0．013;亦低于pGL3-basic-tk转染的BGC823细胞（0．357±0．014）（均P〈0．05）。结论纳米磁流体能将重组质粒pGL3-hTERT．tk转染BGC823细胞并获得表达,PEG-PEI／Fe3O4纳米磁流体-tk可显著抑制BGC823细胞增殖。有望成为胃癌基因治疗的新型生物制剂之一。     

逆转录病毒介导单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的：观察单纯疱疹病毒－胸苷激酶（HSV－tk)／丙氧鸟苷（GCV）基因治疗系统在体内外对人胰腺癌细胞的杀伤效应。方法：构建含HSV－tk基因的重组逆转录病毒载体pDOR-tk-neo,经病毒包装细胞PA317产生重组逆转录病毒,后者将HSV－tk基因转入人胰腺癌细胞系PC－2细胞内,筛选出稳定表达HSV－tk的细胞克隆PC－2／tk。测定PC－2/tk细胞在体外对GCV的敏感性及其旁观杀伤效应PC－2／tk细胞在裸鼠皮下成瘤,观察GCV的治疗作用。结果：GCV对PC－2/tk细胞有明显的杀伤作用,且其作用呈现剂量和时间依赖性特点以及旁观杀伤效应,对母本细胞则无明显毒性。裸鼠腹腔注射GCV后对移植瘤有明显治疗作用。结论：表达HSV－tk的人胰腺癌细胞在体内外均可被GCV有效杀伤。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增，克隆构建真核表达质粒pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As。方法：从单纯疱疹 病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞上清液中提取HSV－2基因组DNA，以此为模板，用PCR方法扩增胸苷激酶（TK）基因，将扩增的片段克隆入载体pcDNA3中，挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切pcDNA3／HSV－Ⅱ TK，得到目的基因TK，将其克隆于已构建的真核表达载体pcDNA3/As上。结果：HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，基因序列与gendbank中报道相符。新质粒pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As经限制性核酸内切酶（BamH I,Hind Ⅲ）酶切后得到700bp(As）及1000bp（HSV－ⅡTK）相应基因片段。结论：本研究成功构建pcDNA3/HSV-Ⅱ TK/As真核表达质粒。     

直接转导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对大肠肿瘤的杀伤作用

目的 通过单纯疱疹病毒胸苷酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因对荷大肠癌裸鼠肿瘤的直接转导及杀伤作用研究,建立有效的自杀基因抑制大肠肿瘤的治疗方法。方法 脂质体法将含ＨＳＶ－ｔｋ基因的逆转录病毒载体ＬＮｔｋ及空载体Ｇ１Ｎａ、ＰＡ３１７包装细胞中进行交叉包装、收获病上清。４０只ＢＡＬＢ／Ｃ裸鼠分成４组并皮下注射ＬｏＶｏ细胞成瘤,将含ｔｋ和Ｇ１Ｎａ的病毒上清分别直接注射到２组大肠肿瘤部位并予以腹腔注射３００ｍｇ／ｓ     

单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统对膀胱癌体内杀伤作用的研究

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疤疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷(HSV-TK／GCV)系统对膀胱癌的体内杀伤作用。方法：用逆转录病毒载体感染鼠源性膀胱癌细胞株T739，体外观察其对GCV的敏感性。在鼠源性T739膀胱癌动物模型中，以逆转录病毒单次或重复感染方法介导TK基因转移，观察GCV治疗前后肿瘤体积大小及动物存活时间变化。结果：TK基因导入T739后获得了GCV敏感性，体内肿瘤生长受到抑制，动物存活时间延长，但单次和重复感染组之间无差别。结论：逆转录病毒成功介导膀胱癌体内基因转移，HSV-TK／GCV系统在体内对膀胱癌有杀伤作用，其可望对膀胱癌作为基因治疗。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因对人原发性肝细胞癌治疗作用的实验研究

目的　研究含单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因 (HSV ⅡTK)对人原发性肝细胞癌SMMC 772 1的治疗作用。方法　用已构建的真核表达载体 pcDNA3/TK ,通过阳离子脂质体Lipo fectin介导 ,体外转染人原发性肝细胞癌SMMC 772 1。加入GCV ,细胞培养。用RT PCR ,光镜 ,MTT ,流式细胞仪等方法检测HSV ⅡTK在SMMC 772 1细胞中的表达及其对该细胞的杀伤作用。结果　实验组细胞通过RT PCR获得与目的基因 (HSV ⅡTK)大小一致 (10 0 0bp)的特异性条带 ,而对照组细胞则无任何条带出现 ;MTT法检测显示 ,实验组的OD值明显低于对照组 ,且有显著意义(P <0 0 1) ;流式细胞仪检测显示 ,实验组可发现明显的凋亡峰 ,而对照组则无凋亡峰出现。结论　通过阳离子脂质体Lipofectin介导 ,HSV ⅡTK在SMMC 772 1细胞中能够获得表达 ,其表达产物结合GCV可明显抑制人原发性肝细胞癌细胞的增殖。     

腺病毒介导胸苷激酶基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生抑制作用的研究

目的探讨以腺病毒为载体介导胸苷激酶（tk）基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生的抑制作用。方法腺病毒载体携tk及β-半乳糖苷酶（lacZ）基因转染人的大隐静脉平滑肌细胞及大隐静脉片，以不同浓度的更昔洛韦（GCV）培养。通过X-gal染色观察标记基因lacZ的表达效率。将转染tk基因阳性与tk基因阴性的平滑肌细胞以不同的比例混合培养观察旁观者效应。将转染tk基因的静脉片在含有GCV的培养液中培养14d，取标本进行HE、VG染色，辅以计算机图像分析，观察内膜增生情况。结果腺病毒载体能有效地转染培养的平滑肌细胞和静脉片中的平滑肌细胞，外源基因表达持续14d。平滑肌细胞增殖受抑制程度与GCV的浓度和tk表达的水平呈正相关。转染lacZ的平滑肌细胞则不被GCV抑制。混合细胞培养（tk阳性及tk阴性细胞混合），当10％的细胞表达tk基因时，细胞生存率下降了55％。在静脉片培养实验中，tk／GcV组与对照组（lacZ／GcV和tk／GCV^-）比较，前者内膜增生60％受到抑制。结论tk基因合并GCV治疗具有抑制平滑肌细胞增殖和移植静脉内膜增生的作用，tk基因治疗具有旁观者效应。     

腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗肝癌的研究进展

肝癌是我国常见的恶性肿瘤,针对肝癌的传统治疗方法疗效欠佳、患者预后较差.近10余年来,随着分子生物学技术的发展,肝癌的基因治疗成为该领域新的研究方向和热点,其中以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因系统（ADV-tk）对肝癌的治疗研究开展得最早也最为广泛.其原理是把单纯疱疹病毒胸苷激酶基因通过腺病毒导入细胞内,利用其产生的酶将无毒的药物前体更昔洛韦（GCV）转变成细胞毒性产物,从而杀死肝癌细胞.多项动物实验和临床研究结果表明：ADV-tk/GCV系统是治疗肝癌的有效方法.本文总结近年来ADV-tk/GCV系统在肝癌治疗中取得的研究进展,分别从载体的发展过程、基因的作用机制、导入方式、增强杀伤效力、降低肝毒性以及相关动物模型的改进等几个方面进行综述.     

ADV-tk重组腺病毒的构建及检测

目的应用基因重组技术,构建含胸苷激酶（tk）自杀基因的复制缺陷型腺病毒（ADV-tk）,为进一步研究tk自杀基因对肿瘤的抑制作用奠定基础。方法采用细胞内同源重组法构建携带tk基因的ADV-tk,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。重组腺病毒ADV-tk体外转染人肝癌SMMC-7721细胞,RT-PCR检测tk基因的整合和表达。建立裸鼠人肝癌动物模型,腹腔注射ADV-tk,荧光显微技术观察ADV-tk基因在肝脏的转染情况和对肿瘤细胞的抑制作用。结果构建的重组腺病毒中带有tk基因,经扩增、纯化后测得重组腺病毒滴度为1.4&#215;10^10pfu/ml。ADV-tk体外转染SMMC-7721细胞后,RT-PCR检测显示tk基因在细胞中整合并且有效表达。体内检测结果发现ADV-tk在肝脏有明显转染,肿瘤组织中凋亡细胞明显增多。结论本研究构建的携带tk基因的复制缺陷型腺病毒获得成功,可用于下一步研究。     

携带反义甲胎蛋白增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的产病毒细胞系的建立及对肝癌细胞的靶向杀伤效应

目的建立对肝癌细胞具有靶向调控的高感染性和高分泌性产病毒细胞系。方法将重组反义甲胎蛋白增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶基因逆转录病毒载体(pL/TK/AFE/SN)转染至PA317包装细胞,经G418(400mg/L)筛选、病毒滴度测定。以病毒上清感染培养的Hep3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞,并抽提细胞基因组DNA作Southernblot分析;观察GCV(100mg/L)对细胞生长的影响。结果转染pL/TK/AFE/SN的PA317细胞经G418筛选2周获阳性克隆;病毒滴度为5.4×104～3.8×105CFU/ml。Southern杂交证实前病毒已完整整合于PA317细胞,并稳定整合于Hep3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞中。导入AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞经GCV作用后的存活率在2、4、6d时分别降低35%、87%、95%,生长明显受抑制(F=7.23,P<0.01)。结论携带AFE/TK基因的产病毒细胞系能够成功地将AFE/TK基因转移到感染细胞中。     

穿心莲内酯体外对人胃腺癌BGC823细胞增殖凋亡的影响

目的探讨穿心莲内酯（andrographolide,AD）对人胃癌细胞株BGC-823细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡的影响。方法分别采用MTT法、流式细胞术和流式细胞仪AnnexinV／PI双染色法检测AD对BGC-823细胞体外增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响：应用光镜和透射电镜观察不同浓度的AD作用后BGC．823细胞形态学改变。结果各浓度组AD均对人低分化胃癌细胞株BGC-823的增殖有抑制作用。并具有时间和浓度依赖关系（均P〈0．05）。浓度7．5μg／ml以下的AD抑制效果较弱,而15．0-60．0μg／ml抑制效果显著提高（P〈0．05）,60．0μg／ml以上抑制率增高不显著（P〉0．05）。24、48和72h的IC50分别为（35．3±4．3）、（25．5±3．5）和（18．2±2．7）μg／ml。BGC-823细胞经AD作用后,G0／G1期细胞的比例增加,S期和G2/M期细胞的比例下降,细胞被阻滞在G0／G1期,呈浓度依赖关系。AD浓度为7．5、10．0和15．0μg／ml组作用24h后,早期凋亡率分别为（19．3±4．7）％、（29．4±4．1）％和（52．7±6．7）％,晚期凋亡率为（10．8±1．8）％、（10．9±4．7）％和（14．7±4．8）％,均显著高于阴性对照组的早期凋亡率[（3．4±1．0）％]和晚期凋亡率[（4．1±0．7）％],差异有统计学意义（均P〈0．05）,并呈浓度依赖关系。结论AD能抑制BGC-823细胞增殖、阻滞其细胞周期在G0／G1期和诱导其细胞凋亡．是潜在的胃癌抗肿瘤中药制剂成分。     

腺病毒介导HSV-TK／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌实验研究

目的观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷（HSV-TK／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方珐利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率;利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV／TK以及Ad-CMV-HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受转染细胞的存活率。结杲重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0.01）,MOI为1时转染率为8.3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad-CMV-HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad-hTERTp-HsV／TK只杀伤LNcaP（P〈0.001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0.01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol／L时存活率为95.4％,MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6.1％,并有旁观者效应。结论重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV-TK／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

FasL启动子调控的报告基因表达质粒的构建及活性分析

目的扩增FasL启动子并构建带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒,并评价在皮质酮(啮齿类动物体内的糖皮质激素)作用的睾丸Leydig细胞中,由FasL启动子调控的荧光素酶的表达活性。本研究将为进一步分析Leydig细胞中FasL启动子转录调控的作用机制奠定基础。方法采用DNA重组技术构建由FasL启动子调控的荧光素酶报告基因的表达质粒。此重组质粒经阳离子脂质体LipofectAMINE介导,瞬时转染入Leydig细胞中,36h后细胞经皮质酮处理,并于48h时收集细胞。测定荧光素酶的相对表达活性。结果(1)酶切及测序证实成功扩增FasL基因启动子并构建了带有FasL基因启动子的报告基因表达质粒；(2)皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子调控的荧光素酶表达质粒的表达活性显著增高。结论构建成功的带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒可准确地评价FasL启动子在凋亡过程中的作用。     

miRNA-214对胃癌细胞BGC823|MKN45的细胞周期和凋亡的影响

目的探讨miRNA-214对胃癌细胞的细胞周期和凋亡的影响,及其对靶基因PTEN蛋白表达的影响。方法荧光定量PCR法检测人低分化胃癌细胞BGC823、MKN45和人正常胃黏膜细胞GES-1中miRNA-214的表达;检测瞬时转染反义核苷酸(miRNA-214抑制剂)后的miRNA-214的表达;流式细胞术分析转染后的细胞生长周期和凋亡率的变化;免疫荧光检测miRNA-214抑制剂对靶基因PTEN表达的影响。结果 miRNA-214在人胃癌细胞BGC823及MKN45中表达上调(P0.05)。转染miRNA-214抑制剂后能使BGC823中miRNA-214的表达下调(P0.05),且BGC823和MKN45在转染组的G1期细胞较未转染组明显增高[分别为(60.20±3.38)%vs.(49.33±7.99)%(P0.05);(69.90±0.28)%vs.(54.85±0.64)%(P0.05)],S期细胞在转染组较未转染组明显降低[(21.87±3.20)%,(18.25±1.34)%,P0.05)],但对细胞凋亡率无影响(P0.1)。免疫荧光显示,转染miRNA-214抑制剂后PTEN呈强表达。结论 (1)人胃癌细胞系BGC823,MKN45中的miRNA-214呈高表达;(2)miRNA-214可使这两株细胞的G1期细胞减少,S期细胞增多,下调PTEN可能是其作用机制之一;(3)miRNA-214对上述两株细胞的凋亡无影响。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗膀胱癌的实验研究

目的　观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV tk/GCV)自杀基因系统体外对人膀胱癌的选择性杀伤效应。　方法　利用不同感染复数(MOI)的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因感染膀胱癌细胞253J和人成纤维细胞MRC 5,荧光显微镜下观察其感染效率。利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad hTERT HSV/tk以及Ad CMV HSV/tk感染253J和MRC 5细胞,加入不同浓度GCV,MTT法观察受染细胞的存活率。　结果　重组腺病毒Ad hTERT EGFP能特异性转染253J细胞,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高(P<0. 01),MOI为1时转染率为8. 3%,MOI为1000时转染率达100. 0%;应用GCV处理后,Ad CMV HSV/tk对253J和MRC 5细胞均有杀伤作用,而Ad hTERT HSV/tk只杀伤253J细胞(P<0. 001),随着MOI和GCV浓度增加, 253J细胞存活率明显降低(P<0. 01),MOI为1、GCV浓度为1μmol/L时存活率为95. 4%,MOI为100、GCV浓度为1000μmol/L时存活率仅为6. 1%,并有旁观者效应。　结论　重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率,hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV tk/GCV自杀基因系统对人膀胱癌细胞有靶向杀伤作用。     

N-myc下游调节基因家族成员3在胃癌细胞增殖和侵袭中的作用

目的:探讨N-myc下游调节基因家族成员3(NDRG3)对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制。方法:实验分NDRG3敲减组和对照组,AGS-NDRG3小发夹状RNA(shRNA)组采用shRNA技术干扰AGS细胞中NDRG3表达,同时设置AGS-Vector对照组转染空白对照病毒;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)...     

转录因子激活增强子结合蛋白4对胃癌细胞迁移和侵袭调控作用的实验研究

目的:探讨转录因子激活增强子结合蛋白4(TFAP4)在胃癌中的表达及对预后的影响,并观察TFAP4在胃癌细胞迁移和侵袭过程中发挥的作用。方法:通过生物信息学分析,获取TFAP4在胃癌中的表达及在胃癌患者的预后中所起到的作用。采用Transwell小室法及划痕实验检测TFAP4对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。应用蛋白质印...     

右美托咪定对胃腺癌SGC-7901细胞生长和转移的影响

目的观察不同浓度右美托咪定对胃腺癌SGC-7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法人胃腺癌SGC-7901细胞接种于培养板培养24h,随机分为五组:对照组(C组)、右美托咪定312.5μg/ml组(D1组)、右美托咪定625μg/ml组(D2组)、右美托咪定1 250μg/ml组(D3组)和右美托咪定2 500μg/ml组(D4组)。分别用不同浓度右美托咪定处理胃癌SGC-7901细胞48h后,采用CCK-8法、Transwell法检测细胞增殖、侵袭和迁移。结果与C组比较,D1、D2、D3和D4组SGC-7901细胞活力差异无统计学意义。D1、D2、D3和D4组SGC-7901细胞迁移能力明显高于C组(P0.05或P0.01),且呈剂量依赖性;D1、D2、D3和D4组SGC-7901细胞侵袭能力明显高于C组(P0.05或P0.01),且呈剂量依赖性。结论右美托咪定可促进人胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移,对其增殖无明显影响。     

重组人腺病毒p53对裸鼠人胃癌细胞移植瘤的抑制效果及不良反应

目的 探讨重组人腺病毒p53(rAd-p53)对胃癌细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤效应及相关不良反应.方法 将胃癌细胞SGC-7901注射于裸鼠皮下制成动物模型,分别用rAd-p53和盐酸表阿霉素(EPI)进行治疗.rAd-p53治疗组剂量为10μl浓度1012vp/ml,EPI治疗组剂量为1.25mg/kg,各组每3周给药7次,以生理盐水为对照组.结果 与对照组比较,rAd-p53治疗组和EPI治疗组肿瘤抑制率分别为80％和60％,差异有统计学意义(P＜0.01);rAd-p53和EPI治疗组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).没有实验动物死亡,rAd-p53治疗组2只裸鼠出现肝脏不良反应,EPI治疗组1只裸鼠心脏不良反应,上述反应均有病理学观察证实.结论 裸鼠体内实验证实rAd-p53对胃癌细胞具有抗肿瘤效应,但应注意其肝脏不良反应.