染色体微阵列分析和全外显子组测序在产前罕见疾病诊断中的应用

目的 探讨产前罕见疾病的诊断方法。方法 选取4845例有产前诊断指征的孕妇,所有胎儿均行CMA检测CNV,在排除非整倍体和异常CNV后,其中68例进一步行WES检测。结果 4842例样本CMA检测成功,检出染色体异常537例(11.09%),经分析明确致病性变异为370例,包括：非整倍体214例,致病性CNV 134例和部分CNV嵌合22例。疾病主要涉及1q21缺失综合征(7例)、DiGeorge综合征(6例)、17q12缺失综合征(6例)、Cri-du-chat综合征(5例)、16p11.2缺失综合征(5例)。WES结果显示在68例CMA结果阴性的胎儿中检出13例单基因病(19.12%)。结论 CMA和WES是明确产前胎儿遗传病因和产前诊断的有效手段。     

全外显子组测序在耳聋基因检测中的应用进展

新一代测序技术(Next-generation sequencing NGS)在基因革命中发挥了核心作用。此类技术中,全外显子组测序(whole exome sequencing WES)已经成为遗传学家识别遗传性耳聋致病DNA变异的主要工具。研究显示,1%的人类基因表达产生听力功能。全外显子组测序可采用靶向富集方法将基因组中外显子全部捕获,在经高通量测序获取遗传信息,我们回顾了利用NGS治疗遗传性耳聋的最新进展,重点对全外显子组测序在遗传性耳聋基因的诊断中的应用进行综述。     

全外显子组测序诊断2例Gitelman综合征

中南大学湘雅三医院内分泌科收治了2例疑诊Gitelman综合征的患者。抽取2例患者外周血进行基因组DNA抽提,然后采用全外显子组测序进行基因学检测,寻找致病位点,并通过生物信息学软件对突变位点进行功能分析。全外显子组测序及Sanger测序验证发现2例Gitelman综合征患者均携带SLC12A3基因复合杂合突变：c.486＿490delTACGGinsA、p.R943W、p.D486N及p.R928C。其中c.486＿490delTACGGinsA插入缺失突变将造成框移及蛋白质截短,而p.R943W、p.D486N及p.R928C突变经SIFT、PolyPhen2和Mutation Taster预测为有害。这4个突变既往均有报道,其中p.R943W为首次在中国人群中发现。Gitelman综合征临床较罕见,漏诊率高。对Gitelman综合征患者及早进行基因检测有助于明确病因及指导治疗。     

全外显子组测序在自身免疫性疾病中的研究进展

自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AIDs)是指机体对自身抗原发生免疫应答而导致自身组织损害的一类疾病,其确切发病机制尚不明确,目前普遍认为遗传因素在AIDs的发生发展中发挥重要作用.近年来,全外显子组测序技术的发展与应用鉴定了多个遗传变异与AIDs相关,并证实这些变异位点通过不同机制参与疾病的各...     

全外显子组测序技术检出Kallmann syndrome患者KAL1基因新突变

目的 分析Kallmann syndrome家系患者的分子遗传机制.方法 利用全外显子组测序技术对先证者进行测序分析,按照ACMG解读规则筛选致病性突变,Sanger测序对所有家系成员验证突变结果.结果 捕获且比对到目标区的碱基量为3418.98Mb,平均测序深度为77.66X,覆盖度为99.23％,共检出5056个变异,3174为罕见变异（RSV）,KAL1基因c.1735_1736insT突变为疑似致病性突变,且满足家系共分离.结论 KAL1基因c.1735 1736insT框移突变为新的疑似致病性突变.     

全外显子组测序发现一家族性扩张型心肌病致病基因

 目的 对一扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)家系行全基因组外显子测序以寻找该家系的致病基因。方法 收集在复旦大学附属中山医院就诊的1位DCM患者及其家系成员的临床资料,采集相关家系成员外周血并抽提DNA,对该家系5名成员行全基因组外显子测序,寻找致病基因,用Sanger测序对家系其他成员进行验证。结果 通过对家系患者与正常人测序结果比对分析,同时经过多个生物数据库数据过滤,发现LMNA基因6号外显子上存在的杂合突变 c.961 C>T (p.Arg321Ter)为该家系的可能致病基因突变。LMNA c.961 C>T无义突变导致LMNA编码蛋白质过程提前终止,相应蛋白质功能异常,进而导致该家系中此突变基因的携带者出现心功能异常。结论 本研究应用全基因组外显子测序从一DCM家系中发现其致病基因及突变位点:LMNA c.961 C>T (p.Arg321Ter),突变导致该家系相关成员心功能异常。此位点在汉族人群中尚属首次报道。     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

全外显子组测序和目标序列靶向捕获测序在遗传性视网膜变性基因诊断中的差异

目的:对比外显子组测序(whole exome sequencing,WES)和目标序列靶向捕获测序检测中国遗传性视网膜变性(inherited retinal dystrophies,IRDs)患者致病基因变异的差异。方法:收集182例IRDs家系,所有先证者均接受系统的眼科检查和必要的全身检查,采集患者及家属血样并提取基因组DNA。按照就诊的时间顺序将患者平均分为两组,一组91例接受WES,另一组91例应用本课题组设计并定制的“遗传性眼病基因诊断芯片” (hereditary eye disease enrichment panel,HEDEP)进行IRDs致病基因外显子区域靶向捕获测序。对候选致病基因用Sanger测序进行验证,并对家系成员进行共分离分析,使用多重连接依赖的探针扩增技术对拷贝数变异进行验证,针对二代测序捕获效率低的区域如RPGR ORF15区,应用Sanger 测序补充检测。根据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP基因变异分类标准与指南》将检测到的所有基因变异进行分类,本文只包含“致病的”、“可能致病的”的基因变异,不包含“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”基因变异。结果:应用HEDEP确诊的家系共51例,阳性率为56.04%(51/91);应用WES确诊的家系共30例,阳性率为33.00%(30/91);总阳性率44.51%(81/182)。平均测序深度以及测序覆盖度方面,HEDEP优于WES,此外HEDEP具有检测拷贝数变异潜力。本研究共检测到29个IRDs基因的致病突变,最常见的致病基因为USH2A、ABCA4和RPGR,基因突变频率分别为11.54%(21/182)、6.59%(12/182)、3.85%(7/182);共发现43个新的致病突变,并检测到6例家系携带RPGR ORF15区的突变。结论:针对临床确诊的IRDs病例,HEDEP较WES能获得更高的基因诊断阳性率和更精确的诊断结果,可作为IRDs基因诊断的首选方法,WES可作为其他基因诊断方法的补充手段。同时,本研究丰富了IRDs致病基因的突变频谱,为将来IRDs基因诊断、遗传咨询和基因治疗奠定了基础。     

全外显子组测序鉴定盐酸氢吗啡酮镇痛引发呼吸抑制反应相关联的基因变异位点

目的 探索与盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应相关联的基因变异位点。方法 采用病例-对照研究,选取10例癌症患者作为研究主体,给予盐酸氢吗啡酮镇痛,记录患者是否存在呼吸抑制反应,并采用全外显子组测序(WES)技术分析他们的基因变异位点。结果 10例患者中有4例在使用盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应;WES结果表明,在4例阳性病例中同时检测出的基因变异有5 871种,包括5 570个单核苷酸多态性(SNP)和301个小片段的插入或缺失(Indel)。通过差减法扣除在6个阴性病例中出现的SNP和Indel,最终得到与盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应密切相关的5个SNP (rs6780995、rs17136118、rs1048445、rs12931472和rs72981971)。结论 成功鉴定出5个可能与盐酸氢吗啡酮镇痛后出现呼吸抑制反应相关联的差异性SNP,需进一步研究证实其临床意义。     

同卵双胞胎胆道闭锁患儿染色体核型和全外显子组测序分析

目的:以临床表型不同的同卵双胞胎胆道闭锁（BA）患儿为研究对象,分别进行染色体G显带核型分析和全外显子组测序,检测该组双胎儿是否存在染色体核型异常和差异基因型,初步探讨胆道闭锁发生的遗传学背景。方法:采集3对同卵双胞胎BA患儿外周静脉血作为实验样本,分别进行染色体G显带核型分析和全外显子组测序分析。结果:临床表型不同的同卵双胞胎BA患儿,其染色体G带核型分析结果均无异常,为46,XX或46,XY。全外显子组测序结果显示,未检测到该组同卵双胞胎BA患儿的任何差异基因型。结论:同卵双胞胎BA患儿具有不同的临床表型,其染色体G显带核型正常,提示胆道闭锁的发生与染色体异常无关;双胎儿全外显子组测序检测不存在差异基因型,提示胆道闭锁不是单纯的遗传性疾病,可能与遗传表型或外显率以及其他因素等有关。     

基于核心家系全外显子组测序数据探索新生突变与非综合征型唇腭裂的关联

目的: 在中国人非综合征型唇裂伴或不伴腭裂(non-syndromic cleft lip with or without palate, NSCL/P)核心家系中,利用全外显子组测序探索与NSCL/P发病相关的新生突变位点。方法: 对22个中国NSCL/P核心家系进行全外显子组测序,采用基因组分析工具包(Genome Analysis ToolKit, GATK)通过对比亲代与子代同一位点的等位基因识别新生突变位点,采用SnpEff软件对位点进行功能注释。对新生突变位点进行富集分析,检验全外显子区域内存在的新生突变数量是否高于预期值,以及是否存在包含新生突变数量显著高于预期值的基因。通过查阅文献总结既往研究提示与NSCL/P发病存在较强证据支持的基因,根据注释信息筛选能够引起蛋白质改变的新生突变位点,对该类位点所在基因编码的蛋白质与NSCL/P相关基因编码的蛋白质进行交互作用分析。利用R软件的denovolyzeR包进行富集分析(Bonferroni多重检验校正：P=0.05/n,n为基因个数)。利用STRING数据库预测新生突变所在基因与已知NSCL/P致病基因编码的蛋白质间的交互作用。结果: 全外显子组测序得到的位点中共有339 908个位点通过质量控制,经GATK软件比对共筛选出345个高置信度新生突变,其中错义突变44个,无义突变1个,经典剪接位点2个,同义突变20个,内含子区或基因间区位点278个。富集分析显示,全外显子组中引起蛋白质改变的新生突变数量显著高于预期值(P < 0.05),KRTCAP2、HMCN2、ANKRD36C、ADGRL2和DIPK2A 5个基因所含的新生突变位点高于预期(P < 0.05/(2×19 618))。蛋白质交互作用分析纳入46个包含能够引起蛋白质序列改变的新生突变所在的基因及13个既往研究提示与NSCL/P存在关联的基因,两类基因编码的蛋白质之间存在6组交互作用,其中RGPD4与SUMO1编码的蛋白质的交互作用证据可信度最高,STRING数据库交互作用评分为0.868。结论: 研究为NSCL/P的发病提供了新的证据,对携带新生突变的基因进行功能分析有助于揭示复杂疾病的遗传结构。     

多变量缺失数据的不同处理方法及分析结果比较

目的:探讨多变量缺失数据的不同处理方法对结果的影响.方法:分别利用删除含缺失值的观察、简单填补、多重填补3种方法对多变量中度缺失的925例肝癌患者的临床资料进行统计分析并对其结果进行比较.结果:不同方法所产生的结果差别较大.在α=0.05的水平下,利用多重填补处理的数据集分析得到影响肝癌患者生存时间的危险因素:临床分期、肝硬化史、门脉癌栓、g-GT和WBC;而用删除含缺失值方法得到的却是:TNM分期、碘油剂量、AST、ALP;简单填补比多重填补多产生3个危险因素,分别是:TNM分期、ALP和AFP.结论:本资料采用删除含缺失值的观察的方法结果最差;简单填补相对较好,但容易降低标准误、减小P值;而多重填补处理比较合理、科学.建议对多变量数据缺失的处理一定要慎重.     

尿液的4种检测方法在尿路感染诊断中的有效性比较

目的 比较4种(尿培养、UF-1000i、UF-100、H-500)检测方法在尿路感染(UTD)诊断中的价值.方法 对疑似尿路感染患者的尿标本分别进行4种方法的检测,以临床确诊为尿路感染的病例作为金标准比较分析.结果 200例样本中尿路感染真阳性率4种方法分别为100%、79.3%、67.6%、80.3%,真阴性率4种方法分别78.9%、73.4%、70.5%、65.6%,准确度4种方法分别86.5%、76.0%、69.0%、70.5%.结论 尿培养对尿路感染诊断的临床效能好,而UF-1000i临床效能接近尿培养,在尿路感染诊断中更快捷、价廉.     

提取陈旧血液标本中DNA的三种方法比较

目的寻找适合从陈旧全血中提取基因组DNA建立基因组库的方法。方法分别用改良的酚-氯仿法、SDS法、试剂盒法从陈旧全血中提取基因组DNA,采用聚合酶链反应（PCR）对提取的基因组DNA进行评估。结果提取的基因组DNA经统计学分析,3种提取基因组DNA的方法之间差异有统计学意义（P〈0.01）,以改良的酚-氯仿法提取的基因组DNA效率最高,试剂盒法次之,SDS法较差。结论建基因组库推荐改良的酚-氯仿法。     

炉甘石原料及其制剂中锌盐含量测定方法的考察

目的：建立以炉甘石为主药制剂的小儿撒布粉和炉甘石薄荷脑洗剂含量测定方法,并对其方法进行考察。方法：采用络合滴定法测定炉甘石中锌盐的含量,并分别对小儿撒布粉3种含量测定方法和炉甘石薄荷脑洗剂中4种含量测定方法进行比较。结果：小儿撒布粉测定方法中方法1、3结果比较无显著性差异;炉甘石薄荷脑洗剂测定方法中方法1、4结果比较无显著性差异。结论：以炉甘石为主药的制剂小儿撒布粉和炉甘石薄荷脑洗剂含量测定方法需要改进。     

比较全血DNA提取法适用单核苷酸多态性分析

目的 比较两种提取冰冻全血基因组DNA的方法，即分离白细胞法和裂解红细胞法所获得基因组DNA的质量。方法 分别测定所获DNA的效率和纯度，同时，笔者用PCR／SNP敏感性分子开关技术。对两种方法获得的模板DNA进行单核苷酸多态性（single—nucleotide polymorphism，SNP）分析。结果 结果显示分离白细胞法DNA产量与纯度均高，裂解红细胞法获得的DNA产量、纯度相对较低；PCR／SNP敏感性分子开关检测表明：分离白细胞法和裂解红细胞法制备的DNA模板，均可在体外进行有效的PCR扩增。但分离白细胞法获得的目的DNA带特异性凸显，而裂解红细胞法获得的目的带特异性相对较差。结论 预先分离纯化白细胞是从冰冻全血中获得较高纯度DNA和有效提高DNA产量的重要操作步骤。