应用双缩脲反应测定鳖甲中总肽含量的方法学研究

目的:用双缩脲试剂显色,可见分光光度法测定醋鳖甲中的总肽含量。方法:显色剂为0.02 g.mL-1的酒石酸钠钾、5%的NaOH溶液0.3 mL、1%的CuSO4溶液1 mL,检测波长545 nm。结果:七肽在2.50～10.04 mg与吸收度呈良好的线性关系,精密度、重现性、稳定性均合乎要求,平均回收率为98.02%,RSD为1.65%(n=5),符合要求。结论:实验首次使用该方法测定中药中的肽类成分,创新性强,简便可行并且精确度高。     

鳖甲五灵脂等12种中药炮制前后细菌含量的变化

比较了鳖甲、五灵脂等１２味中药炮制前后所带污染菌的数量与种类，包括杂菌（兼性厌氧菌，厌氧菌）、大肠杆菌及霉菌学，结果表明，中药经净选炮制后，不仅能使药物达到所需成品性状，治疗上的要求，且具有明显的降菌作用。     

硫酸铜溶液处理的4种吸附材料对鳖甲肽类的分离效果比较

目的：比较硫酸铜溶液处理前后8种不同吸附填料的分离效果,选择更适用于分离鳖甲肽类的填料。方法：采用硅胶,聚酰胺树脂,AB-8大孔吸附,凝胶LH10树脂作为填料,并且分别以硫酸铜溶液处理相应填料,以乙醇-水洗脱系统（纯水到纯乙醇,梯度为20%）对鳖甲中肽类进行分离,以双缩脲反应检测各洗脱部位肽类含量及各填料肽类总量回收率为指标进行分离效果评价。结果：硫酸铜溶液未处理AB-8大孔树脂的回收率最高;硫酸铜溶液处理以后硅胶和凝胶LH20的分离效果有了较为明显区别,其中硫酸铜-硅胶的回收率大大提高,硫酸铜-凝胶在60%乙醇部位明显富集了某些肽类;聚酰胺填料则在硫酸铜溶液处理前后,其分离结果无明显差异。结论：AB-8大孔树脂可用于对鳖甲肽类粗分,并有较好分离效果;硫酸铜处理后硅胶和凝胶LH20分离性能有较大改变,起到了一定分离改善作用。     

巴戟天炮制前后蒽醌类成分含量变化

目的:对巴戟天炮制前后3种蒽醌类化学成分的含量进行比较研究。方法:采用HPLC同时测定3种蒽醌类成分1,8-二羟基-3-羟甲基蒽醌,1,8-二羟基-3-甲基-5-羟甲基蒽醌,1-甲基蒽醌的含量,色谱柱:Agilent-C18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相以甲醇-水梯度洗脱(60∶40→85∶15,25 min);流速1.00 mL·min-1;柱温30℃;检测波长278 nm;进样量10μL。测定巴戟天生品和炮制品中三种蒽醌的含量。结果:3种蒽醌的线性范围分别为1,8-二羟基-3-羟甲基蒽0.019 9～0.199 2μg,1,8-二羟基-3-甲基-5-羟甲基蒽醌0.0331～0.331 2μg,1-甲基蒽醌0.0197～0.196 8μg,3种蒽醌的平均回收率均在98.50%～100.31%。巴戟天炮制前后蒽醌类成分有所变化。结论:所建立的分析方法可以同时测定巴戟天不同炮制品3种蒽醌类化合物的含量,为解析巴戟天炮制原理提供一定的科学依据。     

五灵脂炮制前后指纹图谱及含量测定比较

目的:建立五灵脂及其炮制品指纹图谱,并对主要指标成分穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮进行定量测定。方法:采用HPLC色谱法,Agilent extend-C18柱(4. 6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-0. 1%甲酸,梯度洗脱,柱温30℃,检测波长335 nm,建立五灵脂及其炮制品指纹图谱,采用指纹相似度软件进行分析,并对2个主要色谱峰进行含量分析。结果:醋五灵脂、酒五灵脂、清炒五灵脂与五灵脂生品指纹图谱和含量测定结果基本一致,炭炒五灵脂较五灵脂生品新增2个峰,且穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮含量相对减少。结论:所建立的指纹图谱精密度、重复性、稳定性良好,含量测定方法准确率达到要求,对五灵脂及其炮制品的质量评价和炮制原理研究有提供依据。     

鳖甲炮制前后对肝星状细胞增殖影响的比较研究

目的比较鳖甲生品和醋制品对大鼠肝星状细胞（HSC—T6）增殖的影响,为鳖甲醋制品抗肝纤维化的临床应用提供依据。方法传代培养的HSC—T6与鳖甲生品和醋制品超声提取物,鳖甲生品和醋制品回流提取物共同培养72h后,采用MTT比色法测定各浓度组HSC—T6的增殖情况。结果两种提取方式相互验证了鳖甲生品和醋制品对HSC—T6细胞增殖均有抑制作用,且鳖甲醋制品的作用优于鳖甲生品。结论鳖甲醋制品的抗肝纤维化作用优于鳖甲生品。     

芥子炮制前后有效成分芥子甙的含量比较

作者对芥子炮制前后有效成分——芥子甙进行含量测定,其中炒芥子为3.19%,生芥子为2.50%。又对芥子及其粗粉水煎液进行含量测定,其中炒芥子为1.02%,炒芥子粗粉为1.80%;生芥子为0.79%,生芥子粗粉为1.24%。测定结果表明,芥子以炒制品碾粗粉或捣碎入煎剂为宜。     

地黄炮制前后总多糖含量的比较

采用硫酸—苯酚法测定生地黄及其炮制品中多糖的含量 ,结果表明 :生地黄中含多糖为 16.5 9% ,其炮制品熟地黄含多糖为 3.33%。     

牵牛子炮制前后咖啡酸的含量比较研究

目的：探讨牵牛子炒制前后的成分变化,揭示牵牛子的炮制机制奠定基础。方法：采用高效液相色谱法测定牵牛子炮制前后的咖啡酸含量,色谱条件：色谱柱AgilentTC-C18（2）（4．6mm×250．0mm,5肛m）;流动相：乙腈（A）-0．04％磷酸水（含2％异丙醇）（B）;梯度洗脱：0-12min,流动相A为13％;12-13min流动相A为13％-54％,13-19min流动相A为54％：流速1．0mIVmin;检测波长325nm;柱温25℃。结果：咖啡酸含量为生黑丑0．010％,炒黑丑0．0012％,生白丑0．016％。炒白丑0．0015％。结论：牵牛子经炒制后咖啡酸含量降低很多,高效液相图显示成分有量变也有质变。     

侧柏叶炮制前后鞣质的含量测定

目的比较侧柏叶生品和炭品中鞣质的含量。方法采用2005版《中华人民共和国药典》鞣质含量测定方法，即磷钼钨酸-干酪素比色法，以没食子酸为对照，测定侧柏叶生品和炭品中的鞣质含量。结果线性范围为0．026～0．26mg（r=0．9994），平均加样回收率为97．85％，RSD=1．07％（n=9）。结论该方法结果可靠，可用于侧柏叶生品及炭品的鞣质含量测定。     

鳖甲中抑制单胺氧化酶活性肽筛选模型的建立

目的: 建立单胺氧化酶(MAO)活性筛选模型,以该模型指导鳖甲活性肽的分离,并检验分离单体活性。 方法: 参照MAO试剂盒方法,以优降宁为阳性药进行MAO活性筛选模型;对鳖甲水提液依次调节乙醇体积分数为20%,40%,60%,80%,90%,得到各醇沉部位,再以该模型筛选各醇沉部位,选取活性最优部分继续分离,然后将分得的单体以该模型检验活性。 结果: 该MAO活性筛选模型中,阳性药优降宁质量浓度在1.0 g·L^-1时,抑制率为98.30%~103.05%;各部位质量浓度为1.0 g·L^-1时,鳖甲水提液部位MAO抑制率为(23.34±9.66)%,20%醇沉部位(28.16±5.78)%,40%醇沉部位(30.69±7.17)%,60%醇沉部位(41.60±8.03)%,80%醇沉部位(64.91±2.94)%,90%醇沉部位(53.34±7.76)%;在80%醇沉部位分得鳖甲七肽(GAGPHGG),质量浓度在0.1~1.6 g·L^-1时,鳖甲七肽MAO抑制率为15.30%~54.84%。 结论: 发现MAO活性筛选模型优降宁抑制效果显著,提示该模型成功;以该模型成功指导了鳖甲七肽的分离,且鳖甲七肽具有较明显MAO抑制活性。     

不同品种鳖甲的主要药效学比较

三种不同品种的鳖甲可使“阴虚”大鼠症状得到不同程度的改善,其效果以中华鳖甲和山瑞鳖甲作用相似,绿板鳖甲效果较差;均能提高“阴虚”小鼠应激能力,其作用强度为中华鳖甲与缘板鳖甲作用相似且优于山瑞鳖甲。三种不同品种的鳖甲均能提高网状内皮系统吞噬功能,对幼年小鼠的胸腺发育均有不同程度的促进作用,能明显降低小鼠四氯化碳中毒引起的SGPT活性升高,其作用强度为中华鳖甲与绿板鳖甲优于山端鳖甲。     

鳖甲肽脂质体药代动力学及肝靶向分析

目的:制备含DiR碘化物荧光染料的长循环脂质体(DiR-SSL),采用SD大鼠和BALB/c裸鼠进行荧光成像的体内靶向性研究,利用空白SSL包封含5-羧基荧光素(5-FAM)的鳖甲肽(HGRFG-5-FAM,HF)制备HGRFG-5-FAM-SSL(HFL),研究HF及HFL分别给药于大鼠的药代动力学。方法:采用薄膜分散法制备DiR-SSL及HFL,取2组SD大鼠分别尾静脉注射HF及HFL,其HF质量浓度及剂量一致,于不同时间点采血,利用多功能微孔板检测仪分析HF血药浓度,计算药代动力学参数;将DiR-SSL尾静脉注射于BALB/c裸鼠,分别于1,2,5,7,24 h活体成像,读取荧光强度值;取正常SD大鼠尾静脉注射DiR-SSL,24 h后解剖心、肝、脾、肺、肾于荧光成像系统成像并读取荧光强度值,将肝组织冷冻切片进行激光共聚焦扫描。结果:HF注射到SD大鼠体内,其半衰期(T_(1/2))仅0.826 h,而HFL在相同剂量下,T1/2和药时曲线下面积(AUC_(0-∞))分别为HF的16.253,11.899倍;在BALB/c裸鼠活体成像中,荧光主要集中于肝脏位置,随着时间增加荧光强度逐渐减弱;SD大鼠各脏器中的DiR-SSL荧光在肝脏中最强,注射24 h后DiR-SSL仍能在肝脏储留。结论:SSL递药系统能显著延长HF在SD大鼠体内的T_(1/2)。SSL递药系统具有肝靶向作用,提示该系统可作为药物载体进行肝靶向递药。     

特异性PCR方法鉴别鳖甲药材和饮片

鳖甲为临床常用的动物药材,炮制加工后鳖甲药材及饮片形态特征丢失,难以鉴别。为建立高效稳定的鳖甲DNA鉴别方法,该研究将SDS法与柱纯化相结合,使用通用引物进行PCR扩增和测序,并根据鳖甲及其混伪品序列差异,寻找特异性SNP位点设计了鉴别引物,对PCR反应条件进行优化,并进行适用性及准确性考察。当退火温度为62℃,循环次数为35,使用设计的鳖甲特异性鉴别引物Biejia-272.F/R进行PCR扩增,鳖甲药材、饮片及醋鳖甲均扩增获得约300 bp的特异性鉴别条带,混伪品无条带。该方法可作为一种快速准确鉴别鳖甲正伪品的鉴定方法。     

鳖甲抗肝纤维化活性多肽部位HPLC指纹图谱

目的:建立鳖甲抗肝纤维化活性多肽部位HPLC指纹图谱,全面完整地反映其内在化学信息,为鳖甲活性多肽部位的质量控制提供依据。方法:采用高效液相色谱法,ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.03%三氟乙酸梯度洗脱,检测波长220 nm,流速1 m L·min-1,柱温25℃。结果:建立了鳖甲抗肝纤维化活性多肽部位的HPLC指纹色谱,获得了13个共有峰;利用中药指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价,10批样品的相似度均0.9,提示鳖甲活性多肽质量较稳定。结论:该方法准确可靠,精密度、重复性和稳定性良好,能有效控制鳖甲活性多肽部位的质量,为进一步药效研究、制剂研发提供质量保证。     

鳖甲的本草考证

鳖甲是临床常用药物,现代对鳖甲的研究主要聚焦于实验研究及临床观察,鲜见文献研究.该文在系统查阅鳖甲古今文献的基础上,通过分析历代本草方书中的相关内容,对鳖甲的名称、基原、产地、品质评价、功效主治、炮制方法及用药禁忌进行全面考证.通过考证发现,在基原上,古籍文献所载的鳖甲当来源于中华鳖Trionyx sinensis的背...     

中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究

目的 本研究旨在建立一种简便、实用的鳖甲DNA分子鉴定方法。方法 根据中华鳖和鳖甲混淆品原动物的125rRNA基因片段的序列数据库,找出中华鳖与其它鳖科动物有明显区别的位点,设计1对能特异性鉴别中华鳖的引物,然后利用鳖甲中残存的DNA,通过PCR拉增,即可准确鉴别鳖甲。结果 用这对引物对不同来源的10块鳖甲进行鉴定结果表明,其中有3块为伪品,结果与DNA序列分析鉴定一致。还测定了斑龟和鳖甲一伪品12SrRNA基因片段序列。结论 该引物配置药材鉴定试盒可在鳖甲类药材鉴定使用。     

鳖甲活性多肽的提取及膜分离纯化工艺优选

目的： 优选鳖甲活性多肽的提取工艺及膜分离工艺。 方法： 以多肽提取量和浸膏得率为指标,通过正交试验考察料液比、提取时间、提取次数对鳖甲多肽提取工艺的影响;以膜渗透通量或膜效能为指标,运用单因素试验优选鳖甲活性多肽的膜分离工艺。 结果： 最佳提取工艺为醋鳖甲粉碎过24目筛,加6倍量水提取3次,每次3 h;多肽提取量达2.442 g,浸膏得率11.71%。膜分离纯化条件为鳖甲多肽质量分数6%,截留相对分子质量20,8 kD的超滤膜操作压力分别为0.18~0.21,0.8 MPa;蛋白质截留率83.67%,相对分子质量<8 000的鳖甲多肽纯度达57.62%。 结论： 膜分离技术可用于鳖甲活性多肽的制备。     

鳖甲水提物W-A-80在模拟胃肠液中消化情况分析

目的:研究鳖甲水提物W-A-80在模拟胃、肠环境中消化情况,探讨其体内转化形式.方法:采用水提醇沉法制备鳖甲水提物W-A-80,模拟胃肠液环境,于37℃消化.以寡肽产率为指标,通过双缩脲反应-酶联免疫检测仪法考察胃蛋白酶和胰蛋白酶于不同酶底比、酶解时间的寡肽(截留相对分子质量＜3 500)产率变化;平衡透析法测定模拟胃肠液消化后所得寡肽与体外小鼠肝组织的蛋白结合率.结果:确定酶解条件为人工胃液酶底比1∶10,于37℃酶解3h,不同质量浓度寡肽与肝组织的蛋白结合率分别为31.63％,19.93％,9.65％;人工肠液酶底比1∶100,于37℃酶解11h,不同质量浓度寡肽与肝组织的蛋白结合率分别为48.75％,47.43％,22.72％;均明显高于空白对照的7.00％,5.31％,4.60％.结论:鳖甲水提物W-A-80经模拟胃肠液消化有大量寡肽产生,且活性显著强于原液,推测寡肽可能是鳖甲抗肝纤维化的物质基础.