重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

重组人IL-29的原核表达、纯化及活性分析

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人白细胞介素-29(IL-29). 方法:用PCR技术扩增人IL-29成熟蛋白的编码序列,克隆入原核表达载体pET-44 Ek/LIC中,构建融合表达载体pET-44 Ek/LIC-IL-29,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达IL-29融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后用肠激酶消化除去N端融合标签得到完全天然状态的重组人IL-29,经N-端氨基酸测序鉴定纯化的IL-29,用细胞病变抑制法测定其活性. 结果:成功构建了表达载体pET-44 Ek/LIC-IL-29,DNA序列测定结果与预期结果一致. 在30℃培养条件下,IPTG诱导表达的IL-29融合蛋白占菌体蛋白总量43%左右,并且大部分以可溶形式存在. 纯化后的融合蛋白经肠激酶切割和回收后,所得目的蛋白(IL-29)纯度大于96%,该蛋白N-端序列与理论值一致,其抗病毒活性与IFN-α2b相当. 结论:获得了具有生物学活性的重组人IL-29.     

重组人IL-8在大肠杆菌中的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人IL-8（rhIL-8）大肠杆菌表达及纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB101，经3-吲哚丙烯酸诱导，在发酵罐中进行表达，比较不同诱导剂浓度、温度、pH值及时间，以获得最佳表达工艺参数。离心收集菌体，超声破壁，收集包涵体和胞浆，其中包涵体经变性、复性处理，与包浆部分合并，经肝素亲和层析柱、阳离子交换柱和凝胶层析柱分离纯化，比较不同的洗脱条件，得到纯品，并对重组蛋白的纯度和生物学活性进行鉴定。结果用大肠杆菌HB101在发酵罐中表达rhIL-8，在30℃、pH为7．0的条件下加入50mmol／L 3-吲哚丙烯酸，诱导28h，得到约为100mg／ml的高表达，其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在，经三步层析纯化后，得到高纯度的rhIL-8（纯度〉95％），经中性粒细胞趋化实验证实，所获IL-8具有良好的趋化白细胞迁移的作用。结论建立高效表达rhIL-8的原核表达和纯化工艺，所获的纯化IL-8具有良好的生物学活性。     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的 蛋白酶体激活亚单位3(PA28γ)的表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA2γ蛋白,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体;将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),诱导表达PA28γ蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白(GST-PA28γ);并用其免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,对表达产物和多抗血清进行Western-blot鉴定.结果 成功构建原核表达质粒PA28γ/pGEX-4T-1,且测序正确;获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清.并得到Western-blot证实.结论 成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清,为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础.     

人精子蛋白FSCB的表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：构建表达重组人精子蛋白FSCB的重组质粒,获得其纯化重组蛋白并制备其多克隆抗体.方法：分别成功构建了表达人精子全长FSCB蛋白和截短FSCB（FSCBt）蛋白的重组菌株BL21,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法和分子筛层析法纯化目的蛋白FSCBt,免疫接种雌性家兔制备多克隆抗体.结果：重组菌成功诱导表达了重组蛋白FSCB和FSCBt,相对表观分子量分别为230000和30000,重组蛋白FSCBt经纯化后纯度达到95%,制备的多克隆抗体效价达到1∶105,Western Blot显示多克隆抗体与重组蛋白FSCB和FSCBt均具有良好的反应性.结论：人精子蛋白FSCB在重组菌株中得到表达,成功制备高效价的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在人体组织中的表达、分布以及生物学功能奠定了实验基础.     

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建胱抑素C（cystatin C,Cys-C）原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a（＋）-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside,IPTG）诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank（NM-000099.2）中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20000,经Ni2＋-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。     

铁蛋白轻链的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:构建FTL的原核表达载体,获得FTL纯化蛋白,制备抗体,为研究其生物学作用奠定基础.方法:采用基因重组技术将PCR扩增的FTL基因产物与原核表达载体pET30a( )连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果,用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫日本大白兔,制备FTL多抗,采用Western印迹法检验抗体特异性.结果:成功地构建了FTL的原核表达载体,经大肠杆菌中诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到较纯的相对分子质量约25 800的融合蛋白,免疫日本大白兔后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与FTL蛋白特异性结合.结论:本研究获得FTL纯化蛋白,制备了FTL多克隆抗体,为进一步研究FTL的作用机制及其在肺癌组织中的表达情况奠定了基础.     

亲环素A的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

目的构建人亲环素A(CypA)基因的原核表达载体,诱导表达、纯化蛋白,制备抗体,为进一步研究其生物学作用奠定基础。方法以人肺癌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增CypA基因片段,克隆到pMD18-T载体中。扩增产物与原核表达载体pET30a(+)连接,构建表达质粒pET30a-CypA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用镍树脂亲和层析柱High-Affinity Ni-IDA Resin纯化表达产物,SDS-PAGE检测纯化蛋白。用获得的蛋白免疫大白兔,制备抗CypA蛋白多抗,采用蛋白印迹法检测抗体特异性。结果成功构建了CypA的原核表达载体,经大肠杆菌诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到纯度达80.2%的融合蛋白,免疫大白兔后得到多抗血清。蛋白印迹结果显示此多克隆抗体能与CypA蛋白特异性结合。结论成功获得CypA纯化蛋白及CypA多克隆抗体,为进一步研究CypA在肺癌中的作用机制奠定了基础。     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.     

大肠埃希菌Ⅵ型分泌系统相关蛋白多克隆抗体制备及分泌蛋白检测

目的为研究新近发现的大肠埃希菌(E.coli)Ⅵ型分泌系统的组成和功能,制备与之相关的三种重要蛋白AaiC、CRP和OmpA的多克隆抗体,并对分泌蛋白AaiC进行检测。方法采用PCR技术扩增出目的基因,并将其连接到pET-22b或pQE80原核表达载体中,酶切及测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达蛋白并纯化,使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体。应用AaiC抗体检测E.coli RS218菌株分泌蛋白。结果重组质粒构建成功,并能够在E.coli中高效表达,免疫得到AaiC、CRP和OmpA高效价的特异性多克隆抗体。AaiC抗体检测证实RS218菌株能够分泌AaiC蛋白。结论成功制备了E.coli三种重要蛋白AaiC、CRP和OmpA的特异性抗体,检测出RS218菌株分泌AaiC蛋白,为进一步研究E.coliⅥ型分泌系统的生物学功能以及E.coli的致病机制奠定了基础。     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

转录因子Blimp-1的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。     

空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】克隆、表达空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体。【方法】采用PCR方法从空肠弯曲菌Penner19标准株基因组中扩增出PEB1蛋白基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHTb中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的PEB1蛋白,并经Western-blotting证实。然后,在非变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化目的蛋白。用纯化的PEB1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。【结果】在非变性条件下用Ni2＋-NTA亲和色谱柱纯化PEB1融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%。用该融合蛋白免疫小鼠后,得到抗PEB1抗体,效价达1：2×105。【结论】成功构建了空肠弯曲菌PEB1基因原核表达载体,并获得了高纯度的PEB1蛋白及其高效价多抗,对进一步制备肠粘膜高亲和力的过敏原重组BCG打下了坚实的基础。     

人Tenascin-Raa454-1069蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的人Tenascin-R EGFL结构域（Tenascin-Raa454-1069）的融合蛋白,并制备相应的兔源性多克隆抗体（pAb）。方法 利用PCR从PMD18-T-TNR获得Tenascin-Raa454-1069编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-Tenascin-Raa454-1069融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清, Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果 成功构建了pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069原核表达载体,原核蛋白Tenascin-Raa454-1069以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的融合蛋白,蛋白浓度为1 600mg/L,制备的抗Tenascin-Raa454-1069多抗效价高达1∶1.6 ×106,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论 获得高纯度Tenascin-Raa454-1069蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究Tenascin-R的生物学功能提供实验基础。     

HBV 靶向核糖核酸酶基因的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备

目的旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体. 方法 将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化.通过SDS-PAGE 和 Western blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并以复性的蛋白作为抗原,用ELISA测定抗体的效价. 结果 成功地纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶,获得了较高效价的抗血清. 结论 获得纯化并复性的HBV靶向核糖核酸酶和多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础.     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。