大鼠骨髓MSCs体外分离培养及多向分化的实验研究

目的：建立骨髓MSCs体外分离培养体系，并进行多向分化诱导，以证实其多向分化潜能，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法：用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果：用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs，细胞增殖活性强。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性；免疫细胞化学染色提示神经向诱导神经元特异性标志蛋白NSE和NF200，成肌细胞标志蛋白Deamin和Connexin-43阳性表达。结论：采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系；并能够向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞分化。     

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性

目的：研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及基成骨细胞表型特征。方法：分离大鼠四肢长骨髓基质细胞,常规和矿化培养液培养,测定细胞生长曲线,碱性成纤细胞生长因子（bFGF）、重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2)及矿化培养液对骨髓基质细胞性磷酸酶（ALP）活性的影响,观察矿化结节的形成。结果：大鼠骨髓基质细胞群体倍增时间（DT）为66．1h;在矿化液培养条件下细胞DT为50．3h。bFGF和rhBMP－2均不同程度增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性。矿化液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,用茜素红染色法显示较多的深红色矿化结节。常规培养条件下大鼠骨髓基质细胞生长虽呈现密集单层,没有矿化结节形成。结论：大鼠骨髓基质细胞在体外可以稳定传代培养,在矿化培养液诱导培养条件下可以向成骨细胞分化,bFGF和rhBMP－2有助于骨髓基质细胞表现成骨细胞表型特征,提示骨髓基质细胞在骨移植研究领域有重要的应用价值。     

兔骨髓基质干细胞骨向诱导实验研究

目的:研究兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)的体外培养以及骨向诱导分化情况,进一步探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:无菌条件下抽取兔的股骨骨髓,然后进行骨髓基质干细胞的分离和体外培养,并向成骨细胞定向诱导分化。结果:体外分离的骨髓基质细胞呈贴壁生长,改良MTT法测定显示骨髓基质细胞于第7.8天左右可达到增殖高峰;诱导后BMSC可向成骨细胞分化,细胞呈成骨细胞形态为梭形和多角形并可形成钙化结节。改良钙钴染色法检测诱导细胞碱性磷酸活性呈强阳性。扫描电镜观察细胞呈较典型的成骨细胞状态,并可见钙盐沉积。结论:骨髓基质细胞具有来源充足,取材方便,创伤小无明显并发症。骨髓基质干细胞分化增殖能力较强,成骨能力确定。所以采用骨髓基质细胞作为种子细胞构建组织工程骨有比较可靠的依据。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导成骨细胞的研究

目的 为建立一种简便有效的下颌骨缺损修复治疗的新方法——利用体外分离纯化人骨髓间充质干细胞(marrowstromal cells,MSCs),诱导向成骨细胞转化后再用于临床。方法 Ficoll密度梯度离心后贴壁培养法,分离纯化MSCs体外培养,经连续传代培养,加入10-7mol/L地塞米松,10-2mol/Lβ-甘油酸钠,500 ug/L的维生素C诱导液。结果 MSCs诱导后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、细胞糖原染色鉴定为成骨细胞。结论 hMSCs经定向诱导显示成骨细胞特性,为临床下颌骨缺损组织工程修复提供种子细胞。     

扩增对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 :评价体外扩增对兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响 ,为骨组织工程提供功能活跃的种子细胞。方法 :分离、培养新生兔骨髓间充质干细胞 ,将扩增至2、6、10代 (P2、P6、P10)骨髓间充质干细胞分别用含地塞米松、β_甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液进行培养 ,观察它们经诱导培养后的增殖能力、碱性磷酸酶活性和钙化结节形成量的变化。结果 :低代细胞 (P2、P6)间的细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、钙化结节形成量无显著不同 ;高代细胞 (P10)与低代细胞比较 ,其增殖率明显降低 (P<0.05) ,碱性磷酸酶活性及钙化结节量也有降低趋势 (P>0.05)。结论 :骨髓间充质干细胞在10代内扩增 ,均能诱导分化为成骨细胞 ,可作为骨组织工程种子细胞。但高代细胞活性有不同程度的降低     

大白鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外培养体系，对大白鼠BMMSCs体外培养的条件，供体大白鼠鼠龄等进行了研究。对体外培养的大白鼠BMMSCs的形态学，增殖动力学，成骨的表面标记及体外钙化能力进行了系列研究，方法：取2月龄SD大鼠胫骨和股骨骨髓进行体外培养，取第二代BMMSCs,绘制生长曲线并计算群体倍增时间，对经成骨诱导剂诱导的BMMSCs的ALP表达及体外钙沉积进行了研究。结果：细胞呈长梭形或多角形，细胞表面有不规则的细胞突起，秀射电镜可见胞浆有大量的粗面内质网及线粒体，细胞表面可见突起，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为72小时，经诱导分化的BMMSCs可见碱性磷酸酶的表达。von Kossa染色可见散在深染的钙沉积班块。结论：来源于年轻大鼠股骨骨髓的间质干细胞体外培养并经诱导后可分化为具有部分成骨特性的细胞，可以为体内骨组织工程提供组织细胞。     

富血小板血浆诱导骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的研究

目的：体外观察不同浓度富血小板血浆（PRP）对自体骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性,对PRP诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化的生物学效应进行评价.方法：抽取狗静脉血及骨髓,采用改进Appel方法制备不同浓度的PRP;采用传代培养筛选法,获得足够数量稳定的骨髓基质细胞（BMSC）,酶动力学法检测碱性磷酸酶活性.结果：（1）原代培养的骨髓基质细胞24h开始贴壁,12d后细胞融汇成单层,细胞多呈成纤维梭形细胞形态,经诱导液传代培养后,细胞形态渐变为方形、多角形.（2）酶动力学法测定各实验组细胞第三、六、九、十二天检测碱性磷酸酶活性,经过配对t检验,各组第六、九、十二天的ALP活性水平均较第三天明显升高,低浓度PRP组较高浓度组碱性磷酸酶活性升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）.结论：一定浓度的PRP能促进骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性,PRP能有效的促使BMSC向前期成骨细胞分化.     

无机活性元素支架材料对颌骨缺损骨创面骨祖细胞的生物诱导作用

目的：应用颌骨术后缺损骨创面周围骨松质分离培养鉴定成骨细胞,并将其与无机活性元素支架材料在体外复合生长,探讨无机活性元素支架材料对骨祖细胞来源的成骨细胞生物学特性的生物诱导作用。方法：应用组织块贴壁法分离培养出成骨细胞,并用碱性磷酸酶（Burstone偶氮偶联法）染色法、茜素红染色法、透射电镜、流式细胞仪等对其碱性磷酸酶活性、钙结节形成情况、细胞的超微结构、细胞生长周期进行鉴定,然后将体外培养的成骨细胞与无机活性元素支架材料体外复合生长,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增殖能力、细胞周期变化的测定,评价细胞与材料的相容性。结果：颌骨术后缺损骨创面周围骨松质分离出的成骨细胞具有较强的碱性磷酸酶活性且有大量的钙结节形成,透射电镜观察其具有良好的分泌细胞特性,此成骨细胞与无机活性元素支架材料体外复合培养14 d,分布于支架材料的成骨细胞增殖良好,分泌细胞外基质并形成钙结节,细胞周期未见明显改变。结论：颌骨术后缺损骨创面周围骨松质中含有大量的骨祖细胞,具有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力。无机活性元素支架材料均具有较好的细胞相容性,与成骨细胞共同培养有望获得具有三维立体结构的组织工程骨。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

磷酸钙骨水泥胶原支架复合P物质对大鼠骨髓间充质干细胞特性影响研究

目的    因各种原因导致的牙槽骨甚至颌骨的缺损、缺失在临床上十分常见,对患者口腔功能和美观均可造成严重影响。磷酸钙骨水泥（CPC）是公认的具有良好生物相容性的可降解骨移植材料,与Ⅰ型胶原混合后可塑性增强,孔隙率增加且弹性模量更接近于人体骨。本研究通过人工合成神经递质P物质（SP）结合于CPC胶原支架材料,体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,观察材料表面形貌及对BMSCs生物学行为的影响。方法     2015年9月至2016年1月在第四军医大学口腔医院选取4周龄雌性大鼠20只,进行BMSCs体外培养。研究材料分为3组,A组：纯CPC组;B组：CPC＋Ⅰ型胶原组;C组：CPC＋Ⅰ型胶原＋SP组。扫描电镜（SEM）观察样本表面形貌及BMSCs形态、黏附与增殖。通过测定细胞增殖对数、成骨及成脂诱导对BMSCs进行鉴定,荧光染色定量分析BMSCs的黏附与增殖,成骨诱导液培养14 d后经茜素红染色,并通过碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞ALP活性。结果    原代BMSCs生长旺盛,生长曲线呈典型“S”形。成骨和成脂诱导液培养3周,行茜素红和油红O染色,镜下可见钙化结节及脂滴形成,BMSCs多向分化能力良好。SEM下B、C 组可见胶原与CPC联结紧密,胶原表面呈条索样间隙,表面BMSCs细胞与胶原附着数量多,突触长并彼此相联,细胞伸展良好。荧光显微镜下观察,C组表面活性细胞比例高于A、B 组。成骨诱导14 d后茜素红染色,肉眼观C组颜色较深,ALP检测C组BMSCs的ALP表达高于A、B 2组（P＜0.05）。结论    本研究构建的SP加载的CPC胶原复合材料支架对SD大鼠BMSCs的黏附、增殖和成骨分化均具有促进作用,为今后临床牙槽外科修复重建工作提供了新的思路方法和研究基础。     

密度梯度离心和贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成骨功能比较

目的　通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成骨功能,探索骨髓MSCs体外分离和纯化较好的方法,为MSCs进一步的试验研究提供依据。方法　应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs ,并通过MTT法检测其增殖活性。用第三代MSCs进行骨向诱导,以观察两种方法所获MSCs是否有相似的骨向分化能力。结果　密度梯度离心法所获MSCs纯度高,杂质细胞少,增殖活性强,常表现为梭形和小多角形,7到1 0天内便可达到融合。而贴壁法所获MSCs纯度低,红细胞、破骨样细胞等杂质细胞较多,增殖速度相对较慢,且经数次传代仍有较多杂质细胞存在。经骨向诱导后,两种方法所获MSCs表现出相似的ALP活性和矿化结节形成能力。矿化结节数目在两组比较无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论　密度梯度离心法是体外分离和纯化骨髓MSCs较好的方法,所获细胞增殖活性高。两种方法所获MSCs具有相似的骨向分化能力。     

人骨髓间质干细胞的培养及成骨功能研究

目的　体外扩增人骨髓间质干细胞 (humanbonemarrow derivedmesonchymalstemcells,hBMMSCs) ,研究其生物学特征及体内、外成骨功能。方法　分离培养hBMMSCs,并对其形态、增殖动力学、碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase,ALP)表达及体内、外成骨功能进行研究。结果　hBMMSCs可在体外培养扩增 ,群体倍增时间约为 3 5d。ALP检测表明 ,未经矿化诱导的hBMMSCs可表达少量ALP ,诱导后其表达量明显增高。vonkossa染色证实在矿化诱导液作用下hBMMSCs在体外可形成钙结节。体内成骨实验证实 ,1× 10 5个hBMMSCs接种到 30mm3 块状HA/TCP载体移植BALB/C裸小鼠皮下 3个月 ,可观察到层板状骨组织生成。结论　hBMMSCs是一种具有成骨潜能的前体细胞 ,经培养、扩增、诱导后 ,在体外可形成矿化结节 ,体内可在载体表面形成骨组织。     

骨缝间充质细胞体外成骨潜能及骨形成蛋白2对其成骨影响的研究

目的 研究骨缝来源的间充质细胞的体外成骨潜能及骨形成蛋白（BMP）2转染对其成骨分化的影响。 方法 取10 d左右的SD乳鼠颅骨矢状缝及缝边缘2 mm骨组织,分离培养骨缝间充质细胞。取第三代细胞进行骨向诱导,培养1周后进行碱性磷酸酶(ALP)染色。同时取第三代细胞进行BMP2转染,培养7 d和10 d时检测ALP活性。结果 ①骨缝间充质细胞在骨向诱导l周后,可见多数细胞开始呈簇状生长,大部分细胞呈ALP染色阳性;②BMP2转染的实验组与对照组比较,培养7 d和10 d ALP活性均明显增加（P<0.05）。结论 该方法所获得的骨缝来源的间充质细胞具有很强的体外增殖活性和良好的成骨能力;BMP2能够诱导骨缝间充质细胞成骨。     

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??Objective    The alveolar bone defect and loss caused by various reasons are very common in clinic??which can cause serious effects on the function and appearance of the oral cavity. Calcium phosphate cement??CPC??is recognized as a biodegradable bone graft material with good biocompatibility??and it is more similar to the human bone with the increase of the plasticity and porosity of??collagen after mixing. In this study??the artificial neural transmitter sp??substance P??was integrated in collagen CPC scaffold and SD rat bone marrow mesenchymal stem cells ??BMSCs?? were cultured in vitro to observe the surface morphology and the effects on biological behavior of BMSCs. Methods    From September 2015 to January 2016??20 female rats of 4 weeks old were selected from School of Stomatology?? the Fourth Military Medical University to culture BMSCs in vitro. Materials were divided into 3 groups??group A??pure CPC group??group B??CPC + type??collagen group??group C??CPC + type??collagen+P substance group. In the 4-week old female rats??BMSCs were cultured in vitro. Scanning electron microscopy??SEM?? was performed to observe the morphology??adhesion and proliferation of the sample surface and BMSCs. Through the determination of the logarithm of cell proliferation??osteogenic and adipogenic differentiation of BMSCs were identified??fluorescence staining was used to make quantitative analysis of BMSCs adhesion and proliferation??osteogenic induction medium was used for culture for 14 days and stained by alizarin red??and the ALP kit was used for the detection of ALP activity. Results    The growth of the primary BMSCs was strong??and the growth curve was in typical “S” shape. Three weeks after the culture with osteogenic and adipogenic induction medium??alizarin red and oil red O was used for staining??and microscopy showed formation of calcified nodule and lipid droplet. BMSCs differentiation capacity was good. Under SEM group B and C showed that the collagen and CPC were closely connected?? and there was a kind of gap on the surface. On the surface there were many BMSCs and collagen attached??the synapse was long and connected with each other??and the cells extended well. Under the fluorescence microscope??the ratio of living cells in group C was higher than group A and B. After osteogenic induction of 14 days??alizarin red was used for staining??and group C was darker with naked eyes. With ALP detection??the expression of ALP of BMSCs in group C was higher than that of group A and B ??P??0.05??. Conclusion    In this study??we constructed the substance P loading of CPC collagen composite scaffold played an important role in adhesion??proliferation and bone differentiation of SD rats BMSCs??provided a new method and research foundation for future clinical alveolar surgical repair and reconstruction work.     

淫羊藿素对 SD 大鼠骨髓基质细胞增殖与成骨分化的影响

目的：研究淫羊藿素（ICT）对体外培养 SD 大鼠骨髓基质细胞（rBMSCs）增殖与成骨分化的影响。方法：体外分离培养 rBMSCs,传代至第4代作多向分化鉴定。分别以10－9、10－8、10－7、10－6、10－5 mol／L ICT 刺激 rBMSCs 后3、6、9 d,分别用 cck-8及碱性磷酸酶 ALP 试剂盒检测 rBMSCs 的增殖及 ALP 活性;10－9 mol／L ICT 处理 rBMSCs 后21 d 作茜素红（AR）染色以判断钙结节的形成。结果：原代培养的 rBMSCs 贴壁生长、呈梭形,能多向分化;ICT 明显抑制了 rBMSCs 的增殖;但增高其 ALP 活性、钙结节形成。结论：ICT 以剂量依赖方式抑制 rBMSCs 的增殖但促进其分化和矿化。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

骨纤维异常增殖症病变中骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索从骨纤维异常增殖症(FD)病变组织中分离、培养骨髓间充质干细胞(MSC)的有效方法,为研究骨纤维异常增殖症的病因及发病机制奠定基础.方法:取FD患者新鲜病变组织,将其剪碎后冲洗,获得骨髓间充质干细胞.进行培养,观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,检测其细胞表面标志物及向成骨细胞的诱导分化能力.结果:培养的骨髓干细胞随传代次数增多,细胞形态趋向长梭形,99%的细胞表达CD44和HLA-ABC,不表达CD34;可见诱导后的MSC碱性磷酸酶染色阳性,并形成钙结节.结论:在新鲜FD骨标本中可以成功提取MSC,其在体外具有诱导成骨的能力,获取到的MSC可以满足后续实验的要求.     

兔骨髓干细胞和脂肪干细胞体外成骨能力的比较

目的:评价两种不同来源的间充质干细胞,即骨髓干细胞(BMSC)和脂肪干细胞(ADSC)的体外成骨能力,为其将来应用于细胞治疗和组织工程研究提供一定的理论依据。方法:分别取同一只兔的髂骨骨髓和腹股沟脂肪作为BMSC和ADSC的来源,分离培养后比较成骨、成脂分化潜能,细胞表面抗原标记物;成骨诱导后检测碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR分析其成骨相关基因的表达情况。结果:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能;在成骨诱导分化后,BMSC有较高的ALP活性和较多的钙结节形成。RT-PCR结果显示:BMSC表达较高的BMP-2、OCN和OPN等成骨基因。结论:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能,ADSC有较好的成脂分化能力,BMSC有较好的成骨分化能力;两者都可以作为组织工程的种子细胞。