糖尿病大鼠早期视网膜神经节细胞凋亡机制的探讨

目的：探讨糖尿病大鼠模型早期视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的机制。

方法：SD大鼠60只,随机分为对照组(CON)及糖尿病组(DM),糖尿病组一次性腹腔注射1% STZ诱发糖尿病鼠模型,两组于第4,8,12wk分别行HE、透射电镜及TUNEL法检测RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子浓度的变化。

结果：糖尿病组第8wk开始出现RGCs数量减少、细胞排列紊乱的病理改变,第12wk更为明显。糖尿病组透射电镜下可见第4wk时RGCs出现线粒体肿胀; 第8wk时RGCs内肿胀的线粒体更为明显、数目增多,染色质边集于核膜周边,部分细胞体积缩小、细胞器减少; 第12wk时出现RGCs体积变小,甚至出现细胞核断裂。TUNEL阳性RGCs最早于糖尿病组第4wk时出现,随病程延长凋亡的阳性细胞逐渐增多,凋亡指数与同期对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病组第8,12wk时RGCs内钙离子浓度明显高于同期对照组,差异显著(P<0.01); 糖尿病组第8wk与第12wk比较,升高差异亦有统计学意义(P<0.05)。

结论：糖尿病早期出现了视网膜神经节细胞的凋亡,其机制可能与细胞内钙离子浓度升高有关。     

洛美利嗪对膳食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠视网膜神经节细胞凋亡的保护作用

目的：探讨洛美利嗪(LOM)对高脂饮食诱导的C57BL/6J肥胖小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的保护作用。

方法：小鼠54只随机分为两组,高脂饲料喂养19wk,其中一组同时每天按80mg/kg给予LOM灌胃。筛选出肥胖组(DIO)和肥胖+洛美利嗪组(DIO+LOM),对照组(CON)小鼠给予基础饲料。至第19wk末,应用透射电镜观察各组小鼠RGCs的超微结构改变,采用TUNEL法检测各组小鼠RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。

结果：透射电镜结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠RGCs体积变小,细胞质分布紊乱,核染色质发生固缩,而DIO+LOM组小鼠RGCs的形态学改变较DIO组明显减轻。TUNEL法检测结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠GCL层可见较多的凋亡细胞,其细胞凋亡率显著升高(P<0.01),DIO+LOM组RGCs的凋亡率与DIO组比较显著降低(P<0.05)。激光共聚焦结果显示,与CON组比较,DIO组小鼠RGCs内Ca²⁺荧光染色明显增强,其荧光染色强度比值显著升高(P<0.01),而DIO+LOM组RGCs内Ca²⁺荧光染色强度较DIO组有明显下降(P<0.01)。

结论：洛美利嗪对肥胖引起的RGCs的损伤和凋亡具有保护作用,其机制可能与减轻细胞内Ca²⁺超载有关。     

膳食诱导的肥胖型C57BL/6小鼠视网膜神经节细胞凋亡的机制

目的：探讨高脂饮食诱导的C57BL/6肥胖小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的机制。

方法：高脂饲料喂养19wk后,小鼠分为肥胖抵抗(DIO-R)组和肥胖倾向(DIO)组,同时对照组(CON)小鼠给予基础饲料。TUNEL法检测各组小鼠RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。

结果：TUNEL法凋亡检测结果显示,DIO组小鼠视网膜神经节细胞层可见较多黄色着染的凋亡细胞,其凋亡指数为(6.7±1.2)%,显著高于对照组和DIO-R组(P<0.01,P<0.05); 对照组和DIO-R组间比较无显著差异(P>0.05)。激光共聚焦结果显示,与对照组和DIO-R组比较,DIO组小鼠视网膜神经节细胞内Ca²⁺荧光染色明显增强,其荧光染色强度比值显著升高(均P<0.01); 对照组和DIO-R组视网膜神经节细胞内Ca²⁺荧光染色强度无明显差异(P>0.05)。

结论：细胞内钙离子超载可能介导了肥胖型C57BL/6小鼠视网膜神经节细胞的凋亡过程。     

姜黄素对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响及机制

目的：探讨姜黄素对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响及机制。

方法：将21只SD大鼠随机分为3组,每组7只,高眼压模型组和姜黄素治疗组大鼠通过烧灼巩膜上静脉法建立慢性高眼压模型,假手术组大鼠仅剪开球结膜,不烧灼巩膜上静脉; 姜黄素治疗组给予4mL/kg姜黄素灌胃,假手术组和高眼压模型组给予4mL/kg纯水灌胃,连续3wk。造模后3wk,采用HE染色观察各组大鼠视网膜组织形态病理变化、RGCs数量及神经节细胞层(GCL)厚度; 采用TUNEL染色观察各组大鼠RGCs和视网膜细胞凋亡情况; 采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色和Western blot法检测各组大鼠视网膜谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)与血红素加氧酶-1(HO-1)的表达水平。

结果：与假手术组相比,高眼压模型组和姜黄素治疗组大鼠视网膜组织形态紊乱,RGCs数量减少,GCL变薄,RGCs和视网膜细胞凋亡率均升高,GCLM和HO-1表达量均升高; 与高眼压模型组相比,姜黄素治疗组大鼠视网膜组织形态基本正常,RGCs数量增多,GCL增厚,RGCs和视网膜细胞凋亡率均降低,GCLM和HO-1表达量均升高。

结论：姜黄素在慢性高眼压大鼠模型中可通过上调抗氧化基因GCLM与HO-1的表达抑制RGCs凋亡。     

NgR-Rhoa-Rock信号通路在早期糖尿病大鼠RGC凋亡中的作用

目的： 研究NgR-Rhoa-Rock信号通路在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞凋亡中的作用及机制。

方法：健康SD大鼠,以50mg/kg体质量单次腹腔注射1%链脲佐菌素的方法处理,以血糖值大于16.7mmol/L定为糖尿病模型; 然后随机分成3组,每组10只。另取10只健康SD大鼠作对照组。再依次对4组大鼠进行双侧眼球玻璃体腔内注射NgR小干扰病毒10μL(siRNA组)、NgR小干扰病毒稀释液10μL(DM组)、NgR小干扰病毒阴性对照液10μL(siRNA空白组)、NgR小干扰病毒稀释液10μL(正常对照组),正常喂养。期间对血糖、体质量等一些生命指标进行观查、测量并记录。12wk后,行视网膜Western blot检测NgR、Rhoa的表达,HE染色、TUNEL染色。

结果：Western检测：与正常对照组相比,DM组和siRNA空白组中NgR、Rhoa表达明显增加(P<0.01),而siRNA组无明显变化(P>0.05); 与DM组和siRNA空白组相比,siRNA组NgR、Rhoa表达明显下调。HE染色：与正常对照组相比,三组模型鼠均有不同程度节细胞排列紊乱、形态不规则、间距不一致; 与DM组和siRNA空白组相比,siRNA组节细胞在排列顺序、外形大小等有一定程度改善。TUNEL染色：与正常对照组相比,三组模型鼠均有节细胞凋亡; 与DM组和siRNA空白组相比,siRNA组凋亡细胞数量较少,细胞外形有明显改善。

结论：DM时大鼠视网膜NgR、Rhoa表达上调,抑制NgR-Rhoa-Rock可以改善糖尿病视网膜神经节细胞的凋亡。     

大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞自噬和副凋亡的发生

目的：观察急性高眼压后不同时间点大鼠视网膜神经节细胞中自噬及副凋亡的发生,并探讨其机制。

方法：将50只健康成年SD雄性大鼠随机分为正常对照组、急性IOP损伤3d,1、4、8wk组。利用高眼压(elevated intraocular pressure,IOP)前房灌注法建立SD大鼠急性IOP损伤模型,取各组大鼠的视网膜组织,采用免疫荧光染色法检测视网膜微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达; 利用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞质中自噬体及胞质空泡的产生,验证自噬及副凋亡的发生。

结果：透射电镜观察可见大鼠RGCs细胞质中包裹着电子致密物的双层或多层膜的自噬泡,正常对照组、急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组,RGCs细胞质中每50μm²自噬泡数量分别为0.79±0.43、2.14±0.36、2.29±0.47、1.57±0.51、1.21±0.43个,急性IOP损伤后各组大鼠RGCs内每50μm²自噬泡数量均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)仅见少量LC3阳性表达,LC3阳性细胞百分比15.90%。急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠GCL中LC3阳性细胞百分比均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠每200μm内RGCs数量较正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。急性IOP后3d持续至8wk透射电镜观察可见大量由线粒体和/或内质网肿胀形成的细胞质空泡。

结论：急性IOP损伤后RGCs涉及自噬和副凋亡的激活,各种类型的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存,参与急性IOP后视网膜神经节细胞的损伤。     

糖尿病大鼠早期视网膜形态观察和Bcl-2、Bax及VEGF表达的意义

目的：探讨B-细胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma factor,Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-Associated X protein,Bax)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在早期糖尿病大鼠视网膜上的表达及意义。

方法：用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射(60mg/kg)制作大鼠早期糖尿病模型。于造模后4、8、12wk颈椎脱臼法处死大鼠,取双眼全眼球组织做石蜡切片并做视网膜铺片,通过HE染色观察视网膜各层的形态学和血管分布变化; 取双眼视网膜组织石蜡切片,通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax和VEGF在视网膜组织中的表达。行ADP酶视网膜血管染色,观察视网膜血管形态变化。应用激光共聚焦显微镜检测视网膜细胞的形态、细胞中Ca²⁺的荧光强度和分布变化。

结果：糖尿病组造模12wk突破内界膜的内皮细胞核个数呈递增趋势。糖尿病组视网膜中周部和周边部可见无血管区,无血管区面积也明显大于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠VEGF、Bcl-2和Bax光密度值与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠造模4、8、12wk比较,RGCs内钙离子荧光浓度逐渐升高,荧光染色强度比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：早期糖尿病大鼠视网膜的Bcl-2和Bax表达非常明显,从而上调 VEGF的表达。Bcl-2、Bax和VEGF是糖尿病视网膜病变中新生血管形成的重要影响因素。     

大鼠糖尿病视网膜病与结缔组织生长因子的关联及血栓通的干预作用

目的：探讨结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对大鼠糖尿病视网膜病变的影响及复方血栓通可能的保护机制。

方法：SD大鼠36只随机分为对照组(A组,n=12)和造模组(n=24),造模组注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg,造模成功后随即分为糖尿病组(B组,n=12)、复方血栓通干预组\〖C组,1g/(kg·d),n=12\〗,于实验第6、12wk分别在各组处死6只大鼠,RT-PCR方法检测视网膜组织中CTGF mRNA水平。

结果：与A组相比,B组、C组大鼠视网膜CTGF mRNA于第6、12wk表达均增加(均P<0.05),C组视网膜组织CTGF mRNA表达于第6、12wk均较B组明显下调(P<0.05); 电镜显示B组大鼠视网膜毛细血管内皮细胞肿胀,胞质内线粒体肿胀,吞饮小泡增多,毛细血管基底膜电子密度不均匀,有结节样增厚现象,C组视网膜病变较B组减轻。

结论：CTGF可能参与糖尿病视网膜病变发生,复方血栓通对糖尿病大鼠视网膜具有保护作用,可能通过下调CTGF mRNA产生作用。     

骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植对大鼠青光眼模型视神经的保护作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植对大鼠青光眼模型的神经保护作用。

方法：提取大鼠原代骨髓间充质干细胞并进行鉴定; Lewis大鼠分别随机分为3组：对照组、青光眼模型组和骨髓间充质干细胞组,并制作青光眼大鼠模型：左眼为实验眼(青光眼),右眼为对照眼,并进行鉴定; 然后进行骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植; HE染色观察视网膜组织形态; 免疫荧光法检测视网膜神经节细胞数量; TUNEL染色观察视网膜神经节细胞凋亡情况; Western blot检测视网膜组织中IGF1和BDNF蛋白表达情况。

结果：大鼠实验眼的眼内压均明显高于对照眼(P<0.01),表明青光眼大鼠模型均建造成功; 青光眼模型组大鼠视网膜神经纤维排列不整齐,视网膜神经节细胞数量和视网膜厚度显著低于对照组(P<0.01),视网膜神经节细胞凋亡数量显著高于对照组(P<0.001); 骨髓间充质干细胞组大鼠视网膜神经纤维细胞排列较整齐,视网膜神经节细胞数量和视网膜厚度明显高于青光眼模型组(P<0.05),视网膜神经节细胞凋亡数量明显低于青光眼模型组(P<0.05); 青光眼模型组大鼠视网膜中IGF1和BDNF蛋白表达量明显低于对照组(P<0.01),骨髓间充质干细胞组大鼠的视网膜中IGF1和BDNF蛋白表达量高于青光眼模型组(P<0.05)。

结论：骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植能改善大鼠青光眼,可以保护视网膜神经节细胞。     

大株红景天对糖尿病视网膜病变大鼠眼血流影响的实验研究

目的：探讨大株红景天对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠眼血流的影响。

方法：将90只SD大鼠随机分为对照组、模型组和干预组各30只。模型组和干预组大鼠高糖高脂饲料喂养+链脲佐菌素(40mg/kg)腹腔注射，以构建DR模型大鼠，同时对照组大鼠基础饲料喂养+等量生理盐水腹腔注射。造模成功后，干预组大鼠注射大株红景天注射液(10mL/次，1次/d)，对照组和模型组大鼠注射等量生理盐水。连续干预治疗4wk。采用Laser Doppler Flowmetry激光血流仪检测大鼠眼部血流，采用TUNEL法检测大鼠视网膜细胞凋亡，采用 RT-PCR法和Western blot法检测大鼠视网膜组织血管内皮生长因子(VEGF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酸/天冬氨酸转运体(GLAST)表达。

结果：模型组和干预组大鼠全血粘度、全血粘度高切、全血粘度低切和血沉高于对照组(P<0.01)，而干预组大鼠各指标较模型组降低(P<0.01)。模型组和干预组大鼠PSV和EDC低于对照组(P<0.01)，RI高于对照组(P<0.01)； 而干预组大鼠PSV和EDC较模型组增加(P<0.01)，RI较模型组降低(P<0.01)。模型组和干预组大鼠视网膜细胞凋亡率大于对照组(P<0.01)，而干预组凋亡率较模型组降低(P<0.01)。模型组和干预组大鼠视网膜组织VEGF和GFAP 表达高于对照组(P<0.01)，GLAST表达低于对照组(P<0.01)； 而干预组大鼠VEGF和GFAP表达较模型组降低(P<0.01)，GLAST表达较模型组增加(P<0.01)。

结论：大株红景天注射液能显著改善糖尿病视网膜病变模型大鼠眼部血液流变学和血流动力学，减少模型大鼠视网膜细胞凋亡，下调视网膜组织VEGF和GFAP表达，上调GLAST表达。     

膳食诱导的肥胖型 C57 BL／6小鼠视网膜神经节细胞凋亡的机制

目的：探讨高脂饮食诱导的C57 BL/6肥胖小鼠视网膜神经节细胞（ RGCs）凋亡的机制。 方法：高脂饲料喂养19 wk后,小鼠分为肥胖抵抗（ DIO-R）组和肥胖倾向（ DIO）组,同时对照组（ CON）小鼠给予基础饲料。 TUNEL法检测各组小鼠RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。 结果：TUNEL法凋亡检测结果显示,DIO组小鼠视网膜神经节细胞层可见较多黄色着染的凋亡细胞,其凋亡指数为（6．7±1．2）％,显著高于对照组和DIO-R组（P＜0．01, P＜0．05）;对照组和DIO-R组间比较无显著差异（ P＞0.05）。激光共聚焦结果显示,与对照组和DIO-R组比较,DIO组小鼠视网膜神经节细胞内Ca2＋荧光染色明显增强,其荧光染色强度比值显著升高（均P＜0．01）;对照组和DIO-R组视网膜神经节细胞内Ca2＋荧光染色强度无明显差异（P＞0．05）。 结论：细胞内钙离子超载可能介导了肥胖型C57 BL/6小鼠视网膜神经节细胞的凋亡过程。     

罗格列酮对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的　观察过氧化物酶体增生物激活受体-γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ-γ,ＰＰＡＲ-γ）激动剂罗格列酮对链脲佐菌素诱导的早期糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ,ＤＭ）大鼠视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓ,ＲＧＣｓ）凋亡的影响,进而从分子学水平上阐明ＰＰＡＲ-γ激动剂对糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）的保护作用,为预防及早期治疗ＤＲ提供一种新思路。方法　选择９０只健康的雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为三组:正常对照组、ＤＭ＋罗格列酮组和ＤＭ组,进一步将每组大鼠分为给药后４周、８周和１２周三个时间点进行观察。采用一次性腹腔注射５０ｍｇ?ｋｇ－１链脲佐菌素的方法建立ＤＭ大鼠模型。自ＤＭ模型成模后第３天起,ＤＭ＋罗格列酮组大鼠每天给予罗格列酮３ｍｇ?ｋｇ－１灌胃,正常对照组和ＤＭ组每天给予等体积的生理盐水灌胃。于给药后４周、８周和１２周处死各组大鼠,处死前测各组大鼠的血糖和体质量,然后摘除左眼球制成眼杯,采用ＴＵＮＥＬ法测定各组大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡指数,并作对比。结果　给药后４周、８周和１２周,ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠血糖水平均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠的体质量均较正常对照组降低（均为Ｐ＜０．０５）。正常对照组大鼠ＲＧＣ层上仅见少量的凋亡细胞;各时间点ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数较ＤＭ组明显降低（均为Ｐ＜０．０１）;ＤＭ组和ＤＭ＋罗格列酮组大鼠ＲＧＣｓ的凋亡指数均明显高于正常对照组（均为Ｐ＜０．０１）。结论　外源性ＰＰＡＲ-γ激动剂罗格列酮能够抑制ＤＭ大鼠视网膜上ＲＧＣｓ的凋亡,对早期ＤＭ大鼠视网膜具有保护作用,有望成为ＤＲ新的治疗手段。     

实验性糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡和微血管改变及结缔组织生长因子的表达

目的 研究糖尿病大鼠视网膜凋亡细胞和结缔组织生长因子(CTGF)表达情况及其在微循环改变中的作用.方法 实验研究.55只成年雄性Wistar大鼠,以随机数字表法,随机分为正常对照(CON)组(10只鼠)和糖尿病(DM)组(45只鼠).根据病程不同,将存活的30只DM组大鼠再分为2个月组(DM2)、4个月组(DM4)及6个月组(DM6),每组各10只鼠.用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测视网膜凋亡细胞,用免疫组织化学法测定CTGF表达水平,以视网膜消化铺片过碘酸雪夫(PAS)染色法观察视网膜血管改变情况.观察并比较不同病程的DM大鼠视网膜凋亡细胞及CTGF表达情况、视网膜微血管形态变化及周细胞数量变化.对各组大鼠视网膜的细胞凋亡指数、CTGF表达阳性率及血管周细胞数量进行比较采用LSD-t检验法,两变量间的相关性分析采用线性相关法.结果 CON组大鼠视网膜细胞凋亡和CTGF表达均阴性.DM2组、DM4组、DM6组大鼠视网膜细胞凋亡指数分别为0.05±0.01、0.25±0.03及0.52±0.02;组间两两比较,差异均有统计学意义(DM2与DM4组比较t=21.432,DM2与DM6组比较t=50.843,DM4与DM6组比较t=29.410;P<0.05),表明随DM病程延长,视网膜凋亡指数逐渐增加.DM2组、DM4组、DM6组大鼠视网膜CTGF表达阳性率分别为(22.79±2.99)%、(41.73±2.59)%、(55.27±2.68)%,组间两两比较,差异均有统计学意义(DM2与DM4组比较t=15.345,DM2与DM6组比较t=26.316,DM4与DM6组比较t=10.971;P<0.05),表明随DM病程延长,视网膜CTGF表达水平逐渐增高.CON及DM2组大鼠视网膜血管走形良好,DM4组大鼠视网膜部分血管渐变僵硬、狭窄;DM6组大鼠视网膜血管主干僵硬,部分微血管狭窄明显.与CON组视网膜血管周细胞数量对比,DM2组未见明显变化;随病程延长,DM4组和DM6组大鼠视网膜血管周细胞数量较CON组逐渐减少,差异均有统计学意义(t=3.367,6.667;P<0.05).DM大鼠视网膜细胞凋亡指数与CTGF阳性表达水平呈显著正相关(r=0.958,P<0.05),凋亡指数和CTGF阳性表达水平与视网膜血管周细胞数量均呈显著负相关(r=-0.540,-0.595;P<0.05).结论 在DM大鼠视网膜组织中,凋亡细胞和致纤维化因子CTGF的产生均早于微循环血管走形及周细胞的改变.(中华眼科杂志,2011,47:521-526)

Abstract：

Objective To study the cell apoptosis and the expression of connective tissue growth factor (CTGF) in the retina of diabetic rats and to explore their contributions to the changes of microcirculation. Methods It was a experiment study. Fifty-five adult male Wistar rats were divided into two groups, normal control group (CON,10 rats) and diabetes mellitus group (DM, 45 rats). The 30 surviving rats in the DM group were further divided into 3 groups based on the time of observation, 2 month (DM2), 4 month (DM4) and 6 month (DM6) groups, with 10 rats in each group. Cell apoptosis was detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). Expression of CTGF was determined by immunohistochemical study. Retinal vessels were observed by retinal digest stretched periodic acid Schiff (PAS) staining. Results Immunohistochemical staining and TUNEL staining revealed negative results in normal control group. Retinal cell apoptosis index increased gradually from DM2 to DM6, the differences between any two groups were statistically significant (t2-4,2-6,4-6=21.432, 50.843, 29.410;P<0.05). Expression of CTGF in the retina increased from DM2-DM6, the differences between any two groups were statistically significant (t2-4,2-6,4-6=15.345, 26.316, 10.971;P<0.05). PAS staining of retinal blood vessels obtained negative results in the CON and DM2 groups. Part of retinal capillaries were slightly stiff and narrow in DM4 group. Retinal capillaries in DM6 group were trunk stiff and were narrowed obviously. The number of pericytes was reduced in DM4, and progressed following the course of diabetes. The number of pericytes in the DM2 group did not different from that in the CON group (t=0.875,P=0.387). The number of pericytes in the DM4 and DM6 group were significantly decreased as compared to the CON group (t=3.367,6.667;P<0.05). Retinal cellular apoptosis index had a significant positive correlation to the expression of CTGF (r=0.958,P<0.05). Number of pericytes was significantly correlated (negative correlation) with retinal cellular apoptosis index and the expression of CTGF (r=-0.540, -0.595; P<0.05). Conclusions The appearances of cellular apoptosis and fibrosing factor CTGF in the retina of diabetic rats occurred earlier than the changes of microcirculation and the number of capillary pericytes.     

SD大鼠视网膜神经节细胞体外分离培养及高糖模型建立

目的：体外分离新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs),建立新生SD大鼠RGCs体外原代培养方法及高糖模型。

方法：取15～20只出生1～3d SD大鼠的视网膜组织,分离纯化RGCs进行原代培养。甲苯胺蓝法及免疫荧光细胞染色法进行鉴定。细胞连续培养48～72h后,随机分为6组并分别加入含不同葡萄糖浓度5.5、20、25、30、35、40mmol/L的培养基培养24、48、72h,采用CCK8法及TUNEL凋亡检测法分析各组细胞存活率及凋亡率。

结果：离体纯化原代培养的RGCs具有典型的细胞形态且生长良好,细胞之间呈小片状融合聚集生长,轴突相互交错成网络状,胞体周围可见细胞光晕。甲苯胺蓝着染细胞胞质中可见结构清晰的尼式小体,神经元率达95%以上。RGCs特异性抗体Thy-1、Brn-3a定体外纯化培养细胞,阳性率达90%以上。CCK8检测发现随着时间及葡萄糖浓度的增加,各组细胞的存活率降低; 在不同葡萄糖浓度干预细胞24h时,各分组之间OD值均小于正常对照组,但与正常对照组相比较OD值大小无差异(均P>0.05); 随着时间延长,35、40mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h,30、35、40mmol/L干预RGCs 72h时的OD值较正常对照组OD值明显降低(均P<0.05)。TUNEL检测发现随着葡萄糖浓度及时间的增加,RGCs凋亡率增加。其中葡萄糖浓度为30、35、40mmol/L培养RGCs 48、72h后RGCs细胞凋亡率与正常对照组相比较有差异(均P<0.05)。

结论：本研究建立的RGCs体外原代培养方法能获得典型且纯度较高的RGCs,随着葡萄糖浓度的增加,体外纯化培养的RGCs存活率降低,凋亡率增加。35mmol/L葡萄糖浓度干预RGCs 48h可为有效诱导RGCs建立高糖模型最佳干预浓度及时间。     

糖皮质激素对糖尿病大鼠视网膜病变的影响

目的：探讨糖皮质激素对糖尿病( diabetes mellitu,DM)大鼠视网膜神经组织的损伤作用及机制。
　　方法：利用链脲佐菌素诱导大鼠DM模型,玻璃体内注射腺病毒( DM组)或腺病毒包装的糖皮质激素受体反义寡核苷酸( siGR组)、阴性核苷酸序列( scRNA组)。另取正常SD 大鼠,玻璃体腔注射腺病毒为对照组( CON 组)。12wk后,HE染色检测视网膜神经节细胞( retinal ganglion cell,RGC)密度,测量大鼠视网膜厚度,免疫组织化学和Western-blot检测ROCK表达变化。
　　结果：与CON组相比,DM组、siGR组及scRNA组糖皮质激素浓度均明显升高(均 P<0.01)。 HE 染色显示,与CON组相比,DM组及scRNA组RGC密度明显降低,视网膜厚度下降,ROCK的蛋白表达增加(均P<0.01),而siGR组无明显变化(均P>0.05)。
　　结论：抑制糖皮质激素能下调糖尿病大鼠视网膜ROCK表达,恢复视网膜RGC密度降低及视网膜厚度。