多重定量PCR法同步检测HBV、HCV和HIV-1在血液筛查中的优化及应用

目的 初步探讨多重定量聚合酶链反应（PCR）同步检测乙型肝炎病毒（HBV） DNA,丙型肝炎病毒（HCV） RNA及人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 RNA在血液筛查中的应用前景.方法 选择2012年8月至12月,于孝感市中心血站志愿献血的合格献血者血样中,经2次酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV表面抗原（HBsAg）、抗HCV及抗HIV-1,检测结果均呈阴性的4 800份血样为研究对象.采用全自动核酸混合提取仪对该4 800份血样进行核酸提取,然后利用多重定量PCR方法对血样中HBV、HCV及HIV-1进行同步扩增检测.采用中国药品和生物制品检定所提供的HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA标准参考品,检测多重定量PCR的灵敏度,并与单重定量PCR的灵敏度进行比较.在HBV、HCV及HIV-1 3者中任意1种病毒基因组浓度较高的条件下,对多重定量PCR检测另2种低浓度病毒基因组的能力进行评估.结果 增加多重定量PCR中c-MMLV逆转录酶和Hot Taq酶的用量,并适量加入单链结合蛋白（SSB）,可使其扩增效率提升至单重定量PCR扩增水平.本组4 800份血样中,经多重定量PCR检测出3份HBV DNA阳性样品,ELISA漏检率为0.062 5％,未发现HCV RNA和HIV-1 RNA阳性样品;多重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为115 IU/mL、376 IU /mL和232 IU /mL;单重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为51 IU /mL、94 IU /mL和78 IU/mL.结论 本研究初步建立了对献血者血液同时进行HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA检测的多重定量PCR检测方法;该检测体系经过进一步优化后,有望应用于临床大规模血液病毒筛查.     

实时定量PCR技术在角膜移植供体乙型肝炎病毒筛查中的应用

目的:探讨采用实时定量PCR技术对角膜移植材料进行HBV DNA筛查的可行性.方法:采用实时定量PCR技术对22例角膜移植供体血样和球外筋膜、角膜、色素膜中HBVDNA进行定性和定量分析.比较血样标本和眼组织中检测HBV DNA的特异度、敏感度及不同眼组织中HBV DNA载量的差异.结果:在18例HBV阳性和4例HBV阴性的供体材料中,血样、球外筋膜、角膜和色素膜组织HBV DNA检测的敏感度分别为83％ (15/18)、100％(18/18)、83％ (15/18)和78％ (14/18),检测的特异度均为100％.对球外筋膜、角膜和色素膜HBVDNA的定量分析显示,单位质量色素膜中HBV DNA的载量最高,球外筋膜和角膜HBV DNA载量比较差异无统计学意义.结论:应用实时定量PCR技术检测球外筋膜中HBV DNA可以作为一种角膜移植供体病原体筛查的检测手段.     

核酸扩增技术在广州市献血员血液筛查中的应用价值

【目的】评价核酸扩增技术（NAT）在广州市献血员血液筛查的应用价值。【方法】收集22139名无偿献血员血样,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、梅毒螺旋体（TP）和人免疫缺陷病毒（HIV）,并检测谷丙转氨酶（ALT）水平。对四项ELISA检测阴性和ALT≤40U／L者血样,用COBASs201系统进行HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA检测。NAT反应性样本、HBV、HCV和HIVELISA检测阳性血样以COBASAmpliScreen试剂盒鉴定。【结果】22139名献血员中,21776例双试剂血清免疫学检测阴性,其中19例为NAT反应阳性,检出率0．087％（19／21776）,后经NAT鉴定检测,HBV、HCV和HIV反应阳性检出率分别为0．051％（11／21776）、0．028％（6／21776）和0．009％（2／21776）。126例HBsAg阳性样本中,25例NAT阴性,其中15例HBsAg中和试验阳性,为低水平慢性感染携带者。50例anti‐HCV阳性血样,4例为NAT阴性,补充ELISA检测为anti‐HCV阴性。16例anti‐HIV阳性样本中,7例为NAT阴性,其单样品核酸检测（ID‐NAT）和补充ELISA检测均为anti‐HIV阴性。【结论】NAT血液筛查对HBV、HCV和HIV经ELISA检测阴性样本的检出率较高,在该地开展NAT血液筛查,对于降低输血残余危险有重大意义。少量HBsAg阳性的低水平感染慢性携带者,汇集核酸检测（MP‐NAT）阴性,HBsAg筛查依然是必不可少的筛查手段。     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高（9．39×10^1copies／uL）,重复性好（实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1．60％、2．54％）。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100％。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法。     

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

乙型肝炎病毒（HBV）DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）是目前测定HBVDNA较为简便、敏感和特异的方法。影响实时荧光PCR准确定量的因素很多．我们在对血清HBVDNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则（以下称“异常扩增曲线”），致检测结果明显偏低，对此我们进行了分析。     

SYBR greenⅠRQ-PCR定量检测DNA方法的改良与建立

目的探讨用改良SYBR green I实时定量PCR（RQ—PCR）技术消除引物二聚体（PDs）对定量分析的影响，建立准确的定量检测DNA含量的方法。方法以β-actin为目的基因，通过对扩增产物和PDs熔解曲线的分析找出各自的解链温度（Tm），选择在高于PDsTin但低于目的片段Tm的温度时检测荧光信号，建立改良SYBR green IRQ—PCR方法。结果该法可消除PDs对SYBR green IRQ—PCR的影响。用此法构建所得标准曲线斜率为－3．178866，相关系数为－0．980535，PCR反应动力学范围达5个log值（10^2-10^6）；精确性检测中，DNA含量实测值与预测值的差异无统计学意义（P〉0．05）；稳定性检测中，3种不同浓度标本的批内变异和批间变异分别为1％、3％、2％和2％、4％、4％。结论改良SYBR green IRQ—PCR可有效消除PDs对定量分析的影响，对目的基因DNA拷贝数进行PCR反应线性范围广、敏感性、精确性和稳定性好的定量检测。是一种简便实用的DNA定量检测的方法。     

核酸检测技术在无锡市献血筛查中的应用分析

目的：评估核酸检测技术（Nucleic Acid Technology ,NAT）应用于献血者血液筛查的必要性和可行性。方法采用美国罗氏诊断公司乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1型＋2型）核酸联合检测试剂盒（PCR‐荧光法）,对2013年4月～7月本血站ELISA检测合格的献血者9418例血液标本进行 HBV DNA、HCV RNA和 HIV RNA1＋2联合检测,先对6人份混样标本进行检测,如为非反应性,则该合并检测池中的标本均为非反应性,如合并检测呈反应性,再进行拆分检测。本试剂盒合并和拆分检测使用相同的复合PCR扩增系统,单管实时荧光 PCR检测3种病原体,通过将探针标记不同的荧光信号分辨HBV、HCV、HIV‐1＋2反应性病原体种类。结果对9418人份ELISA检测 HBsAg、抗‐HCV、抗‐HIV均为阴性的合格血液标本共检测出HBV DNA阳性6例,阳性率为0．06％;HCV RNA阳性1例,阳性率为0．01％,HCV RNA阳性血液病毒定量为4．27×106 IU／mL ;未检测出HIV RNA。结论 NAT能在ELISA检测阴性的献血者血液标本中筛查到HBV、HCV反应性的标本,常规开展NAT能进一步提高血液及输血安全。     

实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义

目的用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者HBV—DNA结果进行分析,以探讨其临床诊疗意义。方法对850例临床标本用时间分辨荧光免疫技术定量测定乙肝病毒血清学指标,用荧光定量PCR法检测血标本中的HBV—DNA,并依据乙肝两对半结果进行归类分组。结果302份HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）标本中有261份HBV—DNA为阳性,阳性率为86．4％,其PCR定量拷贝数为（2．21±0．76）×10^7／ml;321份HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有96份HBV—DNA阳性,阳性率达到29．91％,PCR定量拷贝数为（1．69±0．98）×10^6／ml;32份HBsAg（＋）、HBcAb（＋）标本中有9份HBV—DNA为阳性,阳性率为28．13％,28份HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有4份PCRHBV—DNA阳性,阳性率14．29％;11份HBcAb（＋）标本有6份PCRHBV—DNA阳性,阳性率为42．9％;74份HBsAb（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有5份HBV—DNA阳性,阳性率6．75％;13份HBsAb（＋）、HBeAb（＋）阳性标本有2份PCRHBV—DNA阳性,阳性率为14．3％;12份HBsAb（＋）、HBcAb（＋）标本有1份HBV—DNA阳性,阳性率7．69％;4份HBsAb（＋）的标本HBV—DNA均为阴性,PCR定量拷贝数为〈1．00E×103;24份HBsAg（＋）、HBsAb（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）标本中有21份HBV—DNA为阳性,阳性率为87．50％;1份HBsAg（＋）标本HBV—DNA均为阳性,阳性率为100％;10份HBsAg（＋）、HBsAb（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有3份HBV—DNA均为阳性,阳性率30．00％,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBV—DNA的检出。结论PCR定量测定HBV—DNA可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效观察。     

HBsAg阴性献血者人群HBV感染的检测和输血残余风险分析

目的 了解献血人群乙型肝炎病毒(HBV)感染状况和血液经酶免疫法(EIA)筛查乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)后经血传播HBV感染的残余风险.方法 采用国产和进口两种EIA试剂对献血者血液进行HBsAg筛查,罗氏诊断COBAS Ampliscreens NAT血筛系统检测EIA检测合格标本中HBV DNA,对HBV DNA阳性标本进行半套式PCR检测,并对PCR扩增产物进行测序和病毒基因亚型分析.结果 共筛查1998～2008年的献血者232 305例,发现HBsAg阳性2 999例,阳性率为1.3%;对2002～2007年EIA检测合格的113 639例献血者血液标本进行NAT检测,检测出13份HBV DNA阳性、HBsAg阴性的献血者血液,HBV残余风险高达1.1/10 000.结论 EIA筛查后血液安全性有了很好的保障,经血传播HBV残余风险依然处于较高的水平,NAT应用对提高血液安全,降低输血传播HBV残余风险意义重大.     

核酸测序法与荧光PCR法测定HBV基因分型比对试验分析

目的 对核酸测序方法和荧光PCR法用于乙型肝炎病毒（HBV）分型检测的灵敏度、特异度和分型准确性进行比对分析.方法 核酸测序方法作为金标准与荧光PCR法检测结果进行分析,计算乙型肝炎病毒（HBV）分型检测的灵敏度、特异度和分型准确性.结果 200例样本中,金标准检测结果阳性78例;在这78例中,荧光PCR法检测结果阳性78例,荧光PCR法用于乙型肝炎病毒（HBV）检测的灵敏度为100.00%;金标准检测结果阴性122例,荧光PCR法检测结果阴性121例,荧光PCR法用于乙型肝炎病毒（HBV）检测的特异度为99.18%.荧光PCR法用于乙型肝炎病毒（HBV）分型检测的分型准确性为100%.荧光PCR法和金标准方法的分型检测结果,无统计学差异.结论 荧光PCR法具有高灵敏度、高特异度、防污染能力强、自动化程度高、速度快等优点,适合用于传染病监测和临床使用的乙型肝炎病毒（HBV）的分型快速检测.     

番禺地区无偿献血者酶免阴性样本的核酸检测结果分析

目的通过对酶联免疫吸附实验（ELISA）反应阴性样本的核酸检测技术（NAT）的筛查结果进行分析,探讨核酸检测技术在血液筛查中的应用价值。方法先采用ELISA试剂分别对献血者标本进行HBsAg、抗-HCV和抗-HIV筛查,筛查结果阴性的样本,再用罗氏诊断cobas s 201系统进行HIV、HCV和HBV三项联合NAT检测,并对NAT联检阳性的标本进行分项确证实验。结果在8 147例经ELISA筛查阴性血液标本中检出6例NAT阳性标本,经分项确证6例均为HBV DNA阳性,阳性检出率约为0.074%。结论 ELISA筛查阴性样本中仍存在一定的HBV DNA阳性结果,采用ELISA联合NAT筛查策略,能有效降低输血感染乙肝病毒的风险。     

Absence of hepatitis B virus DNA detected by polymerase chain reaction in blood donors who are hepatitis B surface antigen negative and antibody to hepatitis B core antigen positive from a United States population with a low prevalence of hepatitis B serologic markers

A recent study in hepatitis B surface antigen (HBsAg)-negative, antibody to hepatitis B core antigen (anti-HBc)-positive blood donors from a population with a high prevalence of hepatitis B serologic markers showed the presence of hepatitis B virus DNA (HBV DNA) as detected by polymerase chain reaction (PCR) in 4 percent of these donors. A sensitive, nested PCR assay was used to assess the prevalence of HBV DNA in a population of HBsAg-negative, anti-HBc-positive blood donors from a United States population with a low prevalence of hepatitis B serologic markers. The lower limit for detection by the PCR assay was 10(-5) pg per mL of HBV DNA. There was a review of 26,492 consecutive blood donations in a 12-month period. During this time, only 1 unit (0.004%) was HBsAg positive. An additional 158 units (0.6%) were repeatably reactive for anti-HBc. These 158 HBsAg-negative, anti- HBc-positive units were given by 119 donors of blood for allogeneic and autologous use. HBV DNA was not detected by PCR in blood from 83 allogeneic blood donors (93 samples) or 36 autologous blood donors (65 samples). Anti-HBc testing is an inefficient means of screening for potential hepatitis B infectivity and is associated with low test specificity in populations with a low prevalence of hepatitis B serologic markers.     

荧光定量分型PCR法在HBV-DNA检测中的应用

目的：探讨荧光定量分型PCR法在乙型肝炎病毒（HBV）-DNA检测中的作用,为HBV基因的分型提供参考。方法对120份 HBV-DNA阳性样本分别采用荧光定量分型PCR法和直接测序法检测,比较两种方法的检测效果。结果120份样本均被荧光定量分型PCR 法和直接测序法成功分型,荧光定量分型PCR 检出29（24．17％）例混合感染样本,直接测序法检出7（5．83％）例,前者检出率高于后者（χ^2＝15．817,P＝0．000）;两种方法的一致性较好（Kappa 值为81．67％）;检测结果不一致的样本经TA 克隆后,证实与荧光定量分型PCR 法的检测结果一致。结论荧光定量分型PCR 法是一种简便、快速高效的HBV 基因分型法,对基因型混合感染样本的检出率高于直接测序法,且正确率高。     

RhD（-）非血缘献血者Del的检测分析及检测方法的探讨

本研究旨在分析RhD（-）非血缘献血者中Del的检测,采用血清学方法初筛RhD,用间接抗人球蛋白试验（IAT）确认RhD（-）,应用热-乙醚吸收放散法检测Del。结果表明：在38526名健康无偿献血者中,常规血清学方法初筛和IAT试验确认RhD（-）者为106人,热-乙醚吸收放散试验确认Del型者28例,在RhD（-）中的比例为26．41％,Del中各表型的频率分别是Ccee22例,占78．57％,CCee4例,占14．29％,CcEe2例,占7．14％。结论：用热一乙醚吸收放散实验检测Del对合理运用Rh阴性血源具有重要意义,本地区人群的Del表型频率与中国不同区域人群及日本人群Del表型频率有差异。     

核酸扩增技术在献血者血液HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA筛查中的应用研究

目的探讨在我国无偿献血者的血液筛查中引进核酸扩增技术(NAT)的必要性,了解献血者血清学病毒标志物检测阴性、NAT检测阳性的感染状况。方法应用Roche PCR、PCR-微流芯片、实时荧光PCR方法对深圳市131 174人(次)血清学检测病毒标志物阴性的献血者进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA检测,对NAT阳性献血者追踪检测并做定量分析。结果HBV DNA阳性22例,阳性率为1/5 962,其中15例为抗-HBc阳性,阳性率为1/8 745;HCV RNA阳性1例,阳性率1/131 174;HIV-1 RNA未检出阳性。对14名HBV DNA阳性者的追踪发现,8人发生了血清转换现象。结论采用高灵敏度的NAT筛查献血者血液中的HBV和HCV,有助于提高输血及血液安全。     

无偿献血者血液感染HBV/HCV/HIV的两种检测方案比较研究

目的 比较酶联免疫法（ELISA）对无偿献血者血液HBsAg/抗HCV/HIV/Ag/Ab阳性检出率及核酸分析技术（NAT）对HBV/HCV/HIV阳性检出率,为优化血液安全检测方案提供依据.方法 采用A方案（用两种不同生产厂家的ELISA试剂盒检测HBsAg/抗HCV/HIV/Ag/Ab,无反应性样本再进行NAT HBV/HCV/HIV检测）对2011年1月-2013年7月采集的198 783例无偿献血者血样进行检测;采用B方案（用1种ELISA试剂盒检测HBsAg/抗HCV/HIV/Ag/Ab,无反应性样本再进行NAT HBV/HCV/HIV检测）对2013年8月-12月采集的34 577例无偿献血者血样进行检测,运用统计学方法分析A,B两种检测方案的阳性检出率.结果 A方案的ELISA阳性检出率（1.32％）高于B方案的ELISA阳性检出率（0.76％）（χ^2=75.291,P＜0.05）;A方案的总阳性检出率（1.45％）高于B方案的总阳性检出率（0.92％）（χ^2=61.016,P＜0.05）;A方案ELISA检测的阳性检出率（1.32％）高于B方案总体阳性检出率（0.92％）（χ^2=38.986,P＜0.05）.结论 采用A方案对无偿献血者血液感染HBV/HCV/HIV进行检测的阳性检出率较高,能够较好地保证血液安全,但会增加检测成本和工作量.     

HBsAg阳性的乙肝血清学标志物少见模式与HBV—DNA和肝功能的相关性研究

目的探讨HBV感染者HBsAg阳性的血清学标志物少见模式与HBV—DNA、肝功能的关系。方法采用时间分辨免疫荧光分析法（TRFIA）定量测定HBV标志物;采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）法检测HBV—DNA含量;采用全自动生化分析仪检测肝功能。结果HBsAg阳性的少见模式表现为6种模式,以HBsAg（＋）HBsAb（＋）HBeAb（＋）HBcAb（＋）模式检出率最高,占58．59％（75／128）;在各少见模式中均不同程度地检出HBV—DNA,阳性率介于28％-100％之;HBsAg与HBsAb同时阳性者有119例,检出率达92．97％（119／128）;HBeAg阳性组肝功能异常率和HBV—DNA阳性率明显高于HBeAg阴性组（P〈0．05）。结论在HBsAg阳性的乙肝血清学标志物（HBV—M）检测结果的阳性组合中,除常见的“大三阳”和“小三阳”外,还存在多种其它模式,其中一些已成为常见模式。各种模式均存在病毒的复制。探讨HBV—M各种阳性组合模式及其HBV—DNA、肝功能生化指标检测结果的关系,对了解HBV病毒的免疫学变异,指导临床诊断和治疗,有重要意义。