流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞核结合因子α1基因的表达作用

背景：机械应力在成骨细胞功能调控中的作用是近年骨组织生物力学研究的一个重点。流体剪切应力是否可以诱导成骨细胞内核结合因子α1的表达，其规律如何？目前少见报道。 目的：观察流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞（MG-63）核结合因子α1基因表达的作用. 设计：对比观察实验 单位：解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成. 材料：MG-63人源骨肉瘤成骨样细胞。 方法：实验于2004-11／2005—04在解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成。①对MG-63细胞进行培养，传代60h后，将细胞置于流室系统中进行刺激实验。流体剪切应力分别为0．5Pa（0．5Pa应力刺激组）和1．5Pa（1．5Pa应力刺激组），作用时间分别为15，30和60min。同时取盖玻片置于含培养基的培养皿中，作为流体剪切应力刺激组的即时对照（对照组）．②提取细胞总RNA，进行反转录聚合酶链反应，检测细胞内核结合因子α1mRNA的表达，并计算与内参照GAPDH mRNA的比值. 主要观察指标：不同流体剪切应力及不同作用时间核结合因子α1mRNA的表达值. 结果：①与对照组相比，流体剪切应力刺激组的核结合因子α1mRNA的表达在作用30min和60min均显著增强，且在一定的时间范围内（15-60min），核结合因子α1mRNA的表达水平随着作用时间的延长、应力水平的增加而增强．②1．5Pa应力刺激组在作用30min和60min核结合因子α1mRNA的表达比0．5Pa应力刺激组均显著增强（P〈0．01） 结论：流体剪切应力可以促进成骨细胞内核结合因子α1的表达。     

骨肉瘤预后相关基因的研究进展

骨肉瘤是一种起源于间充质组织的原发性恶性肿瘤,主要发生在儿童和青少年,具有恶性程度高、生长快、转移早及预后差等特点。目前国内外大部分研究主要集中于早期诊断和治疗上。然而,可靠的预测指标对于监测疾病变化、指导治疗和评估预后至关重要。近几年关于骨肉瘤预后相关基因的研究已成为新的热点,其异常表达影响骨肉瘤细胞的进展、侵袭和转...     

印记基因PHLDA2表达与骨肉瘤辐射敏感性的研究

【摘要】目的探讨印记基因PHLDA2在骨肉瘤放疗疗效评估中的意义。方法采用免疫组织化学S-P法和RT-PCR方法在36例放射治疗后的骨肉瘤组织及其配对的癌旁组织中检测PHLDA2分子的表达,并结合临床病例参数及辐射敏感性探讨PHLDA2表达的意义。结果放射治疗后的骨肉瘤组织中PHLDA2分子mRNA和蛋白的表达一致,明显低于配对的癌旁组织,差异具有统计学意义（P〈0．05）;辐射缓解组中PHLDA2的表达阳性率高,与辐射抵抗组差异有统计学意义（P〈0．05）;但PHLDA2表达与骨肉瘤患者的性别、年龄、病理分型不相关,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论骨肉瘤组织中PHLDA2的表达显著降低,其表达可作为一种骨肉瘤放疗疗效评估的参考指标,值得在临床上推广运用。     

人骨肉瘤中抑癌基因P^16蛋白表达的初步研究

目的 为了了解Ｐ＾１６蛋白在骨肉瘤中的表达及其与患临床资料间的关系,研究Ｐ＾１６蛋白与骨肉瘤发生、发展间的关系。方法 采用免疫组织化学方法检测１８例正常骨组织,５２例骨肉瘤标本（其中２７例有化疗前后配对标本）,并作统计学对照处理。结果 Ｐ＾１６蛋白在骨肉瘤标本中的表达显高于正常骨组织（Ｐ〈０．０１）,与骨肉瘤转移、化疗、病理类型及生存率无关,而与肿瘤的直径大小有关。结论 Ｐ＾１６蛋白表达的改变     

NOTUM基因在骨肉瘤中的表达及临床意义

目的探究NOTUM基因在骨肉瘤中的表达及临床意义。方法选取2011年3月至2014年4月来该院就诊的68例骨肉瘤患者,术中取其癌组织作为试验组,取其正常骨骼肌组织作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NOTUM mRNA表达情况,采用免疫组织化学法检测NOTUM蛋白表达情况,采用Cox回归分析影响骨肉瘤的预后因素。分析NOTUM表达与骨肉瘤病理特征的关系,以及NOTUM表达对骨肉瘤患者生存情况的影响。结果试验组NOTUM mRNA和NOTUM蛋白表达均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05);骨肉瘤患者癌组织中NOTUM蛋白阳性率与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径和病理类型无关(P0.05),与Enneking分期和远处转移有关(P0.05);NOTUM蛋白阴性患者5年生存率明显高于阳性患者,差异有统计学意义(P0.05);Cox回归分析显示,NOTUM表达、Enneking分期和远处转移均是影响骨肉瘤患者预后的危险因素(P0.05),其中NOTUM表达和远处转移均是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素。结论骨肉瘤患者癌组织中NOTUM呈高表达,其表达与Enneking分期和远处转移有关,是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素,且与患者预后密切相关,有望成为骨肉瘤的潜在治疗靶点。     

上调基因-11在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的:探讨上调基因-11(UP-Regulated Gene 11,URG11)在骨肉瘤中的表达及其临床意义。方法:选取我院骨科2005年8月~2010年8月术后病理检查明确为骨肉瘤的石蜡标本100例,并以癌旁的正常骨组织或软骨组织作为对照。比较URG11在骨肉瘤与癌旁正常组织中的表达,分析URG11在骨肉瘤组织中的表达与临床、病理参数之间的关系;绘制Kaplan-Meier生存曲线,分析URG11在骨肉瘤组织中的表达与患者预后的关系。结果:(1)URG11在骨肉瘤组织的阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05);(2)URG11的表达与骨肉瘤的分期、是否发生肺转移关系密切(P<0.05),而与性别、年龄、生长部位和大小等无关(P>0.05);(3)URG11表达阳性患者的术后存活时间显著低于URG11阴性患者(P<0.05)。结论:URG-11在骨肉瘤组织中表达有所增加,对其生物学行为有一定的促进作用。     

基因治疗成骨肉瘤的探索：人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法.方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1( )中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147.用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降.结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAas CD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础.     

骨形成蛋白对人动脉瘤样骨囊肿间质细胞骨肉瘤细胞成骨性分化的 …

用牛骨形成蛋白（ＢＭＰ）体外处理化学致癌物转化的动脉瘤样骨囊肿间质细胞和骨肉瘤细胞，观察到这些细胞碱性磷酸酶活性和胞浆ＢＭＰ含量增高，将ＢＭＰ与这些细胞放入弥散小室中，置于大鼠腹腔或置体外培养１－２周，可见细胞间有硫酸软骨素样物质合成。结果提示，在ＢＭＰ的作用下已发生恶性转化的动脉瘤样骨囊是质细胞出现了与骨肉瘤细胞相同的分化特征，这一现象解释了发生恶性转化的动脉瘤样骨囊是质细胞聘与骨肉瘤细胞盯同的     

基因治疗成骨肉瘤的探索:人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法。方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1(+)中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147。用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降。结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

抑癌基因PTEN和P53在骨肉瘤组织中的表达及对预后的影响

目的：研究骨肉瘤组织中抑癌基因PTEN和P53的表达情况，及其在骨肉瘤的发生、发展中的可能作用。方法：收集中国医科大学附属第一医院1995—05／2002—11骨肉瘤标本38个及骨软骨瘤标本20个。用免疫组织化学SP法检测PTEN及P53在38个骨肉瘤及20个骨软骨瘤石蜡标本中的表达情况。结果：PTEN蛋白在骨肉瘤中表达阳性率为55％(21／38)，在对照组骨软骨瘤中为90％(18／20)，骨肉瘤与骨软骨瘤相比差异有显著性意义(x^2=4．62，P&;lt;0．05)。P53在骨肉瘤中表达阳性率为66％(25／38)，在对照组骨软骨瘤中为5％(1／20)，骨肉瘤与骨软骨瘤相比差异有非常显著性意义(x^2=19．58，P&;lt;0．01)。结论：抑癌基因PTEN和P53在骨肉瘤组织中表达下调，可能与骨肉瘤的恶性进展有关。     

不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1和PPAR-γ2 mRNA表达的影响

背景绝经后骨质疏松的病理生理机制尚未完全阐明,研究表明骨丢失与雌激素缺乏相关,后者可导致多种细胞因子生成增加,继而引起成骨细胞和破骨细胞生成增多,骨吸收增强.雌二醇能否改变骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1和PPAR-γ2 mRNA的表达进而影响其向成骨细胞分化尚不清楚.目的研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中,17β-雌二醇对其核结合因子α1(Cbfα1)及过氧化物酶增殖活化受体γ2(PPAR-γ2)mRNA表达的影响,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用.设计非随机对照研究.地点和对象所有实验均在成都军区总医院检验科和成都百奥生物技术有限公司完成,分离骨髓基质细胞所需大鼠由成都中医药大学实验动物研究中心提供.干预1,25(OH)2D3和地塞米松诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化,用不同浓度[(0～1)×10-6mol/L]雌二醇对细胞分化过程进行干预.主要观察指标应用半定量RT-PCR及Northern blot技术,观察不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1及PPAR-γ2 mRNA表达的影响.结果雌二醇能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1 mRNA的表达,雌二醇浓度为[(0～1)×10-6mol/L]时,Cbfα1 mRNA的表达量从(25.0±3.3)%降至(19.8±2.2)%(t=2.62,P＜0.05),(14.5±1.3)%(t=5.92,P＜0.01)和(6.5±1.9)%(t=9.72,P＜0.01);雌二醇能明显促进骨髓基质细胞在分化介质中PPAR-γ2 mRNA的表达,在上述雌二醇浓度时,PPAR-γ2 mRNA的表达从(1.75±0.5)%增至(9.5±2.1)%(t=7.18,P＜0.01)和(19.3±3.0)%(t=11.5,P＜0.01);Northern blot结果显示随着雌二醇浓度的增加,Cbfα1 mRNA的表达量从4.42±0.39降至1.88±0.16(t=12.0,P＜0.01)和1.19±0.11(t=15.8,P＜0.01);PPAR-γ2mRNA的表达量从1.31±0.12增至2.81±0.22(t=10.5,P＜0.01)和4.02±0.36(t=14.2,P＜0.01).细胞ALP活性明显受雌二醇的抑制,在上述雌二醇浓度时ALP的活性从(42.6±2.5)降至(3.6 ±0.7)U/g蛋白(t=29,P＜0.01).Ⅰ型胶原含量均随雌二醇浓度增加而降低.结论雌二醇抑制体外培养的骨髓基质细胞向成骨细胞分化而促进其向脂肪细胞分化.     

流体切应力与内皮祖细胞铜锌超氧化物歧化酶基因表达及活性

背景：流体切应力是调控内皮祖细胞的重要非药理学手段,但目前其对内皮祖细胞抗氧化功能的作用尚不清楚。目的：观察不同切应力对内皮祖细胞铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase,Cu/Zn-SOD）基因表达和活性的影响,以探讨流体切应力对内皮祖细胞抗氧化功能的调节作用。方法：健康成人外周血的单个核细胞诱导分化为内皮祖细胞,分为静态组、低切应力组、中切应力组和高切应力组4组进行观察。结果与结论：外周血单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下呈典形的＂纺锤样＂梭形细胞,ac-LDL吞噬及lectin抗体荧光标记双阳性,FLK-1和VWF免疫荧光抗体染色均为阳性。各切应力组内皮祖细胞CuZn-SOD活性均高于静态组,并且切应力越大,内皮祖细胞Cu/Zn-SOD分泌水平越高。荧光定量RT-PCR表明,切应力处理能上调内皮祖细胞CuZn-SOD mRNA表达,并且切应力水平越高,CuZn-SOD mRNA表达越强。说明切应力能上调内皮祖细胞Cu/Zn-SOD基因表达,增强内皮祖细胞Cu/Zn-SOD活性,提高内皮祖细胞的抗氧化活性。因此,在生理范围内增加体外切应力,能上调内皮祖细胞的功能活性。     

低氧对胚胎肝间质细胞低氧诱导因子1α基因表达的影响

目的:观察低氧培养条件下小鼠胎肝间质细胞中低氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor1,HIF-1α)的表达情况,了解造血间质细胞在低氧环境中的生物学特性。方法:取孕14.5d小鼠胚胎肝细胞进行贴壁培养及传代。生长至次融合状态的第5代细胞在950mL/LN2和50mL/LCO2混合气条件下培养,持续通以缺氧混合气0(对照组),2,4,8,16,32h,在37℃培养。在合适时间下应用半定量RT-PCR和Westernblot技术检测其HIF-1α基因表达。结果:在常氧压下培养的胎肝间质细胞中,HIF-1αmRNA及其蛋白水平均较低;而低氧培养则可显著提高胎肝间质细胞HIF-1α基因的mRNA及其蛋白水平。HIF-1αmRNA在低氧培养2h时即显著增高,8h时达到高峰水平,PCR产物HIF-1与β-actin信号比从对照组(3.85±1.98)%增加到(60.28±13.48)%,差异有显著性意义(P<0.01);HIF-1α蛋白在低氧培养4h时显著增高,16h时达到高峰水平,Western检测HIF-1与β-actin信号从对照组(3.86±1.98)%增加到(29.46±8.72)%,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:低氧可诱导HIF-1α在小鼠胎肝间质细胞中的表达。     

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的:观察细胞因子诱导成骨的共同信号分子核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,其成骨表型转变的可能性。方法:实验于2003-10/2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,成骨标志基因I型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1mRNA的表达采用反转录-聚合酶链反应检测,骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测,Cbfa蛋白的表达采用Westernblot检测。结果:①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达,I型胶原表达增强,说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达,显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Westernblot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达,证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论:核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化,增加了成骨细胞数量,使成骨能力增强成为可能。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响

背景:缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的.目的:观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响.方法:贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3～5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达.将骨髓间充质干细胞分四组:常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h).RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子mRNA表达水平,ELISA检测骨髓间允质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平.结果与结论:同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P<0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P<0.05).证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素.     

重组结缔组织生长因子对体外培养成骨细胞核结合因子α1基因表达的影响

目的:研究发现,结缔组织生长因子可促进软骨细胞和成骨细胞的增殖及其表型的发生,在骨骼发育以及骨量维持方面发挥重要作用,但其对成骨细胞的作用机制目前尚不清楚。观察重组结缔组织生长因子对体外培养人成骨细胞核结合因子α1基因表达的影响。方法:实验于2006-01/2007-01在日照市人民医院完成。①实验材料:外科手术取正常成人髂骨松质骨,患者对试验知情同意。②实验方法:体外培养正常人成骨细胞,用不同浓度0,50,100,200,1000μg/L的重组结缔组织生长因子(0μg/L作为空白对照组)干预48h后,抽提细胞总RNA和总蛋白。③实验评估:采用半定量反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分析方法观察不同浓度重组结缔组织生长因子对体外培养人成骨细胞核结合因子α1基因表达的影响。结果:半定量反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹结果显示,50,100,200,1000μg/L重组结缔组织生长因子干预后均可显著上调成骨细胞核结合因子α1的表达,并呈明显剂量依赖关系,与空白对照组比较,差异显著(P<0.01)。结论:重组结缔组织生长因子可剂量依赖性上调成骨细胞核结合因子α1基因的表达,核结合因子α1可能参与了结缔组织生长因子对成骨细胞增殖和分化的调节。     

阻断转化生长因子β_1自分泌环基因治疗骨肉瘤的机制研究

目的阻断骨肉瘤细胞TGF-β1自分泌环能抑制肿瘤细胞的增殖活性,从而达到基因治疗骨肉瘤的目的,探讨阻断TGF-β1自分泌环基因治疗骨肉瘤的机制。方法将反义TGF-β1基因转染骨肉瘤细胞MG-63后,采用RT-PCR的方法检测肿瘤细胞BMP-2、IGF-1、bFGF基因表达的变化。结果阻断TGF-β1自分泌环后,骨肉瘤细胞BMP-2、IGF-1、bFGF基因表达明显降低或消失。结论通过阻断自分泌环以降低骨肉瘤细胞表达的TGF-β1后,肿瘤细胞其他各种细胞因子的表达明显抑制,肿瘤细胞生物学活性降低。研究阻断TGF-β1自分泌环抑制肿瘤生长和发展的机制,将为开辟骨肉瘤基因治疗的新方向奠定基础。     

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的：观察细胞因子诱导成骨的共同信号分产核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞，其成骨表型转变的可能性。方法：实验于2003-10／2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞，成骨标志基因Ⅰ型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1 mRNA的表达采用反转录．聚合酶链反应检测，骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测，Cbfa蛋白的表达采用Western blot检测。结果：①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达，Ⅰ型胶原表达增强，说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达，显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Western blot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达，证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论：核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化，增加了成骨细胞数量，使成骨能力增强成为可能。     

人骨肉瘤中Bcl-2基因表达的初步研究

目的:探讨Bcl-2基因在人骨肉瘤、正常骨中表达的生物学意义。方法:采用免疫组织化学S-P法,对30例新鲜人骨肉瘤和15例正常骨进行研究。结果:正常骨组的阳性表达率为20％（3/15）,其中弱阳性1例,强阳性2例;骨肉瘤组的阳性表达率为70％（21/30）,其中弱阳性11例,中度阳性6例,强阳性4例。比较两组的染色阳性率和染色强度,差异有显著性（P<0.05）。结论:提示骨肉瘤发生与凋亡异常有关。