流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响。方法贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10μmol/L作用24 h为最佳诱导浓度。通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白ImRNA的表达。结果骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性。经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力最明显。但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大。结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷。     

脂肪干细胞诱导成心肌细胞研究

目的:探讨体外培养的脂肪干细胞（ADSCs）转化为心肌细胞的可能性和最佳诱导时机。方法:取新西兰白兔ADSCs,体外培养扩增。将传代不同次数的ADSCs以不同的5-氮杂胞苷浓度诱导,探讨最佳诱导浓度和时机,观察诱导后细胞的形态变化以及传代对心肌管样细胞数量的影响。免疫细胞化学方法鉴定。结果:ADSCs接种后生长迅速,呈短梭形,细胞形态单一。5-氮杂胞苷浓度对细胞的生长有显著影响,随着5-氮杂胞苷浓度的增加,细胞数量显著减少。诱导剂有效浓度为69μmol/L,以终浓度为9μmol/L对第3代ADSCs诱导产生的心肌细胞数量最多。5-氮杂胞苷诱导后最早于第9天形成肌管样结构,以肌纤维蛋白、α-横纹肌肌动蛋白和心肌肌钙蛋白T单克隆抗体检测均为阳性。诱导后细胞传代导致心肌细胞数量显著减少。结论:ADSCs在体外可有效转化为心肌细胞,它可能是心肌细胞移植的良好细胞来源。     

骨髓基质细胞的诱导分化及其移植对兔心肌梗死后的心功能的影响

目的采用骨髓基质细胞(MSCs)体外转化为肌细胞,为心力衰竭的细胞心肌成形提供较为理想的移植细胞. 方法从兔股骨头处抽取骨髓,用Ficoll细胞分离液分离MSC8,体外培养,经5-氮杂胞苷(5-aza)刺激24h后,用免疫组织化学方法检测肌源细胞中肌节肌动蛋白(actin)、肌钙蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ)、结蛋白(desmin)和缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达;用RT-PCR检测肌球蛋白重链(MHC)的基因表达;用电镜观察肌源细胞的超微结构.并将诱导分化后MSCs移植到结扎兔冠状动脉前降支致心肌梗死(MI)的模型中.     

5-氮胞苷诱导间质干细胞为心肌细胞的实验研究

分离SD大鼠下肢骨，培养获得骨髓间质干细胞（MSCs），经5-氮胞苷（5-aza）定向诱导24h后t用免疫细胞化学法检测诱导细胞对连接蛋白43和α横纹肌肌动蛋白的表达，用逆转录-聚合酶链反应鉴定心肌细胞特异性蛋白的表达情况。结果显示，MSCs经5-aza诱导后，细胞形态不规则；3周后5-aza 10μm组细胞连接蛋白43、α横纹肌肌动蛋白阳性表达；RT-PCR显示细胞表达心肌肌钙蛋白Ⅰ、α心肌肌动蛋白。提示5-aza可体外诱导MSCs分化为心肌细胞，用于心肌梗死的治疗。     

永生型骨髓间质干细胞体外诱导为心肌样细胞的实验研究

目的　采用骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞 ,为心力衰竭的干细胞移植治疗提供新的细胞材料。方法　抽取贵州香猪骨髓液 3ml,按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞 ,连续传代 4个月 ,得到永生型细胞 ,经 5 氮胞苷 (5 azacytidine)刺激后 ,进行RT PCR ,基因测序 ,免疫组化 ,电镜超微结构鉴定。结果　骨髓间质干细胞经 5 氮胞苷刺激后 ,部分细胞呈梭形。RT PCR ,基因测序结果表明细胞有心房利钠肽 (ANP) ,脑利钠肽 (BNP) ,心肌特异性肌球蛋白重链 (cardiac MHC) ,β肌球蛋白重链 (beta MHC) ,α骨骼肌肌动蛋白 (α skeletalactin)表达 ,结蛋白 (desmin) ,肌球蛋白重链 (MHC) ,心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ (cTnTⅠ )免疫组化阳性。电镜示梭形细胞有明显的肌丝 ,细胞核呈单椭圆形 ,位于细胞中央。结论　骨髓间质干细胞经 5 氮胞苷刺激后 ,从基因 ,蛋白 ,超微形态上已有心肌细胞特点 ,表明在体外环境下可向心肌细胞转化 ,有望成为心力衰竭干细胞移植治疗的细胞材料     

骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)体外诱导分化为心肌细胞的可行性,为心肌梗死治疗提供理想的细胞材料。方法:分离大鼠下肢骨获取MSCs进行培养;5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养;免疫细胞化学检测细胞对连接蛋白-43和α横纹肌肌动蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步了解心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;诱导后3周10μmol/L 5-aza组细胞连接蛋白-43、α横纹肌肌动蛋白表达阳性。RT-PCR显示10μmol/L 5-aza诱导后3周的细胞可表达心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白。结论:MSCs体外经5-aza诱导后可分化为心肌细胞。     

犬骨髓间叶干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的:旨在建立骨髓间叶干细胞(MSCs)体外定向诱导分化心肌细胞的方法,为心肌疾患的移值修复治疗提供成体干细胞来源.方法:利用Percoll密度梯度法及MSCs黏附贴壁生长特性进行分离培养与扩增骨髓MSCs,并予以鉴定证实.应用5-氮胞苷对培养早期的骨髓MSCs进行定向诱导分化心肌细胞.通过细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等技术观察分化细胞的肌管,心肌细胞特异性蛋白与细胞特异性超微结构以鉴定诱导分化的效果.结果:利用Percoll密度梯度法与细胞黏附贴壁生长特性,可分离培养与扩增足量骨髓MSCs.应用化学诱导剂5-氮胞苷10～20 μmol/L孵育早期培养的骨髓MSCs4～5周,可见细胞形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白,肌球蛋白以及心肌细胞特异性分子标志肌钙蛋白I免疫组化染色阳性;透射电镜可见肌丝与房性颗粒.结论:骨髓MSCs可在体外5-氮胞苷的诱导下定向转化为具有典型结构的心肌细胞.     

犬骨髓间充质干细胞体外分离培养、诱导分化为心肌细胞实验研究

目的 观察犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离体外培养的生长特性及诱导分化为心肌细胞.方法 利用骨髓穿刺,Percoll分离液密度梯度离心法分离穿刺骨髓细胞继而通过贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞进行接种培养、体外扩增经5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导分化为心肌样细胞.倒置显微镜观察诱导前后细胞形态变化,流式细胞分析及免疫化学进行相关免疫抗原检测.结果 分离细胞流式细胞分析细胞表面分子抗原CD105(间充质干细胞抗原)阳性,CD34(造血干细胞表面抗原)阴性,CD31(内皮主细胞表面抗原)阴性.利用5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(Brdu)进行细胞增殖标记,结果增殖细胞核标记率为(77.2±6.1)%.传4代后,经5-aza诱导,细胞形态发生改变,由梭形变为"心肌样",同时有自发性细胞搏动和"肌管"样结构.免疫化学检测分化细胞肌球蛋白重链(MHC)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)、连接蛋白-43(Cx-43)等心肌细胞特异蛋白表达阳性.结论 BMSCs分离纯化在体外培养条件下可以实现大量扩增,同时维持其未分化状态.与5-氮杂苷(5-azacytidine)共培养,可以诱导其分化为心肌样细胞.BMSCs是细胞移植"心肌再生"治疗缺血性心脏病的理想种子细胞来源.     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

骨髓间(充)质干细胞体外定向诱导心肌样细胞超微结构特征研究

目的：研究兔骨髓间（充）质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）经5～氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导在体外定向分化的心肌样细胞超微结构特征。方法：取兔髂骨骨髓，分离并培养骨髓MSC，用5～aza定向诱导向心肌样细胞分化。以相差显微镜、透射电镜观察心肌样钏胞形态学变化及超微结构特征。结果：5-aza诱导后，部分细胞体积增大，呈“捧状”或“珠状”结构，有肌管样结构形成，透射电镜下见有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微等结构。结论：经5-氮杂胞苷诱导分化的骨髓间（充）质干细胞具有心肌样细胞超微结构特征．     

人脐血间充质干细胞诱导分化成心肌细胞的研究

目的探讨体外脐血间充质干细胞诱导分化成心肌细胞的可行性和最佳方法。方法收集获知情同意的健康产妇脐血细胞,分离单个核细胞,从中进一步分离间充质干细胞,传代培养至第3代,应用免疫荧光流式细胞仪标记间充质干细胞特异性抗原CD34、CD44和CD90。5-氮胞苷诱导分化4周后,免疫组织化学染色和RT-PCR法分别检测心肌细胞标记物肌钙蛋白Ⅰ、转录因子GATA 4和β-肌球蛋白重链。结果在第3代细胞中,可检测到CD44、CD90的表达,未检测到CD34的表达。脐血间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后,呈现成纤维细胞样形态和克隆增殖特点。免疫组织化学染色和RT-PCR可检测到肌钙蛋白Ⅰ,GATA 4和β-肌球蛋白重链的表达。结论脐血间充质干细胞能够被诱导分化成心肌样细胞,可成为干细胞移植的细胞来源。     

5-氮胞苷对大鼠骨髓基质细胞心钠素及β-肌球蛋白重链表达的影响

目的 观察5-氮胞苷(5-AZ)诱导后体外培养骨髓基质细胞(BMSCs)心钠素(ANP)、β肌球蛋白重链(β-MHC)表达的变化.方法 分离培养SD大鼠BMSCs及新生乳鼠心室肌细胞.BMSCs的诱导分化采用第8代BMSCs,于传代后第3 d分为4组:正常对照组、上清液组、5-AZ组、5-AZ+上清液组.反转录聚合酶链反应法测定心肌特异性蛋白ANP、β-MHC基因表达水平的变化.结果 正常培养及心肌细胞上清培养液诱导的BMSCs不表达心肌特异性ANP、β-MHC;5-AZ诱导后的BMSCs表达ANP、β-MHC,分别31.5±5.6、32.1±8.3和33.7±5.6、46.6±8.3.心肌细胞上清培养液增加5-AZ诱导的BMSCs中β-MHC的表达水平,而对ANP表达无影响.结论 体外培养大鼠成体BMSCs在5-AZ诱导下可表达心肌特异性ANP、β-MHC.心肌细胞上清培养液可增加β-MHC表达水平.     

血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法采用悬滴培养法,分别以10、20、50 ng/ml的VEGF对iPSCs细胞进行诱导分化,自然分化作为阴性对照组,加入1%二甲亚砜诱导剂为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞生长情况,记录跳动的拟胚体出现的时间和数目,计算心肌细胞分化率,细胞免疫荧光检测心肌细胞cTnT的表达,RT-PCR检测心肌发育基因α-MHC和β-MHC mRNA的表达。结果与自然分化组相比,三个浓度组的VEGF均可提高iPSCs的心肌细胞分化率(P<0.05),浓度为20 ng/ml时,iPSCs的心肌细胞分化率最高;与二甲亚砜组相比无统计学差异(P>0.05)。分化的心肌细胞可自发搏动,同时表达心肌特异蛋白cTnT和调控心肌发育的基因α-MHC和β-MHC;VEGF可上调α-MHC和β-MHC的表达(P<0.05)。结论 VEGF可以促进诱导iPSCs向心肌细胞分化。     

Effects of R92 mutations in mouse cardiac troponin T are influenced by changes in myosin heavy chain isoform

One limitation in understanding how different familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC)-related mutations lead to divergent cardiac phenotypes is that such mutations are often studied in transgenic (TG) mouse hearts which contain a fast cycling myosin heavy chain isoform (α-MHC). However, the human heart contains a slow cycling MHC isoform (β-MHC). Given the physiological significance of MHC-troponin interplay effects on cardiac contractile function, we hypothesized that cardiac troponin T (cTnT) mutation-mediated effects on contractile function depend on the type of MHC isoform present in the sarcomere. We tested our hypothesis using two variants of cTnT containing mutations at FHC hotspot R92 (R92L or R92Q), expressed against either an α-MHC or β-MHC background in TG mouse hearts. One finding from our study was that R92L attenuated the length-dependent increase in tension and abolished the length-dependent increase in myofilament Ca(2+) sensitivity only when β-MHC was present. In addition, α- and β-MHC isoforms differentially affected how R92 mutations altered crossbridge (XB) recruitment dynamics. For example, the rate of XB recruitment was faster in R92L or R92Q fibers when β-MHC was present, but was unaffected when α-MHC was present. The R92Q mutation sped XB detachment in the presence of β-MHC, but not in the presence of α-MHC. R92Q affected the XB strain-dependent influence on XB recruitment dynamics, an effect not observed for R92L. Our findings have major implications for understanding not only the divergent effects of R92 mutations on cardiac phenotype, but also the distinct effects of MHC isoforms in determining the outcome of mutations in cTnT.     

人骨髓间充质干细胞在心肌损伤裸鼠体内的归巢与分化

目的: 探讨在心肌细胞移植中机体内环境因素对人骨髓间充质干细胞（MSC）向心肌细胞（CM）定向分化的影响。方法: 取人骨髓血,用Percoll（1 073 g/L）进行密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法,体外培养扩增人骨髓MSC,以流式细胞仪鉴定其纯度,并进行免疫细胞化学染色。随后将人骨髓MSC植入异丙肾上腺素所致急性心肌损伤的裸鼠体内。3周后,取心脏组织块进行免疫组织化学染色检测。 结果: 体外分离纯化培养扩增的人骨髓MSC,可高表达CD44,CD105和波形蛋白,不表达CD31,CD34,CD45,肌钙蛋白I和结蛋白。细胞移植3周后,人骨髓MSC在心肌损伤区域均能分化为表达肌钙蛋白I,结蛋白和波形蛋白的细胞。 结论: 体外分离培养扩增的人骨髓MSC可归巢于受损心脏,并参与体内心肌损伤的修复,具有向CM分化的潜能。     

The cardiac β-myosin heavy chain gene is not the predominant gene for hypertrophic cardiomyopathy in the Finnish population

Objectives. The aim of the study was to screen 36 unrelated patients with hypertrophic cardiomyopathy (HCM; 16 familial and 20 sporadic cases) from a genetically homogeneous area in eastern Finland for variants in the cardiac β-myosin heavy chain (β-MHC) and α-tropomyosin (α-TM) genes.Background. Mutations in the β-MHC and α-TM genes have been reported to be responsible for 30% to 40% and less than 5% of familial HCM cases, respectively. However, most genetic studies have included patients from tertiary care centers and are subject to referral bias.Methods. Exons 3-26 and 40 of the β-MHC gene and the nine exons of the α-TM gene were screened with the PCR–SSCP (polymerase chain reaction–single strand conformation polymorphism) method. Linkage analyses between familial HCM locus and two intragenic polymorphic markers (MYO I and MYO II) of the β-MHC gene were performed in 16 familial HCM kindreds.Results. A previously reported Arg719Trp (arginine converted to tryptophan in codon 719) mutation of the β-MHC gene was found in one proband and two relatives. In addition, a novel Asn696Ser (asparagine converted to serine in codon 696) substitution was found in one HCM patient. No linkage between familial HCM and the β-MHC gene was observed in 16 familial kindreds. A previously reported Asp175Asn (aspartic acid converted to asparagine in codon 175) mutation of the α-TM gene was found in four probands and 16 relatives. Mutations in the β-MHC and α-TM genes accounted for 6% and 25% familial HCM cases and 3% and 11% of all cases, respectively.Conclusions. Our results indicate that the β-MHC gene is not the predominant gene for HCM in the Finnish population, whereas HCM caused by the Asp175Asn mutation of the α-TM gene is more common than previously reported.     

动脉血压在肾性高血压大鼠心肌α-和β肌球蛋白重链基因表达中的作用

本实验用肾性高血压大鼠模型,探讨动脉血压在心肌肥厚和肌球蛋白重链(Myosinheavy chain,MHC)基因表达中的作用.结果表明:(1)二肾二夹(2K1C)肾性高血压大鼠,术后48～72h,血压升高.α-MHC基因表达减弱,β-MHC基因表达增强,左室重量/体重(LVW/BW)比值变化不明显;(2)二肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠术后第2～12w,动脉血压持续升高,LVW/BW比值明显升高,左心室α-MHC基因表达明显减弱,β-MHC基因表达明显增强;(3)血管紧张素转换酶抑制剂、巯甲丙脯酸可使2K1C肾性高血压大鼠动脉血压下降,左室肥厚发生逆转,抑制左心室α-MHC基因表达减弱和β-MHC基因表达增强.这些结果提示,在肾性高血压过程中,动脉血压升高是左心室肥厚、左室心肌MHC基因转换(switch)的重要因素,肾素-血管紧张素系统可能参与肾性高血压过程中的心肌肥厚和MHC基因转换.     

马兜铃酸I诱导人肾小管上皮细胞转分化的作用及机制

目的：探讨马兜铃酸Ｉ（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｓ ａｃｉｄ Ｉ,ＡＡＩ）在人类肾小管上皮细胞（ＨＫＣ）转分化中的可能作用,了解ＡＡＩ引起肾小管间质损害的机制。方法：将体外培养ＨＫＣ细胞分为无血清对照组（Ｃ组）和ＡＡＩ实验组两组,波形蛋白和α－平滑肌肌动蛋白（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ,α－ＳＭＡ）表达的变化;应用流式细胞技术检测表达α－ＳＭＡ阳性（＋）的ＨＫＣ细胞百分率;采用免疫酶标