人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

目的克隆THANKcDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法采用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因,PCR产物直接克隆于pMD-18T载体中,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET-11a中。阳性重组子,以1mmol/LIPTG进行诱导表达,以SDS-PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后,进行生物学活性检测。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体,转化大肠杆菌表达后发现,与阴性对照相比,在相对分子质量（Mr）26×104处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。这为进一步进行THANK基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因, 获得其胞外段的原核表达产物.方法:采用RT-PCR方法, 从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA, 扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒, 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, 以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果:从健康产妇胎盘总RNA中, 扩增获得约1 300 bp的DNA片段, 克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN.从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因, 构建重组表达质粒pET- 41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST, 鉴定其相对分子质量( M r)为66 000, Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合.结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因, 并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST, 为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础.     

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 N端片段的原核表达

目的 在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)N端片段.方法 应用PCR技术从含人MASP2 cDNA的质粒pGEM-MASP2中扩增MASP2-N端基因片段,将其克隆至pGEX4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP2-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与MBL-CLR结合的活性.结果 从pGEM-MASP2中扩增得到约840 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和840 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr 60 000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR蛋白结合.结论 获得了表达人MASP2 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP2N端片段/GST融合蛋白,为MASP2分子的进一步研究提供了条件.     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人细胞角蛋白8(CK8)基因cDNA并在大肠杆菌中表达CK8蛋白产物。方法:运用DNA重组技术,设计CK8基因特异引物,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肝细胞癌7721细胞中扩增CK8编码区cDNA,将其插入克隆载体pMD18-T simple vector中,获得重组质粒pMD18-CK8,转化感受态大肠杆菌DH5α。继而采用PCR技术从重组质粒pMD18-CK8中扩增出约1500bp目的片段,再次级克隆到原核表达质粒pET-28a(+)载体中,获得pET-28a-CK8重组原核表达质粒;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21(DE3)菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western blot检测CK8蛋白表达水平。结果:成功建立了人CK8基因cDNA重组体的无性繁殖系。②在原核细胞中成功地表达出人CK8蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了人细胞角蛋白8(CK8)基因,为进一步研究CK8的基因型及探讨该基因编码的CK8蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

3-羟酰基辅酶A脱氢酶在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

目的：克隆并在大肠杆菌中表达3-羟酰基辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HCDH）并制备其抗血清。方法：通过PCR方法扩增HCDH基因片段，经DNA测序证实后克隆到原核表达载体pMAL-P2X，重组质粒转化大肠杆菌DE3，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达结果，经麦芽糖树脂亲和纯化的蛋白皮下注射免疫獭兔，琼扩和ELISA检测抗血清的效价，Western blot检测其特异性。结果：PCR扩增得到786bp的目的片段，序列测定证实与GeneBank上登录的序列一致；成功构建了HCDH基因片段的原核表达载体；在详细探索表达条件的基础上，成功诱导HCDH的表达，并制备了相应的抗血清。结论：检测HCDH蛋白在表达水平上的变化及为HCDH基因表达调控的进一步研究奠定了基础。     

小鼠PGRP-L分子N端基因片段的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠肝组织总RNA中扩增到长约500bp的小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)分子N端基因片段,将其克隆入pUCm-T载体构建重组质粒pmGN,DNA测序表明该基因片段长530bp,序列与GenBank中的完全一致。应用PCR技术,从重组质粒pmGN中扩增目的基因片段,插入表达质粒pET-28a构建重组表达载体pET-GN,导入大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白,表达产物以Ni+-NTAagarose层析柱纯化。SDS-PAGE和Westernblot分析发现,表达产物主要以包涵体形式存在,相对分子质量约29000。ELISA表明,重组蛋白能被抗mPGRP-L分子N端单表位多克隆抗体所识别。为mPGRP-L分子的研究奠定了一定基础。     

人FOXP3 cDNA的克隆及在原核细胞中的表达

目的:克隆人FOXP3cDNA,构建其原核表达载体,在大肠杆菌中表达。方法:从新生儿脐带血获得FOXP3mRNA,用巢式RT-PCR技术扩增FOXP3cDNA,产物纯化后T-A克隆连接至pMD18-T载体,构建其原核表达载体pRSET-A-FOXP3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:获得FOXP3mRNA,并对其编码区cDNA序列进行扩增。PCR产物连接至原核表达载体pRSET,经DNA测序,证实与Gen-Bank中的人FOXP3编码序列一致。经SDS-PAGE及Western blot显示在相对分子质量(Mr)约为52000处出现融合表达条带,表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论:成功地克隆人FOXP3cDNA,构建了其原核表达载体,并在大肠杆菌中得到有效表达。     

利用GeneHub软件多角度分析基因功能相关与表达相关的联系

我们研制的GeneHub软件可以用来评价基因功能分类体系中各个功能单元的表达相关性的显著性，从而筛选与实验条件相关的功能单元。采用不同的相似性测度与不同的数据集，使用GeneHub研究了分别按染色体定位、蛋白质细胞位置与互作、代谢通路、信号传导通路等五个方面分类的基因的表达相关性，结果显示按照这些不同的方面分类的基因显著共表达，并且这种共表达现象往往受相关实验条件影响。为基因表达谱分析中广泛采用的假设“功能相关的基因表达相关”提供了进一步的实验证据。     

Lipofectin介导转移的外源性ADA基因在反复上感儿T淋巴细胞的表达

本文对４１例健康儿童和１７例反复上呼吸道感染患儿外周血淋巴细胞腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）活性进行了检测。在此基础上筛选出２例反复上感伴ＡＤＡ活性低下患儿。在体外对这２例患儿的外周血Ｔ淋巴细胞进行培养后，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（脂质体）介导的方法对其进行了外源性ＡＤＡ基因的基因转移。结果显示：２例患儿体外培养淋巴细胞ＡＤＡ活性较转基因前升高。同步进行的标志基因ｐＢＬａｃＺ的基因转移的检测结果也直观地证实了Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的基因转移是成功的。该研究为ＡＤＡ－ＳＣＩＤ淋巴细胞基因治疗的研究提供了初步的体外实验资料。     

GFD-Net: A novel semantic similarity methodology for the analysis of gene networks

Since the popularization of biological network inference methods, it has become crucial to create methods to validate the resulting models.Here we present GFD-Net, the first methodology that applies the concept of semantic similarity to gene network analysis. GFD-Net combines the concept of semantic similarity with the use of gene network topology to analyze the functional dissimilarity of gene networks based on Gene Ontology (GO). The main innovation of GFD-Net lies in the way that semantic similarity is used to analyze gene networks taking into account the network topology. GFD-Net selects a functionality for each gene (specified by a GO term), weights each edge according to the dissimilarity between the nodes at its ends and calculates a quantitative measure of the network functional dissimilarity, i.e. a quantitative value of the degree of dissimilarity between the connected genes.The robustness of GFD-Net as a gene network validation tool was demonstrated by performing a ROC analysis on several network repositories. Furthermore, a well-known network was analyzed showing that GFD-Net can also be used to infer knowledge.The relevance of GFD-Net becomes more evident in Section “GFD-Net applied to the study of human diseases” where an example of how GFD-Net can be applied to the study of human diseases is presented.GFD-Net is available as an open-source Cytoscape app which offers a user-friendly interface to configure and execute the algorithm as well as the ability to visualize and interact with the results(http://apps.cytoscape.org/apps/gfdnet).     

DMD基因缺失和重复及其在基因诊断中的应用

本文应用DMD基因位点的cDM02b—3和8探针对正常中国人及20例无亲嫁关系的DMD患者的基因组DNA进行了分析。结果显示,20例病例中有10例可检测到DMD基因缺失,缺失率为50％,缺失的部位、大小不同,呈现遗传异质性。采用双波长薄层扫描仪(CS—910),还发现了两例基因重复的病例,重复率为1％。此外,在两例有缺失的病例中各发现一个大小异常的联接片段。本文讨论了cDNA探针在DMD基因诊断、携带者检出以及产前基因诊断中的应用和价值。     

逆转录病毒载体介导的IL-4基因修饰对HL-60细胞增殖及T细胞功能的影响

目的观察ＩＬ－４基因转染对ＨＬ－６０增殖及Ｔ细胞功能的影响及其可能机制。方法采用逆转录病毒载体介导基因转染法将人ＩＬ－４基因导入髓系白血病细胞ＨＬ－６０,观察高表达外源性ＩＬ－４基因ＨＬ－６０株的增殖反应及其诱导的正常人ＰＢＭＣ增殖,ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ基因表达及肿瘤特异性ＣＴＬ杀伤活性。结果ｒＩＬ－４或瘤细胞产生的ＩＬ－４早期促进ＨＬ－６０细胞增殖,培养５天后则明显抑制其增殖;与ｒＩＬ－４处理的ＨＬ－６０细胞比较,ＩＬ－４基因修饰的ＨＬ－６０细胞明显促进正常人ＰＢＭＣ增殖并合成ＩＬ－２、ＩＬ－６及ＩＦＮ－γｍＲＮＡ,其诱导的特异性ＣＴＬ杀伤活性明显高于野生型ＨＬ－６０、仅导入载体的ＨＬ－６０和加入ｒＩＬ－４共育的ＨＬ－６０细胞诱导者。结论ＩＬ－４基因转染在影响ＨＬ－６０细胞增殖和分化过程的同时,可能促进某些抗原（如ＭＨＣⅠ类抗原）的抗原性,从而有利于机体建立有效的抗肿瘤免疫反应。     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

基因芯片数据分析方法研究进展

基因芯片是生物芯片的一种,是最先研究也是最成熟的生物芯片。其产生的海量数据中隐含着许多有价值的生物信息,人们越来越重视探索和开发用以分析这些数据的方法。目前已有统计分析、聚类分析、自组织映射等众多的方法用于大规模的基因表达的数据挖掘整理。对基因芯片试验数据现有的基础分析方法进行综述,并介绍一些新的分析方法。     

先天性眼球震颤遗传学研究进展

先天性眼球震颤是一种不伴有其他明显眼病的眼科遗传病,该疾病的发生有很高的遗传异质性,已经发现多个致病基因基因座,Xq26–q27、Xp11.4-p11.3、13q31-q33和6p12,可能还有新的基因座没有被发现,已经研究的基因座致病基因侯选区域很大,在该区域的侯选基因太多,所以必须精细定位后,才有可能完成致病基因的克隆工作。本文对先天性眼球震颤遗传学的研究进展进行了综述。     

基因编辑技术的研究进展

随着对基因功能研究的不断深入,基因修饰技术逐渐成为基因功能研究的主要方法.基因修饰技术根据不同原理及发展阶段可分为同源重组、RNA干扰和基因编辑.其中基因编辑技术以其能够定点切割DNA,构建简单、特异性高并且适用于各类动植物等特点,近年来引起了科学界的广泛关注.本文就基因定点编辑技术研究的相关进展进行简要综述.