TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的:用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV 感染的特异性方法. 方法:采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达.用SDS-PAGE分析表达产物.表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后,得到纯度为90%的ORF蛋白抗原.用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting分析.结果:经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株. 结论:该蛋白具有良好的抗原活性.     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法：采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达。用SDS－PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA 柱层析纯化后,得到纯度为90％的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting。结果：经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株。结论：该蛋白具有良好的抗原活性。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

My027融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌的表达

目的探索My027蛋白的体外表达,通过原核表达获得大量可溶性My027融合蛋白。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法获得融合蛋白,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、Western印迹法及质谱进行鉴定。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠杆菌BL-21胞质中,纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE、Western印迹法及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白My027在pGEX-4T-2原核表达载体可获高效表达,为进一步研究其功能奠定基础。     

SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列，并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法：从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列，人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列，在5’和3’端分别引入BamHⅠ、Ⅰ酶切位点，退火后形成双链DNA，常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定，核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E．co如)BL21感受态细胞，以异丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的129bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDs-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个大小为30．1ku的融合表达蛋白产生。结论：M蛋白氨基端胞外区129bp编码基因在E.coli中获得正确表达。     

SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测

目的从SARS冠状病毒M蛋白的线性重叠肽链文库中筛选出5个B细胞抗原表位,通过构建原核表达载体,表达抗原表位融合蛋白,并检测其抗原活性.方法应用大肠杆菌高频密码子设计引物,通过PCR方法合成编码SARS冠状病毒M蛋白5个抗原表位(MKY1、MKY2、MKY3、MKY4和MKY5)的DNA片段,经克隆和测序分析,亚克隆至表达载体pET-CKS,转化大肠杆菌BL21;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达抗原表位融合蛋白,亲和层析予以纯化;Western检测SARS病人阳性血清对融合蛋白的识别.结果成功构建SARS冠状病毒M蛋白抗原表位的表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,融合蛋白表达量达到细菌总蛋白30%,经亲和层析纯化,融合蛋白可被SARS病人抗血清识别.结论原核表达的抗原表位融合蛋白具有良好的抗原活性,为下一步进行SARS冠状病毒诊断试剂盒的开发研究奠定基础.     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

CEA微型抗体载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的制备适合放免显像的抗癌胚抗原微型抗体。　方法在已获得的抗癌胚抗原重链可变区 (VH)及轻链可变区 (VL)基因的基础上将重链可变区 (VH)与轻链可变区 (VL)基因直接连接制成微型抗体基因 ,并在大肠杆菌进行表达。　结果大肠杆菌高效表达了微型抗体C端 6×His的融合蛋白 ,表达量达菌体总蛋白的 15 % ,SDS -PAGE和Western印迹显示表达物分子量为 2 6kd与基因编码蛋白的理论推算值相符 ,RIA表明表达物与CEA特异性结合。结论大肠杆菌表达是制备抗癌胚抗原微型抗体的有效途径     

重组血红素加氧酶-2在大肠杆菌中表达与纯化方法的研究

目的　确定重组血红素加氧酶 2在大肠杆菌中表达与纯化方法。方法　将已构建的血红素加氧酶 2(HO 2 )的重组质粒pMW1 72a HO 2转入大肠杆菌BL 2 1 ,分析不同温度及摇床转速对HO 2表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超声波、超速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化HO 2。检测酶活性。结果　确定了HO 2可溶性表达最佳条件为 37℃ ,(85± 5 )r min ;确定了HO 2具体纯化路线。得到蛋白纯度为 95 .0 % ,纯化倍数为 2 .9倍 ,收得率为 4 0 .9%的活性HO 2蛋白。结论　获得了纯度高、具有活性的HO 2蛋白 ,为进一步进行HO 2结构与功能之间关系的研究提供了可行的纯化路线     

Effect of Fragment Asp1961-Glu1978 in Fibronectin on the Expression of Triple-domain Polypeptide in E. coli

Thebifunctional-domainrecombinantpolypeptldeoffibronectin(FN)ispotentiallyusefulintumortherapy.Thispolypeptideyieldedtheinhibltoryeffectontumormetastasisatseveralstepsoftumorcellsinvadingothertissuesll].ThestrongerfunctionwasobtainedifCell--ndomainwasconnectedtotheC--terminalofCellI--HepIpolypeptide['].Buttheexpressinglevelofthetriple--domainpolypeptideinE.coltwasverylow[ZJ.Wereportedthepreparationofbifunctional--domainrecombinantpolypeptideofFN,whichisProl239Ser1515ofFNlinkedwithAla16…     

重组NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达重组NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)并纯化获得有活性的CPR蛋白。方法 将已构建的NADPH-细胞色素P450还原酶重组质粒pMWl72a-CPR采用温和转化法转入大肠杆菌BL-21中,依次使用超速离心、DE52纤维素阴离子交换层析和2’-5’ADP亲和层析的方法纯化CPR,并检测酶的活性。结果 获得了纯度达99％以上的可溶性CPR蛋白,纯化倍数5、20倍,检测酶的比活性为每分钟1045．49nmol／mg。结论获得了纯度高、有活性的CPR蛋白,可作为工具酶用于某些相关酶的研究,同时也为CPR的工业纯化提供了可行的参考路线。     

白血病分化相关基因dif14的原核表达

目的 :构建 pGEX dif14原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达dif14蛋白片段以获得其抗原 .方法 :采用N末端融合谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)的 pGEX 4T 1载体 ,根据dif14基因开放读框N端 5 2氨基酸序列设计引物PCR扩增并购建原核表达载体 ,测序证实 .在大肠杆菌DH5α中进行表达 .结果 :测序证实dif14原核表达载体构建正确 ,含 pGEX dif14表达质粒的大肠杆菌经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导后能够表达约Mr35× 10 3 的融合蛋白 .结论 :成功地构建了原核表达质粒 pGEX dif14 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为研究dif14的功能奠定了一定的基础     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

大肠杆菌表达的重组人骨形成蛋白—3C端肽的纯化

目的：在用大肠杆菌表达人骨形成蛋白－３羧基端肽段获得成功的基础上，进一步探讨ｒｈＢＭＰ－３Ｃ的纯化方法。     

Expression of the human era cDNA in E.coli

Objective: To amplify human era (Hera) gene, then express it in E.coli. Methods: Human era gene, after amplified by PCR and identified by sequencing, was inserted into the expression vector pGEX-4T3 in which exogenous gene was controlled by Ptac promoter. The recombinant plasmid pGEX-Hera was transformed into DH5 ( and induced with IPTG chemically. Results: The human era gene was amplified and the sequence was correct. When the bacteria with pGEX-Hera was induced, an anticipated 65 000 protein band appeared on SDS-PAGE gel and amounted to 23% of total bacterial protein. Conclusion: The human era gene has been successfully amplified and efficiently expressed in E.coli.