CYP4G19基因表达水平对德国小蠊耐药性的影响

目的通过对细胞色素P450家族CYP4G19基因在德国小蠊耐药株和敏感株中表达水平的研究,初步探讨CYP4G19基因与德国小蠊耐药性的关系。方法用广口瓶内采用药膜接触法测定野生株和敏感株德国小蠊的耐药指数,RT-PCR比较野生株和敏感株德国小蠊CYP4G19基因表达,RNAi沉默德国小蠊CYP4G19基因,免疫组织化学法测定CYP4G19蛋白表达。结果深圳市现场采集野生性德国小蠊,用广口瓶药膜法测得其抗性指数为3.88,其抗药性显著高于敏感株（P〈0.01）;野生株CYP4G19 mRNA表达水平比敏感株显著上调（P〈0.01）;野生株CYP4G19基因沉默后CYP4G19蛋白表达明显下降,但仍然具有一定的抗药性。结论深圳市德国小蠊野生株对＂家虫清＂产生了一定的抗药性,对菊酯类杀虫剂产生抗药性的德国小蠊CYP4G19基因的转录、翻译表达水平均有上调。     

家蝇对氯菊酯抗性的分子机制研究

家蝇是一种重要的病媒生物,可以传播上百种人畜疾病。化学防治是家蝇控制的重要手段,但杀虫剂的重复和广泛使用可导致家蝇产生抗药性。在我国,不少事例显示家蝇对拟除虫菊酯杀虫剂普遍产生了抗药性,但对家蝇种群抗药性的分子机制还缺乏系统了解。本研究以来源于山东济南的家蝇为材料,在明确其对氯菊酯抗性水平的基础上,分析其抗药性的分子机制。结果显示,野外采集未经杀虫剂汰选实验室济南品系(JN)相对于敏感品系(WHO)表现出对氯菊酯近50倍的抗性,而经氯菊酯汰选7代后的JN-Sel品系获得了比JN更高水平的抗性,抗性倍数超过110倍。核酸检测显示JN和JN-Sel品系家蝇钠离子通道的基因型为1014LL敏感纯合型。通过检测8个细胞色素P450基因的表达水平,发现3个P450基因(CYP6A5v2、CYP6A36和CYP6G4)在抗性品系中的表达量高于敏感品系,其中CYP6G4的表达与氯菊酯抗性成正相关,JN品系CYP6G4的表达量是敏感品系的35倍,而在高抗性的JN-Sel品系中的表达量是敏感品系的70倍。研究结果强烈提示CYP6G4的过量表达是JN和JN-Sel品系对氯菊酯抗性的重要机制。     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

原丝蛋白对细胞在软琼脂中集落形成的影响

本研究采用原丝蛋白基因低表达的小鼠乳癌温度敏感变异株tsFT101细胞及野生株FM3A细胞，探讨原丝蛋白对细胞在软琼脂中集落形成的影响。应用Lipofection方法向tsFT101细胞内导入原丝蛋白表达基因，使用Northern blot方法检测各细胞株原丝蛋白mRNA表达水平，观察各细胞株在软琼脂中的集落形成情况。结果可见原丝蛋白mRNA表达水平由高至低的顺序是FM3A细胞、经基因转染的tsFT101细胞及未做处理的tsFT101细胞。在0．33％软琼脂中形成的集落大小与此顺序相对应。结果表明，原丝蛋白的表达水平降低能减弱细胞在软琼脂中集落形成的能力。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因全长cDNA的快速扩增

根据本室已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6家族成员cDNA序列片段，设计一对特异性引物．以上述蚊株总RNA为模板，分别进行5’-cDNA末端快速扩增(5’-RACE)和3’-cDNA末端快速扩增(3’-RACE)，所获得的产物经1．2％琼脂糖凝肢电薄，显示：5’-RACE产物达I.5kb，3’-RACE产物达500bp，扣陈两重叠部分的已知cDNA片段(250bp)，则该CYP6家族成员生长cDNA长度达1．75kb，与其它昆虫中已知的CYP6家旅全长cDNA长度相似；然后再分别切胶回收，并以此(RACE产物)为模板，用上述双引物进行PCR鉴定，结果显示2个RACE产物均包含有已知的250bp cDNA片段，提示所得的RACE产物为该CYP6家族成员生长cDNA。     

弓形虫虎源分离株ROPIO基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因，将其克隆入pMD18．T载体中进行测序和生物信息学分析，并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp，编码586个氨基酸，其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，16个核苷酸存在变异，导致7个氨基酸发生改变，但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异，两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．8％。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌B121（DE，）在IPTG的诱导下，可表达出分子量为67．6kDa的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的13．8％。     

鲍曼不动杆菌临床株多重药物外排泵AdeABC的研究

目的 研究鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)临床株外排泵AdeABC的表达与耐药的关系及表达调控.方法 微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌临床株对抗菌药物的敏感性及泵抑制剂作用,RT-PCR检测泵基因adeB的mRNA表达水平,PCR扩增泵调控基因adeRS并测序分析.结果 30株多重耐药的鲍曼不动杆菌临床株及5株敏感株均存在泵结构基因片段adeB和调控基因adeRS,随机选取15株多重耐药株中均检测到adeB的mRNA表达,而在5株敏感株中无表达.测定2株多重耐药株调控基因adeRS序列均出现基因突变,发生氨基酸替代及缺失.结论 鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC的表达可能与耐药性有关,在多重耐药株中存在着调控基因adeRS的基因序列变化.     

湖北株旋毛虫不同时期ES抗原的表达

目的　完成旋毛虫 (Trichinellaspiralis,Ts)湖北株排泄分泌抗原 (excretory secretoryantigen ,ES抗原 )中 4 3ku ,4 9ku及 5 3ku抗原的不同虫期的基因表达 ,并与旋毛虫昆明株中相对应的ES抗原进行对比 ,分析不同虫期、虫株对这 3类抗原基因表达的影响。方法　根据已知的 3类抗原的基因序列设计合成 3对特异性引物 ,运用RT PCR技术检测抗原基因的表达 ,并以旋毛虫 18sRNA为标准进行对比。结果　RT PCR得到了湖北株两个虫期中的 4 3ku,4 9ku及 5 3ku的ES抗原mRNA产物 ,并与昆明株进行对比后发现 3类抗原在不同虫期表达有明显差异。结论　通过研究发现不同虫期的同类ES抗原的表达量有显著性差异。     

B组轮状病毒WH-1株 NSP2基因序列和蛋白质结构分析

目的 克隆成人腹泻标本WH-1中B组轮状病毒组(group Brotavirus，GBRV)非结构蛋白NSP2基因，分析其核苷酸序列，比较与其它GBRV基因同源性，预测其mRNA二级结构、蛋白质二级结构。方法利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从成人腹泻标本WH-1中扩增GBRV NSP2基因，克隆载体pUCmT，对NSP2基因进行核苷酸序列分析。利用GeneBee软件比较与其它GBRV毒株NSP2基因同源性，Rnaviz2．0软件绘制NSP2基因的二级结构，PredictProtein软件分析NSP2蛋白结构。结果成人腹泻标本WH-1中GBRV非结构蛋白NSP2基因全长1007bD，与ADRV核苷酸序列的同源性达98％，与印度加尔各达分离株CAI-1达82％，与IDIR(鼠)同源性仅为79％。氨基酸序列与ADRV的同源性达98．4％，与CAL-1达97．7％，而与IDIR仅为89．0％。其mRNA折叠形成多达26个发卡环状结构。NSP2蛋白是由301个氨基酸残基组成的多肽，含有2个潜在的N-糖基化位点和多个磷酰化位点。结论成人腹泻标本WH-1中GBRV非结构蛋白NSP2基因和氨基酸序列与人GBRV有较高的同源性，而与动物中GBRV同源性相对较低，其中与ADRV的同源性最高，推测GBRV WH-1株与ADRV具有相同起源。     

鲍曼不动杆菌临床株的外排泵研究

目的 探讨鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC、AdeIJK、AdeFGH、AbeM、AbeS、CraA、MdtL的表达与耐药的关系.方法 收集多重耐药鲍曼不动杆菌临床株32株和敏感株10株,PCR扩增泵基因;选取主要克隆型的21株多重耐药株和10株敏感株,实时荧光定量RT-PCR方法检测泵基因adeB、adeJ、adeG、abeM、abeS、craA、mdtL的mRNA相对表达水平,PCR扩增泵调控基因adeRS、adeL并测序分析.结果 32株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株中携带泵结构基因片段adeB100％、adeJ 100％、adeG 100％、abeM 96.88％、abeS 100％、craA 100％、mdtL 93.75％,10株敏感株均存在7种泵结构基因片段;主要克隆型的21株多重耐药株和10株敏感株adeB、abeM、mdtL的mRNA相对表达水平的差异有统计学意义( P＜0.001,P=0.001,P=0.013),选取多重耐药株AbR3和AbR11检测外排泵AdeABC调控基因adeRS序列出现氨基酸替代及缺失,而外排泵AdeFGH调控基因adeL序列无基因突变.结论 鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC、AbeM、MdtL的表达可能与耐药性有关.     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建

目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA，扩增出外膜蛋白新基因ompL17，与打靶载体p2NIL重组，并插入氨苄抗生素抗性基因伽”使外膜蛋白新基因ompL17失活，构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株，通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dot blot和酶切分析，证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体，并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除，并构建钩体017株突变株，为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR缺失株的构建及其功能的研究

目的　通过构建霍乱弧菌toxR基因缺失株来研究toxR基因对霍乱弧菌减毒菌株IEM101和高产毒株569B毒力表达的调控作用。方法　采用自杀性质粒和接合转移技术，将2个中间含有四环素基因的toxR基因分别与霍乱弧菌减毒株IEM101和高产毒株569B染色体toxR基因重组，从而获得toxR基因缺失株IEM101-4和569B-43，并对2个toxR基因缺失株和其原出发菌株的霍乱肠毒素的产率和主要外膜蛋白图谱进行比较。结果　采用GM1-ELISA检测受测菌CT基因表达，toxR基因缺失株569B-43的P/N值为1.82，而其原出发菌株569B的P/N为4.52，而IEM101和其toxR基因缺失株的P/N值均低于2。采用SDS-PAGE对受试菌外膜蛋白进行分析，toxR基因缺失株569B和IEM101的外膜蛋白图谱相比，均多出2条相对分子质量（Mr）为40×103和43×103外膜蛋白区带。结论　toxR蛋白是霍乱肠毒素基因ctx表达的正调控因子，是霍乱弧菌主要外膜蛋白（Mr为40×103和43×103)编码基因的负调控因子。     

寄生虫学

0500640 细胞因子表达质粒对恶性疟原虫顶端膜抗原1DNA免疫的调节作用，0500641 恶性疟原虫FCC1／HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达，0500642 伯氏疟原虫青蓠素抗性相关的消减cDNA文库构建，0500643 弓形虫SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答，0500644 弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达。     

柯萨奇B组3型病毒中国分离株VP4、3D基因序列及系统发生树分析

目的研究柯萨奇B组3型病毒（CVB3）中国分离株结构蛋白VP4、非结构蛋白3D基因序列及变异性。方法在HeLa细胞中增殖病毒，用RT-PCR扩增目的基因片段，与pMDl8-T载体连接，PCR初步鉴定后测序，进行序列同源性及系统发生分析。结果CVB3中国分离株VP4基因含207个碱基，编码69个氨基酸，与Nancy株氨基酸同源性为97．10％；3D基因含1386个碱基，编码462个氨基酸，与Nancy株氨基酸同源性为97．62％。在系统发生中，CVB3中国株VP4基因、3D基因均与Nancy株聚簇。结论CVB3中国分离株VP4和3D基因长度与Nancy株一致，进化上属同一分支。     

蛋白表达抑制稳定株MDA-MB-231-Tudor-SNI的筛选和鉴定

目的 采用针对人类Tudor-SN基因的RNA干扰(RNAi)技术建立Tudor-SN表达抑制的乳腺癌MDA-MB-231稳定细胞株.方法 利用脂质体转染方法将pGenesil-shRNA-hTudor-SNI质粒转染进入MDA-MB-231细胞,经G418筛选出稳定株,通过RT-PCR检测Tudor-SN的mRNA水平,再以Western印迹技术鉴定Tudor-SN蛋白表达情况并计算蛋白表达抑制率.结果 与对照组相比,以G418筛选的MDA-MB-231-Tudor-SNI稳定株Tudor-SN的mRNA水平降低(P＜0.01,n=3),蛋白表达水平明显下调(P＜0.01,n=3),蛋白表达抑制率达78.12 %.结论 成功筛选并鉴定人类Tudor-SN蛋白表达抑制MDA-MB-231稳定株,有助于深入研究Tudor-SN蛋白在乳腺癌中的作用.     

人细胞色素P4502 D64个单核苷酸突变株活性及其与药物相互作用的体外研究

目的探讨单核苷酸替换对人细胞色素P450 CYP2D6酶活性及其与药物相互作用的影响。方法体外构建CYP 2D6野生株（WT）和G169R、P34S、FA10K、V7M等4个单核苷酸突变株的表达载体并在酿酒酵母中诱导表达，裂解行提取锌酶的蛋白微粒体，用蛋白质印迹法验证其表达，冉分别测定各酶代谢底物丁夫洛尔和3-[2-（N，N二乙基-N-甲铵）乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素（AMMC）的米氏常数（Km）和最大酶促反应速度（Vmax）。以AMMC为底物对CYP2D6wT和V7M、G169R进行高通量药物抑制实验，所选药物包括已知的2D6抑制剂（奎尼丁、舍曲林）、底物（氯丙嗪、氟西汀、阿米替林）和既非抑制剂又非底物的化合物（酮康唑、曲格列酮），求得不同药物对不同酶的半数抑制浓度（IC50）。结果蛋白质印迹法检测显示各酶均表达良好。CYP2D6WT代谢丁呋洛尔和AMMC的Km值分别为19．22、2．06μmol、L^-1，Vmax值分别为154．53、21．60pmol·min^-1·mg^-1，Vmax／Km值分别为8．04、11．49μmin·m^-1。与CYP2D6WT比较，V7M代谢2种底物的Vmax值均要高得多（P〈0．05），G169R和E410K均稍低，而P34S都要低很多（P〈0．05）：各突变株的Km值也发生了或多或少的改变。药物对CYP2D6WT和V7M和G169R的抑制程度排序均为奎尼丁〉氯丙嗪〉氟西汀〉阿米替林〉舍曲林〉酮康唑／曲格列酮；药物对V7M和G169R的IC50值与CYP2D6WT的IC50值比值，奎尼r分别为0．88和0．80，氯丙嗪0．54和0．80，氟西汀0．65和1．02，阿米替林0．85和0．71，舍曲林0．43和0．74。结论CYP2D6部分单核苛酸突变株的酶动力学特征与野生株有明显差异，单核苷酸替换可导致酶对药物抑制的敏感性发生变化。     

中国登革2型病毒分离株乳鼠致病性差异与基因变化关系的研究

本文报道１９８７年从广西病人血清中分离的登革２型（Ｄ２）病毒Ｄ２－４３株和１９８５年从海南病人血清中分离的Ｄ２－０４株乳鼠致病性的差异与基因变化的关系。结果表明Ｄ２－４３株对乳鼠致病，Ｄ２－０４株不致病。Ｄ２－４３株和Ｄ２－０４株Ｃ到ＮＳ１基因的读码框架基本相同，均由３３８１核苷酸组成，编码氨基酸总数１１２７。包含三个结构蛋白Ｃ．ＰｒＭ（Ｍ）、Ｅ和一个非结构蛋白ＮＳ１。该两株病毒核苷酸序列同源性为９３．８％，氨基酸序列的类似性为９１．３％。Ｃ和Ｅ基因同源性为９５．０％～９５．８％，ＮＳ１基因为９２．２％，Ｍ基因为８６．７％，两株之间核苷酸序列的主要差异是在Ｍ基因。两株病毒的Ｃ－ＮＳ１基因与国际参考毒株比较，４３株与ＪＡＭ株类侧性最高，其次是ＮＧＣ株，与Ｓ１株类似性最小。而０４株只有Ｃ、Ｅ和ＮＳ１与ＪＡＭ株最高，ＰｒＭ（Ｍ）都与ＮＧＣ株最高。４３株与０４株的Ｍ基因相比较，０４株的ＰｒＭ（Ｍ）基因的同源性低于４３株，说明两株与国际参考毒株比较，主要差异也在Ｍ基因，乳鼠致病性差异可能与Ｍ基因变化有关。     

呼吸道合胞病毒逃逸株对单克隆抗体预防的抗性比较

目的 Palivizumab（PZ）是目前临床使用的惟一一个预防人类感染性疾病的单克隆抗体，本研究评估不同逃逸株在棉鼠体内对PZ预防的抗件。方法在细胞培养系统中筛选获得PZ逃逸株，测定其全长F基因序列，用微量中和法评估逃逸株对PZ的抗性，在棉鼠模型体内观察逃逸株对PZ预防的抗性差异。结果筛选获得的PZ逃逸株于F蛋白内第268位氨基酸（F212）和272位氨基酸（MP4、MS312、MS412和MS512）发生替换。用Western blot检测发现所有逃逸株PZ识别位点抗原性改变。F212复制能力受损，而其他逃逸株复制能力与A2母株接近。与A2原型株比较，MP4和MS412在体内外对PZ的中和活性具完全抗性。F212体外对PZ中和活性显示不完全抗性，但大剂量PZ在棉鼠体内仍能有效预防F212感染。结论不同PZ逃逸株体内对PZ的预防效应可能具有不同程度的抗性，某些逃逸株即使在PZ筛选压力下产生，亦不一定导致临床后果。     

白纹伊蚊基因组中CYP6家族新成员基因片段的克隆与分析

目的获得白纹伊蚊CYP6基因家族中新成员的基因片段。方法根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,分别以白纹伊蚊敏感品系和抗性品系基因组DNA为模板进行PCR,产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,获得与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的5个基因片段,并将推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果在白纹伊蚊敏感品系中获得了2个基因片段(AEDG-S1,AEDG-S2),核苷酸序列长度分别为240bp和236bp;在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系中获得了3个基因片段(AEDG-R2,AEDG-R3,AEDG-R4),核苷酸序列长度分别为236bp、236bp和239bp。所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在23.1%～53.8%之间,与CYP3家族的同源性在25.6%～43.9%之间,而与CYP4家族同源性较低,为13.9%～24.4%。结论所得5个序列为CYP6家族中5个新成员的基因片段。     

变异链球菌临床株乳酸脱氢酶mRNA水平的表达研究

目的 分析来自不同龋敏感人群变异链球菌不同基因型乳酸脱氢酶（LDH）的基因表达差异,探讨mRNA水平上基因表达与蛋白生物学功能及细菌致龋性的关系.方法 应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件分析,分别对20株来自不同基因型的LDH进行基因表达水平差异的评价和比较.结果 两种不同基因型LDH的mRNA表达水平不同（P＜0.05）,表现为低酶活性的B基因型1dh表达高;高龋和无龋菌株1dh表达的差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 变异链球菌乳酸脱氢酶基因表达水平具有遗传异质性,产酸因子1dh基因表达高低与龋病活跃性不呈正相关关系.