流行性乙型脑炎病毒NS4A蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌的表达

目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因.方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用ABI PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3a的BamHI与EcoRI酶切位点并命名为pNS4A,电泳进行限制性内切酶分析.结果:JEV NS4A蛋白基因大小为446 bp,DNA测序与发表的JEV JaGAr-01株相对应的DNA序列相符合,酶切后从重组质粒释出的插入子与JEV NS4A蛋白基因大小相一致.pNS4A在原核细胞内表达的特异蛋白分子量约16 kDa,与JEV NS4A蛋白理论计算相一致.结论:获取的JEV NS4A蛋白基因来自于JaGAr-01野生株,pNS4A在大肠埃希菌中表达的蛋白产物为JEV NS4A蛋白.     

重组流行性乙型脑炎病毒E基因原核表达条件的优化

目的：对重组流行性乙型脑炎病毒E基因0EVE）进行优化表达研究。方法：采用正交实验设计L9（34）方案,通过SDS—PAGE分析,对诱导时机、诱导时间、IPTG浓度、诱导温度四因素对重组产物表达的影响进行了研究。结果：菌体在37℃培养条件下,当LB培养基OD600达到0．8时,加入终浓度为0．025mmol／L的异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（1sopropylthio—β—D—galactoside,IPTG）诱导4h,可获得较高表达量的重组乙脑病毒E蛋白。结论：获得较为满意的表达条件,为下步纯化和进一步大规模生产奠定了基础。     

云南省脑炎患者脑脊液中检测到基因Ⅰ和Ⅲ型流行性乙型脑炎病毒

目的调查云南省流行性乙型脑炎(乙脑)患者感染乙脑病毒(JEV)基因型状况。方法在云南省西双版纳州医院和大理州医院采集脑炎患者急性期血清标本20份和脑脊液标本11份,用RT-PCR法检测JEV核酸,阳性者进行JEV-PreM/C区基因序列测定,用核苷酸同源性和系统进化分析进行基因型鉴定。结果用RT-PCR法从11例脑炎患者脑脊液标本中检测到JEV核酸阳性3份(JB114、JB135和DLN24),而20例脑炎患者血清标本均为阴性。3株病毒的PreM/C区核苷酸序列同源性分析显示,JB114、JB135与JEV基因Ⅰ型代表株同源性高达98.3%和99.2%,而与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型仅为82.5%~84.6%;DLN24与基因Ⅲ型代表株同源性为94.6%,而与基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型分别为85.0%、82.5%和80.4%。进化树分析显示,JB114和JB135位于基因Ⅰ型分支中,DLN24位于基因Ⅲ型分支上。结果表明,来自西双版纳的JB114和JB135病毒株属于基因Ⅰ型,来自大理的DLN24病毒株为基因Ⅲ型。结论云南省乙脑患者中分别存在基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV感染的病例,表明云南省存在这两个基因型病毒的共同流行。     

流行性乙型脑炎病毒研究进展

流行性乙型脑炎病死率较高，后遗症严重，在亚洲地区危害较大。本文就乙脑病毒的分类、抗原特性、对细胞和动物敏感性、基因组的结构特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究进展作一综述。     

流行性乙型脑炎9例临床分析

资料与方法 我院于2007～2008年收治流行性乙型脑炎（简称乙脑）患者9例,均在7～9月发病;男5例,女4例;男：女：1．25：1;年龄7—13岁,平均10岁。所有病例符合国家颁布的乙脑诊断标准。     

云南省金平县蚊虫及其与流行性乙型脑炎病毒关系的调查

1990年8月在金平县捕获成蚊4属18种5654只,其中库蚊9种、按蚊7种、伊蚊1种、阿蚊1种。中华按蚊、伪杂鳞库蚊和三带喙库蚊为优势蚊种。该县人群血清中乙型脑炎病毒抗体阳性率为21.33％(16/75)。三带喙库蚊和伪杂鳞库蚊可能是当地乙型脑炎病毒的传播媒介。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因的重组及重组质粒的DNA酶切图谱分析

应用DNA重组技术,作者构建了一个新质粒pKSU-HBs,它含有从HBV的DNA中切割下来的HBsAg基因片断。这个新质粒是一种穿梭质粒,既能够在E·COli中增殖,又能够在哺乳动物传代细胞株中复制,这是它作为制备HBV疫苗时的显著优点。此外,作者还分析了该质粒的物理图谱。     

流行性乙型脑炎

目的 分析我县流行性乙型脑炎(乙脑)的流行特征,探讨病原型别,为有效控制乙脑提供科学依据.方法 对乙脑监测管理系统信息、个案调查资料及实验室检测数据进行综合分析,对阳性脑脊液标本采用RT PCR方法进行分型.结果 2006年发病率、病死率较2005年有较大幅度上升;发病季节性特征明显,发病多为15岁以下的儿童,RT PCR分型结果显示病例脑脊液标本感染乙脑病毒为Ⅲ型病毒,与我国常见型别一致.结论 2006年我县乙脑疫情加重,但流行特征仍符合乙脑的一般流行规律.感染的乙型脑炎病毒为Ⅲ型病毒.加强对15岁以下高危人群的疫苗接种,是防控乙脑的关键环节.     

日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

目的构建日本脑炎病毒核心蛋白（JEV C蛋白）基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应。方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoRI/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PEG/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达。结果重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均〉0.8,在SD/-Trp/X/A培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC。结论成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pGBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础。     

不同途径接种乙脑毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所致BALB/c鼠的细胞免疫

目的:研究经不同途径接种乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所诱导的细胞免疫。方法:将乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗(命名为pJME)分别以肌注、滴鼻两种免疫方式免疫BALB/c鼠,流式细胞仪检测脾脏CD4 /CD8 T淋巴细胞亚群,乳酸脱氢酶释放实验测定脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果:pJME肌注组与滴鼻组免疫鼠CD4 T淋巴细胞百分比(30.91 0.72)%、(27.89 0.42)%,均高于灭活疫苗与载体肌注组(23.73 0.17)%、(23.78 0.21)%(P<0.05),肌注组显著高于滴鼻组(P<0.05);而CD8 T淋巴细胞百分比(14.62 0.25)%、(13.73 0.50)%,也均高于灭活疫苗和载体肌注组(10.80 0.39)%、(11.97 0.06)%(P<0.05),肌注组与滴鼻组无显著差异(P>0.05);两组有明显CTL效应(pJME肌注组29.1%,pJME滴鼻组17.1%),明显高于载体肌注组6.0%,pJME肌注组明显优于滴鼻组。结论:pJME以两种途径免疫鼠时可诱导明显细胞免疫反应。     

E Sequence Analysis of Persistently Infected Mutant Japanese Encephalitis Virus Strains

Persistent infection is liable to occur after most RNA viruses infect the host. This phenomenon may be related to the geno-variation of the structural proteins or non-structural proteins the viruses contain, which helps the viruses to escape the killing function of the host im- mune protective system[1]. Japanese encephalitis virus (JEV) is a single-stranded, positive-sense RNA virus, which belongs to flaviviruses family. The mortality of epidemic B encephalitis is as high as 30 %, and 50 …     

乙型脑炎病毒与黄热病病毒联合诊断基因芯片的初步实验研究

目的制备乙型脑炎病毒（JEV）与黄热病病毒（YFV）联合诊断基因芯片。方法基于早期实验室研究挑选出28条寡核苷酸探针制备检测芯片。克隆于质粒上的乙型脑炎病毒和黄热病病毒基因片段用于检测探针特异性，经限制性显示技术扩增并标记，与芯片杂交后完成扫描和数据分析。结果JEV、YFV探针与相应的荧光标记样本杂交后，均能检测出阳性荧光信号，而空白对照则检出阴性信号。结论基因芯片技术为病毒检测提供了一种早期、可靠的方法，具有应用于多病毒临床鉴别诊断的前景。     

实验用小型猪乙型脑炎病毒的分离鉴定

目的了解小型猪感染乙型脑炎病毒株的特点。方法猪脑组织经过处理,接种BHK21细胞,进行病毒培养、间接免疫荧光试验、中和试验、电镜观察,及通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离毒株E区段和PrM区段核苷酸序列,测序后进行基因型鉴定。结果 25只猪脑组织接种BHK_(21)细胞,有3个组织处理液能使BHK21细胞发生圆缩、集聚等病变;3个组织接种的BHK_(21)病变细胞滴片进行免疫荧光试验,均产生强绿色荧光反应;中和实验结果显示3株新分离株中和效价均为1∶64;电镜下可见直径40nm左右球型病毒粒子;RT-PCR产物测序结果与疫苗株E区段核苷酸比较同源性均为95%;3株新分离株均为GIII型乙脑病毒。结论实验表明小型猪场存在乙型脑炎病毒感染,为GIII型乙型脑炎病毒。     

用生物反应器制备乙脑灭活疫苗的研究

目的 用生物反应器制备乙脑纯化灭活疫苗.方法 用搅拌式生物反应器培养Vero细胞,接种并培养乙型脑炎病毒,将收获的病毒液进行灭活和纯化.结果 细胞密度都增至2.4×106ml-1以上,病毒滴度都>7.25 lgLD50/ml.结论 用生物反应器制备乙脑灭活纯化疫苗的工艺合理,可以生产出高滴度的乙型脑炎病毒液.     

多种受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼减轻流行性乙型脑炎病毒感染的研究

目的 评价多种受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（sunitinib）在体内和体外治疗流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）感染的效果。方法 4周龄BALB/c小鼠腹腔注射JEV。感染小鼠以两种给药策略进行治疗,分别为连续5 d和连续10 d给与舒尼替尼治疗,后观测其体重变化和生存率;通过qRT-PCR技术检测小鼠脑内病毒RNA载量的变化;利用免疫组织化学染色技术检测小鼠脑内CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的数量及分布;利用免疫荧光染色技术观察药物治疗前后小鼠脑内JEV病毒E蛋白的表达。此外,通过JEV体外感染Vero细胞并给与一定浓度舒尼替尼进行干预,观察细胞存活状态;采用间接免疫荧光染色观察治疗前后细胞内JEV病毒E蛋白的表达。结果 小鼠感染JEV后连续给与舒尼替尼可显著提高其生存率,并且连续给药5 d的生存率和体重变化结果优于连续给药10 d。舒尼替尼治疗后减少了脑内CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞浸润,小鼠脑内血管套袖样改变减轻;但治疗前后小鼠脑内的JEV病毒载量和脑内E蛋白的表达变化不太明显;感染JEV的Vero细胞在给与...     

乙型脑炎病毒E蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的：构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统。方泼：应用RT-PCR法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因,定向克隆入载体pPICZαA,将重组质粒以PineⅠ线性化并电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定。结果：PCR扩增产物约为1350bp,定向克隆获得pPICZαA-E表达载体,经测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性为100％,电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株GS115-E,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论：成功构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统,为进一步进行E蛋白真核表达研究奠定基础。     

乳鼠接种编码乙型脑炎病毒PrM/E蛋白的重组质粒DNA可诱发保护性免疫

目的：评价乙型脑炎DNA疫苗对乳鼠的免疫保护效果．方法：以DNA疫苗(pV/JE)、质粒载体对照(pVAX1)和PBS接种BALB／c乳鼠后，测定其病毒特异性的CTL活性、结合抗体、中和抗体，并以100LD50JEV攻击，观察保护效果．结果：DNA疫苗组的CTL活性为37．5％，而载体和PBS对照组的CTL活性分别为18％和8．5％．二次免疫后DNA疫苗组的免疫荧光抗体滴度为1：28．3(几何平均效价)，抗体阳转率为80％(8／10)；混合血清的中和抗体效价为1：40．JEV攻击后，DNA疫苗组小鼠获得75％(6／8)的保护率，而对照组小鼠全部死亡．结论：所构建的DNA疫苗可诱发乳鼠产生抗JEV的CTL活性、中和抗体及保护活性，为JEV新型疫苗的研制提供重要的实验依据．     

反义硫代寡聚核苷酸对抗日本脑炎病毒的活性

目的：针对日本脑炎病毒ＳＡ－１４株病毒基因组５’端第一个ＡＵＧ起始码前后和非结构蛋白ＮＳ５的５’端基因区设计并合成了两个硫代的反义寡聚核苷酸（二十聚），观察了它们对病毒在ＢＨＫ－２１细胞中复制的影响。方法：以定量病毒攻击ＢＨＫ－２１细胞，分别测定ＣＰＥ，病毒蛋白质表达及病毒空斑形成抑制率，观察不同浓度的反义核酸在不同时间对病毒复制的作用。结果：细胞培养液中含有１．０μｍｏｌ／Ｌ即可明显推迟ＣＰＥ的