类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

含CpG和CTB的HIV多表位基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含非甲基化的CpG ODN序列及霍乱毒素B亚单位（CTB）的HIV复合多表位基因的真核表达载体,并在体外进行表达。方法设计并合成含CpG ODN序列和linker序列的CTB基因引物,用PCR方法扩增CpG-CTB基因（CC）,定向连接到真核表达载体pVL上,然后在CC基因下游插入HIV复合多表位基因MEGNp24,构建重组质粒pVL-CC-MEGNp24,酶切鉴定。纯化重组质粒,转染293T细胞,RT-PCR和细胞免疫染色方法分别检测CTB和p24基因的转录及表达,同时设质粒pVL及空白对照。结果构建了重组质粒pVL-CC-MEGNp24,该质粒转染293T细胞后,CTB和复合多表位基因在293T细胞中得到稳定表达。结论成功构建了含免疫佐剂的HIV复合多表位真核表达载体,为后期疫苗的研究奠定了基础。     

应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略

目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计（1.5～2.0kb）,以便用聚合酶链反应（PCR）方法筛选中靶载体和ES细胞（embrgonic stem cell）。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-（tet）质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体（BAC）实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。     

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建和鉴定人β防御素2（HBD2）的重组腺病毒表达载体，并观察其转染大鼠真皮多能干细胞（dMSCs）后的表达。方法反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增HBD2全长cDNA，亚克隆至穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中，然后转化含骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌BJ5183，通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞，包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞，并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果 经测序、酶切及聚合酶链反应（PCR）鉴定，表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA，并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中，进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs，并有效表达HBD2。结论 本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体，并证实其可在dMSCs中表达。     

耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达

目的扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础。方法以无任何突变的pGEX-6p-1-pprM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的Luria-Bertani（LB）固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定。通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达。裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达。结果菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功。荧光拍照结果显示,pEGFP-C1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×103处有融合蛋白表达。结论笔者成功将所构pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础。     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0463的表达与抗原性鉴定

目的表达梅毒螺旋体（Tp）重组蛋白Tp0463（rTp0463）并鉴定其抗原性,为进一步探讨其在梅毒血清学诊断和免疫保护中的作用奠定基础。方法 PCR扩增Tp0463基因,构建原核表达重组体pET-28a（＋）/Tp0463,转化宿主菌诱导表达重组蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,Westernblot鉴定表达产物的抗原性。结果成功构建了原核表达重组体pET-28a（＋）/Tp0463,经诱导高效表达了一分子量大约为16KDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度〉90%;Westernblot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论高效表达了rTp0463,该重组抗原有良好的抗原性。     

霍乱弧菌外膜蛋白W的原核表达及抗原性分析

目的在大肠杆菌中表达霍乱弧菌种特异性外膜蛋白（Omp）W,纯化后制备检测用OmpW抗体。方法采用PCR法以霍乱弧菌基因组为模板扩增ompW基因,插入表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-32a-ompW;重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导获得目的蛋白,纯化后免疫新西兰大耳白兔,制备OmpW的多克隆抗体并进行鉴定。结果扩增得到ompW基因片段,并成功构建pET-32a-ompW原核表达系统,重组蛋白OmpW以包涵体形式高效表达;制备的OmpW抗体能与天然的O1群和O139群霍乱弧菌结合。结论霍乱弧菌OmpW可由原核系统高效表达,免疫获得的抗体具有较好的效价,为进一步制备霍乱弧菌检测用抗体奠定基础。     

蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的通过基因工程手段实现牵引丝关键组成蛋白MaSp1在大肠杆菌中的异源表达,并对其进行分离纯化,从而建立基因工程蜘蛛丝基因序列串联拼接、载体构建以及原核表达与纯化的关键技术体系。方法利用同尾酶连接法对合成的基因工程蜘蛛丝基因单体序列进行串联拼接,获得多倍串联体克隆重组子,将鉴定正确的多倍串联体克隆重组子与原核表达载体pET28a（＋）连接,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导其表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定。在此基础上对工程菌进行高密度发酵,所获蛋白通过硫酸铵分级分离方法进行纯化。结果与结论成功构建了基因工程蜘蛛丝MaSp1多串联体的表达载体,原核表达蛋白的相对分子质量与预期一致,且纯化的目的蛋白纯度达80%以上。上述研究工作为开展基因工程蜘蛛丝蛋白的规模化制备建立了关键技术方法,并为后续基因工程蜘蛛丝的人工纺丝提供必要的前提和工作基础。     

双基因重组腺病毒表达载体pAdxsi—GFP-HIF—KGF的构建及表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）的腺病毒载体（pAdxsi—GFP—HIF—KGF）,观察其在A549中的表达。方法：从低氧处理A549细胞中PCR扩增HIF—1αDNA,并连接到载体pShuttle—CMV—EGFP上得到重组质粒pShuttle—GFP—HIF,同时将从质粒pIRES2一EGFP—KGF扩增的KGF基因也克隆其上,获得穿梭重组质粒pShuttle—GFP—HIF—KGF。再将其重组到pAdxsi病毒骨架载体上,构建携带HIF-1仅和KGF双基因的重组腺病毒载体。观察重组腺病毒转染3_549细胞后表达情况。结果：证实携带HIF—1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF成功构建。其转染A549细胞后可有效表达HIF一1和KGF蛋白,48h时HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／ml,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／ml。结论：成功构建了双基因腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF,其可有效转染表达,具有进一步在肺损伤防治应用的前景。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E.Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功:重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。     

靶向载基因及穿膜肽超声造影剂转染缺氧人脐静脉内皮细胞的研究

目的 探讨P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂的制备及转染缺氧损伤型人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的可行性.方法 采用机械振荡法及碳二亚胺法制备P-选择素靶向载绿色荧光蛋白基因及穿膜肽超声造影剂,检测其形态分布、浓度、粒径,采用激光共聚焦显微镜观察基因和穿膜肽的分布,用荧光分光光度法计算基因及穿膜肽的包封率.体外培养HUVEC,用过氧化氢处理制备HUVEC缺氧模型,并分为靶向和非靶向载基因及穿膜肽造影剂组进行转染实验.用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,流式细胞仪检测转染率,并用SPSS 17.0统计软件进行t检验及直线相关分析.结果 制备的P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂平均粒径约(2.15±0.36) μm,计数为(1.58±0.23) ×107个/ml.激光共聚焦显微镜下观察到基因和穿膜肽均匀分布在造影剂壁上,基因和穿膜肽的包封率分别为28％[y=0.932x -0.09(r =0.993,P＜0.05)]和25％ [y =5.875x -0.81(r =0.987,P＜0.05)].转染24 h后,荧光显微镜下观察到靶向和非靶向载基因及穿膜肽造影剂组均有绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测靶向组和非靶向组平均转染率分别约为( 18.74±0.47)％和(15.34±0.22)％(t=10.923,P＜0.001).结论 P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂能够转染缺氧损伤的HUVEC,这为靶向基因投递提供了新的思路.     

人miR-139高效真核表达载体的构建及其功能初探

目的 构建人miR-139高效真核表达载体,初步探究miR-139在乳腺癌ZR75-1细胞中的功能.方法 设计成熟miR-139的PCR引物,扩增包含miR-139成熟序列的基因组序列.将扩增产物亚克隆到真核表达载体PIRES2-EGFP(IE)上,构建miR-139真核表达载体IE-139.将IE-139转染至乳腺癌ZR75-1细胞中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139的表达情况,同时检测过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc、EIF4G2和ZBTB34的mRNA水平.结果 酶切、测序结果表明,人miR-139真核表达载体构建成功;qRT-PCR表明,miR-139能在乳腺癌ZR75-1细胞中高效表达(P<0.01),过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但ZBTB34的下降水平不明显.结论 成功构建了人miR-139真核表达载体IE-139,通过qRT-PCR检测,证明该载体能成功实现miR-139的高效过表达,并且miR-139能明显抑制乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平,这为进一步研究miR-139的功能及调控靶基因的分子机制奠定了基础.     

大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体的构建及功能验证

目的构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达。方法从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白（GFP）基因以验证其接合和整合功能。结果原载体pBeloBAC11的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点（MCS）后得到载体pBTIBAC11。结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的异源表达奠定了基础。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

MRSA和鲍曼不动杆菌抗药基因检测及对3种醇类消毒剂抗性研究

目的观察耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和鲍曼不动杆菌（ABA）对3种醇类消毒剂的抗性与耐药基因携带情况。方法选择最小抑菌浓度（MIC）试验、悬液定量杀菌试验和耐药基因PCR检测方法进行研究,并与标准菌株作平行比较检测。结果 2株MRSA对3种醇的MIC值高于6株鲍曼不动杆菌,稍高于标准菌株6538和8099。杀菌实验结果显示,3种醇对2株MRSA的杀灭对数值均低于标准株6538和8099,对MRSA-1杀灭对数值大于MRSA-2,对6株鲍曼不动杆菌的杀灭对数值大于标准株8099;作用至1 min时,3种醇均能将8099全部杀灭,对6株鲍曼不动杆菌的杀灭对数值D162〈3070122〈3070341〈3040217     

利用正负筛选打靶载体在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因

目的半乳糖-α1,3-半乳糖（αGal）表位是猪到人异种移植中引起排斥反应的主要异种抗原。通过同源重组敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因可从异种移植物表面彻底清除αGal表位。本研究的目的在于利用正负筛选打靶载体定向缺失猪GGTA1基因。方法构建猪α1,3-半乳糖基转移酶基因正负筛选打靶载体pSL/GT,载体包含了正负筛选标记基因neo和tk,打靶载体线性化后用脂质体包裹转染猪肾细胞系PK-15细胞,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,挑选抗性克隆进行PCR及Southern杂交鉴定。结果共得到436个抗性细胞克隆,其中31个克隆PCR结果阳性。经Southern杂交鉴定证实,其中1个克隆发生了同源重组,为杂合子。结论本研究构建了有效的猪GGTA1基因的正负筛选打靶载体pSL/GT,并利用其在猪肾细胞系PK-15细胞中定向缺失GGTA1基因,获得了杂合子GGTA1（＋/-）PK-15细胞。