新型融合多肽HTPP-MDC体外抑制HBV复制活性及亚细胞定位

 目的： 研究肝细胞靶向穿膜肽-家蝇天蚕素（HTPP-MDC）融合多肽体外对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用及其在肝细胞中的定位。方法：不同浓度HTPP-MDC分别与HepG2.2.15细胞和Chang liver细胞共培养,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测药物对细胞的毒性作用,应用ELISA和实时荧光定量 PCR技术定量研究HTPP-MDC对HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制的影响。应用激光共聚焦技术研究HTPP-MDC在肝细胞中的定位。结果：HTPP-MDC 在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg和HBeAg,对HBV DNA的复制亦有显著抑制作用。激光共聚焦显微镜观察显示HTPP-MDC进入细胞内部。结论：HTPP-MDC在体外对 HBV 复制有较强的抑制作用,并能快速透过细胞膜进入细胞内,有望用于临床治疗慢性乙型肝炎相关疾病。     

蝉拟青霉多糖体外对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的: 探讨蝉拟青霉多糖(PcPS)体外对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用及对HepG2.2.15细胞表达Toll样受体4 (TLR4) mRNA的影响。方法: 以不同浓度PcPS与HepG2.2.15细胞株共培养,以拉米夫定 (LMV)为阳性对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和ELISA法,检测PcPS对HepG2.2.15细胞毒性作用及其分泌HBsAg、HBeAg的情况。实时荧光定量PCR分析PcPS对HepG2.2.15细胞表达与分泌HBV-DNA和TLR4 mRNA表达的影响。结果: 蝉拟青霉多糖在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg,最大抑制率分别为44.8%、31.0%;对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA复制和TLR4 mRNA表达均有一定抑制作用。结论: 一定浓度的蝉拟青霉多糖在体外具有显著抑制HBV的复制作用。     

新型CpGODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的:探讨我室自行设计的CpG ODN(CpG BW001)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用.方法:CpG BW001刺激人外周血单个核细胞(PBMC)48小时,用VSV病毒保护实验及ELISA法检测培养上清的病毒保护能力及其中的IFN-α含量.将上述CpG BW001刺激人PBMC的上清与HepG2.2.15细胞共孵育12天后收集培养上清,用放射免疫法检测该培养上清液中HBsAg及HBeAg的含量,用点杂交法检测HBV DNA的含量.结果:CpG BW001刺激人PBMC产生以IFN-α为主的抗病毒物质;CpG BW001刺激人PBMC的培养上清作用于HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量明显减少,且细胞内HBV DNA的含量也显著降低.结论:CpG BW001能通过刺激细胞产生抗病毒物质如IFN-α等,从而在体外抑制HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制.     

注射用免疫核糖核酸II的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

 目的 研究干扰素刺激基因因子3（ISGF3）在干扰素α（IFN-α）抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制机制中的作用。 方法 应用定量PCR技术检测IFN-α处理前后人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞上清HBV DNA含量，DNA印迹法检测IFN-α处理前后HepG2.2.15细胞内HBV复制中间体的变化，蛋白质印迹法检测IFN-α处理前后HepG2和HepG2.2.15细胞中ISGF3的3个组分即信号转导和转录活化因子（STAT）1、磷酸化STAT2和ISGF3γ以及双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)蛋白质表达水平的改变。用酪氨酸酶抑制剂染料木黄酮抑制IFN-α作用后，再次进行上述检测。 结果 IFN-α处理后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和细胞内HBV复制中间体减少，HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达水平均升高。加染料木黄酮抑制IFN-α后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和复制中间体无减少，而HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达均减少。 结论 ISGF3是IFN-α抑制HBV复制的关键因子。     

鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达

目的 构建针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA（short interfering RNA）表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法 设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论 载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.     

乳糖化多聚赖氨酸导向反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究乳糖化多聚赖氨酸（Gal-PLL）导向反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的特异性抑制作用。方法 根据聚合酶链反应（PCR）产物直接测序结果,在HBV U5样序列区合成了一段16聚硫代磷酸的反义寡核苷酸,并将其与肝靶向配体GaL-PLL连接,在2.2.15细胞比较,观察了它们对HBV基因表达的影响,结果 通过测序确定了2.2.15细胞中的HBV DNA属于HBV表面抗原ayw1亚型,并将此用于反义寡核苷酸的序列设计;经荧光组化分析表明,Gal-PLL对大鼠肝组织有选择性亲和力;Gal-PLL与DNA形成复合物的最佳摩尔比为2：1,在相同实验条件下,硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70％和58％,而Gal-PLL硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96％和82％,同时培养上清液和细胞中HBV DNA的含量明显下降,无关序列寡核酸无明显效果,寡核苷酸对细胞未产生毒性,结论 肝靶向配体和反义寡核酸的复合物可以通过无唾液酸糖蛋白受体靶入2.2.15细胞内,并对HBV基因表达和复制产生特异性抑制作用。     

巯基化Ras相关蛋白7a抑制人肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV复制

目的探究人肝癌细胞HepG2.2.15中Ras相关蛋白7a (Rab7a)的巯基化机制及其对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法通过生物素转换实验检测H2S对HepG2.2.15细胞中Rab7a巯基化水平的影响并验证Rab7a的巯基化位点;通过酶联免疫法、RT-qPCR和Western blot检测巯基化的Rab7a对HBV复制标志物水平的影响。结果在HepG2.2.15细胞中H2S可增强内源性Rab7a的巯基化水平(P<0.01);NaHS(H2S速释供体)可增强外源性Rab7a的巯基化表达,但其巯基化位点突变后则不受NaHS影响(P<0.01);Rab7a巯基化后,可抑制HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA及细胞内HBV-cccDNA、3.5kb RNA、total RNA和HBcAg蛋白的表达(P<0.05)。结论 Rab7a的巯基化抑制HBV阳性细胞系HepG2.2.15细胞中HBV的复制水平。     

SAMHD1 对HBV DNA 形成的抑制作用及其机制研究

目的:研究不同肝细胞SAMHD1 表达水平及其对HBV DNA 形成的抑制作用和相关机制。方法:通过实时荧光定量PCR 和Western blot 法检测Jurkat、THP-1、HepG2、HepG2.2.15 和Huh7 细胞等细胞SAMHD1 mRNA 和蛋白表达水平;通过对HepG2.2.15 细胞转染过表达质粒和shRNA,升高或者降低SAMHD1 的表达水平,观察不同SAMHD1 表达水平对HBV DNA 水平的影响;补充不同浓度的dNTP,比较不同dNTP 浓度对HBV DNA 水平的影响。结果:肝癌细胞系有较高的SAMHD1表达水平;降低SAMHD1 可以使HBV DNA 水平升高2.3 ~ 2.8 倍,升高SAMHD1 可以使HBV DNA 降低至33% 左右(P<0.01);升高dNTP 浓度可以促进HBV DNA 的合成水平,抵消SAMHD1 的抑制作用。结论:SAMHD1 可以抑制肝癌细胞内HBV DNA 的生成,可能是通过降低细胞内dNTP 浓度实现的。     

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的： 我们先前的研究证明HMGN2（high mobility group nucleosomal-binding domain 2）是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法: 应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和第6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量。结果: 从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100 mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5 mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBV DNA拷贝数。结论: HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。     

CpG-ODN体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的:探讨CpG-ODN体外对HBV复制和HBV抗原表达的抑制作用。方法:CpG-ODN体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC),用ELISA检测培养液中IFN-α及IFN-γ的水平。将不同比例的PBMC培养上清与HepG2. 2. 15细胞共孵育 2、4、6、8d后,用ELISA和荧光定量PCR法,分别检测培养上清液中HB sAg、HBeAg和HBVDNA的水平。结果:CpG-ODN可诱导PB MC分泌IFN-α和IFN-γ。CpG-ODN本身虽不能直接抑制HBV的复制,但经刺激活的化的PBMC的培养上清,却能显著抑制 2. 2. 15细胞产生HBsAg、HBeAg和HBVDNA,在培养的第 8天,抑制率最高分别达 90. 8%、31. 3%和 32. 2%。结论:CpG-ODN作为一种新型的免疫调节剂,可诱发机体的免疫效应,抑制HBV复制和HBV抗原的表达。     

Suppression of furin by interferon-γ and the impact on hepatitis B virus antigen biosynthesis in human hepatocytes

The roles of furin and intrahepatic cytokines in chronic heptatitis B virus (HBV) infection remain largely unknown. Here, we examined the relations between furin, IL-10, IL-12β, interferon (IFN)-γ, programed death (PD)-1, programed death ligand (PD-L)1, and the suppression of hepatitis B e antigen (HBeAg) and surface antigen (HBsAg) biosynthesis. Liver biopsies were performed on 20 chronically HBV-infected (15 HBeAg-positive and 5 HBeAg-negative) patients to assess liver inflammation/fibrosis, and mRNA levels of furin, IL-10, IL-12β, IFN-γ, PD-1, and PD-L1 were assessed by quantitative real-time PCR. IFN-γ mRNA abundance was associated with lower furin mRNA levels and higher PD-1 and PD-L1 mRNA levels in liver tissue from HBeAg-positive patients. IL-10 and IL-12β mRNA levels positively correlated with IFN-γ expression levels (P < 0.05). PD-L1 and furin mRNA levels were further assessed in IFN-γ-stimulated hepatoma cell lines with (HepG2.2.15 cells) and without (HepG2 and Huh7 cells) HBV replication. IFN-γ enhanced PD-L1 expression in hepatoma cells. In HepG2.2.15 cells, IFN-γ further suppressed furin and HBeAg expression. Furin inhibition and knockdown in HepG2.2.15 cells also down-regulated HBeAg and HBsAg biosynthesis. These data suggest that IFN-γ modulates the inflammatory response to avoid excessive hepatocyte damage through the enhancement of PD-1/PD-L1 expression, whereas furin suppression may contribute to a reduction in HBeAg/HBsAg biosynthesis.     

Inhibition of the hepatitis B virus replication in vitro by an oligodeoxynucleotide containing cytidine-guanosine motifs

Oligodeoxynucleotides (ODNs) containing unmethylated CpG dinucleotides within specific sequence contexts (CpG motifs) are known as potent activators of the immune system and inducers of several Th1-associated immunomodulatory cytokines. CpG ODNs show promise as vaccine adjuvants and immunoprotective agents in animals. Here, we investigated the inhibitory effects of D type CpG ODN on hepatitis B virus (HBV) replication in vitro. The experiments were performed in HepG2 2.2.15 cells, which contain an integrated tandem dimer of the HBV genome and are routinely used for anti-HBV study. HepG2 2.2.15 cells co-cultured with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) plus CpG ODN for 3 days, remarkably reduced the secretion of HBsAg and HBeAg, when compared to cells treated with PBMCs plus non-CpG ODN. The levels of intracellular HBV DNA and HBV mRNA were also decreased. Treatment of HepG2 2.2.15 cells with the culture supernatants of PBMCs activated by CpG ODN can remarkably suppress the secretion of HBsAg and HBeAg as compared with that of PBMCs without CpG ODN activation under the same conditions. There were no inhibitory effects on the replication of HBV to be found for CpG ODN treatment alone. These results suggest that CpG ODN can inhibit indirectly HBV replication in vitro via activating the immune cells, and could contribute to the development of an immunoregulator against HBV infection.     

反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达简

 目的 探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果。方法 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,体外转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响。 结果 加入锁核酸后,对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用,6 d后抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%。锁核酸对细胞代谢无明显影响。结论 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗治疗提供理论和实验依据。     

shRNA表达载体的构建及对HBV复制和表达的抑制

目的:构建shRNA的表达载体,检测针对乙型肝炎病毒(HBV)的shRNA的稳定表达质粒对HBV复制和表达的影响。方法:扩增U6启动子构建shRNA表达载体pU6。针对HBV基因组序列设计并化学合成双链核苷酸克隆到pU6载体得到质粒pU6B/HBVi,脂质体介导转染带有HBV基因组的2.2.15细胞,定量PCR和ELISA法检测pU6B/HBVi对HBV复制和表达的影响。结果:成功构建了shRNA的真核表达载体;针对HBV的pU6B/HBVi质粒对HBV的复制和表达有明显的抑制作用。结论:稳定表达shRNA的pU6B/HBVi质粒可以抑制HBV在2.2.15细胞中的复制和表达。     

pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

着色性干皮病基因D和p53对HBV复制的影响

 目的:探讨人着色性干皮病基因D(XPD) 和p53对乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法:使用脂质体转染法把重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞,转染后的第2天用20 μmol/L pifithrin-α（p53抑制剂）孵育细胞24 h。实验共分为空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α组和pifithrin-α组。使用RT-PCR法检测XPD、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx） mRNA表达的变化;使用ELISA法检测培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的变化;用荧光定量PCR法检测培养上清液中HBV-DNA含量的变化;用bDNA法检测细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量的变化。结果:RT-PCR结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染可使得XPD mRNA表达增高,XPD表达增高能使得HBsAg、HBeAg和HBx mRNA表达明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。ELISA结果显示,XPD表达增高能使得培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。荧光定量PCR结果显示,XPD表达增高能使得培养上清液中HBV-DNA含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。bDNA结果显示,XPD表达增高使得细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量明显减少,而pifithrin-α能抑制XPD的这一作用（均P<0.01）。结论: XPD能通过p53通路抑制HBV复制,所以XPD和p53可能成为乙型肝炎抗病毒治疗的作用靶点。