醛固酮抑制Akt活性诱导大鼠足细胞凋亡

目的 探讨醛固酮(ALD)能否诱导培养大鼠足细胞凋亡及Akt信号通路是否参与ALD诱导的足细胞凋亡。方法 体外培养并鉴定大鼠足细胞。无血清同步化处理24 h，分别给予终浓度为0(对照组)、10-9~10-5 mol/L ALD，伴或不伴螺内酯(10-7 mol/L)共孵育。流式细胞仪检测凋亡指数，Hoechst-33342染色检测足细胞凋亡。多聚酶链反应(RT-PCR)检测足细胞盐皮质激素受体(MR)和11β-羟类固醇脱氢酶2 (11β-HSD2) mRNA表达。Akt活性检测试剂盒检测Akt活性表达。结果 ALD以时间和剂量依赖方式诱导足细胞凋亡。螺内酯可明显抑制ALD诱导的足细胞凋亡[ALD+螺内酯组(5.61%±0.72%)比ALD组(15.10%±1.46%)，P < 0.05]。RT-PCR结果证实足细胞表达MR和11β-HSD2 mRNA。螺内酯可部分阻断ALD对Akt活性的抑制作用。ALD诱导的足细胞凋亡率与Akt活性呈明显负相关(r=-0.77， P < 0.05)。结论 ALD可诱导大鼠足细胞凋亡，Akt活性下降可能参与ALD诱导的足细胞凋亡。     

AGE与RAGE相互作用通过活性氧引起足细胞凋亡

目的：探讨晚期糖基化终末产物（AGE）对足细胞凋亡的影响,及氧化应激在其中的作用。方法：小鼠足细胞株由美国纽约西奈山医学院Peter Mundel教授馈赠。用钙磷脂结合蛋白Ⅴ-荧光异硫氰酸盐（FITC）和碘化物（PI）标记细胞,采用荧光激活细胞分类（FACS）法来计数凋亡和坏死的足细胞。Dharmacon On TargetPlus SMARTpool si RNA试剂和Amaxa RNAi nucleofection试剂盒成功转染si RNA到足细胞。绿荧光蛋白载体证明转染的有效性,分别采用Western Blot和实时定量PCR（RT-PCR）方法来检测si RNA转染足细胞后AGE受体蛋白（RAGE）靶基因蛋白质和mRNA的表达。用LS50B型荧光分光光度计测活性氧,根据波长485nm在530nm发射的荧光来判断活性氧（ROS）的产生。观察活性氧的清除剂N-乙酰基-半胱氨酸（NAC）能否减少AGE-BSA诱导的足细胞凋亡。结果：AGE引起足细胞的凋亡呈剂量依赖性,随AGE浓度的增大,凋亡的发生率逐渐升高;RAGE siRNA能减少60%~70%RAGE mRNA和蛋白质的表达;ROS的清除剂NAC可明显减少AGE-BSA引起的ROS的产生和足细胞凋亡。结论：AGE与RAGE作用后活性氧产生增加,活性氧的增加可能是AGE引起足细胞凋亡的途径之一,可通过抗氧化减少ROS的产生延缓糖尿病肾病的进展。     

醛固酮诱导大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡

目的 观察醛固酮在体内能否诱导主动脉平滑肌细胞凋亡.方法 将24只SD大鼠随机分为3组,每组8只:(1)空白溶剂设为对照组;(2)醛固酮组;(3)醛固酮+血管扩张剂组.渗透泵内分别注入醛固酮(1 μg/h)或空白溶剂,然后埋于大鼠背部皮下.肼苯哒嗪[25 mg/(kg·d)]溶于引用水,每日灌胃1次.8周后脱氧核苷酸末端转移介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡的主动脉平滑肌细胞.结果 醛固酮组和醛固酮+血管扩张剂组大鼠主动脉TUNEL阳性的平滑肌细胞分别占(18.0±1.5)％和(16.5±2.0)％,与对照组(4.7±1.0)％比较,差异有统计学意义(P＜0,05);后两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 醛固酮在体内可以直接诱导主动脉平滑肌细胞凋亡.     

醛固酮对肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的 研究醛固酮（Ald）对大鼠肾小球系膜细胞（MC）凋亡的影响并探讨其可能机制。 方法 24只SPF级SD大鼠,腹腔埋置渗透性微泵,随机分为对照组（Con组,生理盐水代替Ald处理28 d;n=8）、Ald输注组（Ald组,1.5 μg/h,28 d;n=8）、依普利酮干预组（Epl组,Ald 1.5 μg/h+依普利酮 100 mg&#8226;kg-1&#8226;d-1,28 d;n=8）。药物处理0 d、7 d、14 d、21 d、28 d时,分别测量大鼠尾动脉收缩压并收集24 h尿液,测定尿白蛋白排泄率（UAER）;于28 d时心脏采血并分离大鼠双侧肾脏,检测血肌酐、血钾及血Ald水平;PAS染色观察肾小球病理改变;TUNEL法检测MC凋亡。体外培养大鼠MC,Annexin V-PI双染流式细胞仪检测MC凋亡;实时定量PCR检测Bcl-2、Bax mRNA表达,Western印迹检测Bad磷酸化水平。 结果 Ald组大鼠血压及UAER自7 d时起显著高于同期Con组（P < 0.05）,28 d时Ald组大鼠血浆Ald水平约为Con组的6倍（P < 0.05）,血钾显著低于Con组（P < 0.05）,血肌酐与Con组差异无统计学意义（P > 0.05）。PAS染色显示Ald组大鼠肾小球系膜区增宽,基质增多,部分出现节段硬化。TUNEL检测发现,Ald组大鼠MC凋亡显著高于Con组及Epl组（均P < 0.05）。体外实验发现,随着Ald作用时间的延长,MC凋亡数明显增加（P < 0.05）;Ald组Bcl-2 mRNA表达下降（P < 0.05）,Bax mRNA表达升高（P < 0.05）;Ald组Bad蛋白磷酸化水平显著低于Con组（P < 0.05）。依普利酮能显著逆转Ald诱导的上述作用。 结论 Ald能促进大鼠MC凋亡,依普利酮干预可以明显降低Ald的促凋亡效应。Bad蛋白的去磷酸化作用可能是Ald致MC凋亡过程中的重要环节。     

活性氧介导铁过载诱导成骨细胞坏死性凋亡的调控机制

目的:探讨铁过载是否能够诱导成骨细胞发生坏死性凋亡,并探讨其分子机制。方法:采用50、100、200 μmol/L枸橼酸亚铁(FAC)对小鼠胚胎成骨细胞系(MC3T3-E1)进行干预,以模拟铁过载状态;同样将加入等量生理盐水,设为对照组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测铁过载对成骨细胞活性的影响,流式细胞仪检测铁过载...     

血管紧张素Ⅱ灌注诱导nephrin表达改变与足细胞凋亡

目的 研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）灌注对大鼠足细胞裂隙膜分子nephrin表达及足细胞凋亡的影响，以及探讨AngⅡ引起蛋白尿及肾小球硬化的机制。方法 36只雄性Sprague Dawley大鼠分为AngⅡ灌注组(400 ng&#8226;kg-1&#8226;min-1)、生理盐水灌注组和正常对照组，测定28 d内大鼠血压及尿蛋白。分别于14、28 d处死动物取肾，观察组织学改变，并用免疫荧光、免疫电镜检测nephrin分布。RT-PCR及Western印迹法分别检测nephrin mRNA及蛋白表达。TUNEL法检测足细胞凋亡。结果 (1) AngⅡ灌注组大鼠血压升高，14 d达峰值并维持该水平至28 d；AngⅡ灌注7 d即出现蛋白尿，并持续增加。(2) AngⅡ灌注14 d时，足细胞裂隙膜变窄；灌注28 d时，足突增宽及节段性融合，部分足细胞有凋亡小体形成，少数肾小球出现节段性硬化。TUNEL法检测发现足细胞凋亡[（2.7±1.6）个/肾小球切面]，凋亡数与蛋白尿量呈正相关（r = 0.86，P < 0.01）。(3) AngⅡ灌注14 d时，肾皮质nephrin mRNA及蛋白表达上调（P < 0.05）。nephrin由正常的沿毛细血管袢线状分布向粗颗粒、团块状分布模式转变。AngⅡ灌注28 d时，肾皮质nephrin mRNA及蛋白表达下降（P < 0.05），且nephrin蛋白表达与足细胞凋亡数呈负相关（r = －0.63，P < 0.01）。 结论 AngⅡ灌注诱导的nephrin表达及分布改变可能导致了足细胞凋亡及肾小球硬化的发生与发展。     

不同降压药对醛固酮输注大鼠足细胞损伤的影响

目的 研究醛固酮（ALD）对肾小球足细胞的损伤作用并探讨醛固酮拮抗剂依普利酮（EPL）、氨氯地平（CCB）和替米沙坦（ARB）对ALD所致损伤的影响及机制。 方法 30只SD大鼠被随机分为对照组（CTL组）、ALD输注组以及ALD输注并用EPL、CCB或ARB治疗组。以1.5 μg/h输注ALD造模，用EPL（100 mg·kg-1·d-1）、CCB（10 mg·kg-1·d-1） 和ARB（3 mg·kg-1·d-1）分别灌胃治疗。检测28 d内血压及尿白蛋白排泄率（UAER）。于28 d处死动物，检测血浆ALD、AngⅡ、血钾、钠、Scr；观察肾脏光镜和电镜病理改变；TUNEL法检测细胞凋亡；免疫组化和RT-PCR法检测nephrin表达。 结果 （1）与CTL组相比，ALD组大鼠7 d时血压开始升高，28 d达高峰（P < 0.01）；EPL组血压和UAER均显著低于同时间点ALD组（P < 0.01）；CCB组UAER显著高于同时间点EPL组，但与ALD组差异无统计学意义。（2）ARB组血浆AngⅡ水平显著高于ALD组、CCB组和EPL组（P < 0.01）。（3）ALD组肾小球出现系膜细胞增殖、系膜外基质增多、足突融合和微绒毛化等病理改变。EPL组肾小球损伤评分和凋亡率显著低于ALD组、CCB组和ARB组（分别P < 0.05，P < 0.01）。（4）ALD组nephrin mRNA和蛋白表达均高于CTL组，EPL组nephrin蛋白和mRNA表达低于ALD组（P < 0.01）。 结论 ALD输注可诱导肾小球足细胞损伤。CCB和ARB能显著降低血压，但不能减轻ALD所致损伤。EPL可通过非血流动力学作用部分阻断ALD的损伤效应。     

nephrin通过PI3K-Akt途径抑制血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞凋亡

目的 研究nephrin在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导足细胞凋亡中的作用,以及可能的分子机制。 方法 体外培养永生化小鼠足细胞（MPC）,以不同浓度AngⅡ处理MPC和10-8 mol/L AngⅡ刺激不同时间,用流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时定量PCR、免疫荧光和Western印迹法检测nephrin的表达和分布;Western印迹法检测Akt磷酸化水平。脂质体法转染pcDNA3.1-mNPHS1质粒,G418筛选稳定转染细胞系。用Akt抑制剂LY294002或与AngⅡ共孵育刺激MPC和pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞,检测Akt磷酸化水平和细胞凋亡率。 结果 （1）AngⅡ以剂量和时间依赖方式诱导MPC凋亡。AngⅡ受体拮抗药氯沙坦与AngⅡ共孵育18 h,显著降低AngⅡ单独刺激的足细胞凋亡率（P < 0.05）。（2）10-8 mol/L AngⅡ刺激12 h后,nephrin mRNA和蛋白较对照组显著降低,24 h nephrin mRNA约为正常对照的50%（P < 0.05）。正常足细胞nephrin主要分布于核膜周围的胞质和细胞膜,随刺激时间延长,胞膜和胞质nephrin表达逐渐降低。（3）10-8 mol/L AngⅡ刺激15 min后,Akt磷酸化显著降低,约为正常对照细胞的50%（P < 0.01）。（4）AngⅡ与LY294002共孵育12 h后,细胞凋亡率显著高于AngⅡ和LY294002单独刺激（均P < 0.05）。（5）pcDNA3.1-mNPHS1稳定转染显著上调足细胞Akt磷酸化水平（P < 0.05）,抑制 AngⅡ诱导的细胞凋亡（P < 0.05）。 结论 AngⅡ通过AngⅡ受体诱导小鼠足细胞凋亡,抑制足细胞nephrin表达。nephrin通过PI3K-Akt信号通路调节足细胞存活状态。     

IgA肾病患者血清IgA1与系膜细胞共培养上清诱导足细胞凋亡

目的 探讨IgA肾病(IgAN)患者血清IgA1与系膜细胞共培养上清对足细胞凋亡的影响。 方法 用Jacalin 亲和层析柱和Sephacryl S-200 分子筛纯化蛋白。单体IgA1（mIgA1）热聚合为聚合体IgA1（aIgA1）。实验分为患者上清组、健康上清组和对照组，系膜细胞分别与IgAN患者的aIgA1、健康对照的aIgA1和5%胎牛血清共培养，收集上清，与同步化的足细胞作用。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实时定量PCR 检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas和Fas-L表达情况。 结果 患者上清可诱导足细胞凋亡，其凋亡率显著高于健康上清组和对照组[（28.5±5.9）%比（22.5±5.8）%、（20.5±4.5）%， 均P < 0.05]。患者上清可诱导足细胞Fas mRNA 升高，为对照组的1.89倍（P < 0.05）， 而Bcl-2 mRNA下调为对照组的72%（P < 0.05）。患者上清组的AngⅡ和TGF-β1水平均高于健康上清组[（13.2±3.4） ng/L比（8.2±2.3） ng/L，P < 0.05；（15.4±3.4） ng/L比（10.8±3.2） ng/L，P < 0.05]。 结论 IgAN患者血清IgA1与系膜细胞共培养上清可诱导足细胞凋亡，可能参与IgAN的进展。     

活性氧与心肌缺血/再灌注损伤诱发的细胞凋亡

细胞凋亡是心肌缺血/再灌注损伤的病理特征之一,而且是损伤早期的主要死亡方式,对心肌缺血/再灌注损伤 及其转归具重要意义。活性氧学说是心肌缺血/再灌注性细胞凋亡的机制之一,本文综述了其信号转导途径及Bcl-2相关蛋白 家族,热休克蛋白对该途径的调控。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对高糖环境下体外小鼠足细胞活性氧的影响

目的　观察不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对高糖造成氧化应激状态下体外小鼠足细胞损害的作用并探讨其机制。 方法　以高糖（25 mmol/L）培养的小鼠足细胞为研究对象,维生素E培养为对照。首先以MTT法检测细胞活力,再在激光共聚焦显微镜下以CM-H2DCFDA荧光探针观察不同浓度EGCG（0.2、10、100 μmol/L）刺激足细胞6、12、24 h后活性氧（ROS）生成,并以流式细胞仪定量分析ROS平均荧光强度。RT-PCR法检测足细胞内ROS产生的主要通路NADPH氧化酶各亚基mRNA（ph22phox、p47phox、p67phox）的表达。 结果　高糖刺激下6 h,足细胞ROS生成显著增加（P < 0.01）。正常糖组和甘露醇组培养12 h ROS生成无显著增加（P > 0.05）。EGCG 0.2 μmol/L作用6 h可显著降低高糖环境下体外小鼠足细胞ROS水平（P < 0.01）。与高糖组比较,EGCG（100 μmol/L）显著减少NADPH氧化酶亚基p22phox和p67phox mRNA表达（均P < 0.05）。与维生素Ｅ组比较,EGCG（0.2 μmol/L）和维生素E（0.2 mmol/L）协同作用组显著减少p47phox mRNA表达（P < 0.05）。 结论　EGCG能缓解高糖环境下体外足细胞氧化应激状态,对高糖培养下足细胞有保护作用。     

Early autophagy activation inhibits podocytes from apoptosis induced by aldosterone

Objective To explore the protection of early autophagy activation on podocyte injury induced by aldosterone. Methods In vitro cultured mouse podocyte clones (MPC5) were treated with aldosterone for 6, 12, 24, 48 h respectively. Apoptosis of podocytes was detected by Annexin V combined with flow cytometry. After 24 h treatment with aldosterone, the existence of apoptotic body and autophagosome was observed by electron microscopy. The protein expressions of LC3, caspase?3 and nephrin were examined by Western blotting. The mRNA expression of Beclin?1 was detected by real?time PCR. Results The induction of apoptosis and autophagy by aldosterone in podocytes was in time?dependent mannner. After 24 h treatment with aldosterone, the apoptosis was increased by 26.5% (P＜0.05) and the expression of nephrin was decreased by 28.0% (P＜0.05) compared to control group. Aldosterone remarkably induced the expression of Beclin?1 at 6 h and promoted the transformation of LC3?Ⅰto LC3?Ⅱ at 12 h (P＜0.05). Compared to simple aldosterone treatment, the apoptosis rate of podocyte was increased by 39.0%（P＜0.05）and the expression of nephrin was declined by 19.5%（P＜0.05) after 3?methyladenine (3?MA) pre?treatment. Conclusions Aldosterone can induce autophagy and apoptosis in podocytes. Autophagy occurs earlier (12 h) than apoptosis (24 h). The occurrence of autophagy can inhibit the apoptosis,so the autophagy pathway may be a new research topic of glomerular disease treatment.     

手霉素通过反应性氧基诱导甲状腺未分化癌KAT-4细胞凋亡

目的研究手霉素对甲状腺未分化癌KAT-4细胞的作用,探讨其作用机制。方法使用人的甲状腺未分化癌KAT-4细胞,MTT细胞毒性测定评价手霉素对KAT-4细胞的作用,使用annexin v和一氧化氮(nitric oxide,NO)染料标记细胞,应用流式细胞仪术检测细胞内NO生成和细胞凋亡;细胞内超氧阴离子通过二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)测定;采用荧光法测定谷胱甘肽(glutathione,GSH)。结果手霉素降低KAT-4细胞活性,且呈剂量依赖性。手霉素诱导KAT-4细胞凋亡和反应性氧基(reactive oxygen species,ROS)产生包括NO和超氧阴离子增加和GSH降低。手霉素诱导细胞凋亡与ROS的增加有关,N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)可抑制ROS产生,保护KAT-4细胞逃避手霉素的细胞毒作用和避免手霉素诱导的凋亡。结论细胞内ROS的产生对手霉素的细胞毒作用起非常重要的作用。手霉素通过增加ROS产生诱导甲状腺癌细胞凋亡。     

ROS/GADD153蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨活性氧簇(ROS)/GADD153蛋白在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞凋亡中的作用.方法 体外培养乳鼠心肌细胞,随机分为9组(n=5),Ⅰ组(C组)常规心肌细胞培养,不予其他处理;Ⅱ组(AngⅡ6组)给予100 nmol/L AngⅡ,孵育6 h;Ⅲ组(AnsⅡ12组)给予100 nmol/L AngⅡ,孵育12 h;Ⅳ组(ArtsⅡ24组)给予100 nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;V组[N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)+AngⅡ组]预先给予抗氧化剂NAC 5 mmol/L,2 h后给予100 nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;Ⅵ组(NAC组)仅给予NAC 5 mmol/L,孵育24 h;Ⅶ组(anti-ODN组)GADD153反义寡核苷酸10 μmol/L转染24 h后,加入100nmoFL AngⅡ,孵育24 h;Ⅷ组(mis-ODN组)GADDl53错义寡核苷酸10 μmol/L转染24 h后,加入100nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;Ⅸ组(脂质体对照组)加入等容量转染试剂,孵育24 h.检测细胞活力、细胞内ROS产量、细胞凋亡率及GADD153蛋白表达水平.结果 与C组相比,AngⅡ6组、AngⅡ12组、AngⅡ24组细胞活力降低,细胞凋亡率、ROS产量及GADD153蛋白表达升高,且呈时间依赖性(P＜0.05);与AngⅡ24组比较,NAC+AngⅡ组和anti-ODN组细胞活力升高,细胞凋亡率、ROS产量及GADD153蛋白表达降低(P＜0.05).结论 AugⅡ通过增加ROS产量,诱导GADD153蛋白表达上调,从而导致心肌细胞凋亡的发生.     

脱氢抗坏血酸对高糖诱导系膜细胞产生氧自由基的影响

目的 探讨脱氢抗坏血酸(DHA)对高糖诱导系膜细胞产生氧自由基(ROS)的影响。 方法 (1)原代培养大鼠系膜细胞；(2)以Fe3+还原法检测细胞内抗坏血酸(AA)和DHA浓度，观察系膜细胞摄取AA和DHA的情况及葡萄糖、葡萄糖转运蛋白(GLUT)抑制剂细胞松弛素B对其的影响；(3)采用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内ROS，观察高糖诱导系膜细胞ROS产生的情况及不同浓度DHA对其的影响；(4)采用凝胶电泳迁移率法(EMSA)检测活性蛋白1(AP-1)和DNA的结合活性，观察DHA对高糖诱导的系膜细胞内AP-1 活性的影响。结果 (1)AA不能由细胞外进入系膜细胞，而DHA可以进入，并且随着细胞外葡萄糖浓度的增加，其进入速度减慢；细胞松弛素B则完全抑制了DHA进入到系膜细胞。(2)高糖快速诱导系膜细胞ROS产生增多；DHA抑制了高糖的这种作用，并且该抑制作用在≤4 mmol/L的浓度范围内呈浓度依赖性。(3)DHA抑制了高糖诱导的系膜细胞内AP-1 的激活。 结论 (1)系膜细胞是依赖DHA利用Vit C的细胞型；DHA进入该细胞依赖GLUT介导，高糖可抑制其进入细胞。(2)DHA可有效抑制高糖诱导的系膜细胞ROS产生增多，并在一定范围内呈浓度依赖性。(3)DHA在抑制ROS产生的同时，也显著抑制了高糖诱导的AP-1 的激活。     

脱氢抗坏血酸对高糖诱导肾小管上皮细胞产生氧自由基的影响

目的 探讨脱氢抗坏血酸(DHA)对高糖诱导肾小管上皮细胞产生氧自由基的影响&#65377;方法 (1)传代培养肾小管上皮细胞;(2)以Fe3+还原法检测细胞内抗坏血酸(AA)浓度,观察肾小管上皮细胞摄取AA和DHA的情况及葡萄糖和葡萄糖转运蛋白(GLUT)抑制剂细胞松弛素B(cytochalasin B)对其影响;(3)激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内氧自由基,观察高糖诱导肾小管上皮细胞氧自由基产生的情况及不同浓度DHA对其影响&#65377;结果 (1)AA不能由细胞外进入肾小管上皮细胞,而DHA可以进入,并且随着细胞外葡萄糖浓度的增加,其进入速度减慢&#65377;细胞松弛素B则完全抑制了DHA进入到肾小管上皮细胞, 而固定葡萄糖浓度(25 mmol/L)时,随着DHA浓度的增加,DHA进入细胞内的速度逐渐增快&#65377;(2)高糖快速诱导了肾小管上皮细胞氧自由基产生增多,DHA抑制了高糖的这种作用,并且该抑制作用在浓度小于&#65380;等于4 mmol/L的范围内呈浓度依赖性&#65377;结论 (1)肾小管上皮细胞是依赖DHA利用VitC的细胞型,DHA进入该细胞依赖GLUT介导,高糖可抑制其进入细胞;(2)DHA可有效抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞氧自由基产生增多,并在一定范围内呈浓度依赖性&#65377;     

异丙酚对乳鼠心肌细胞氧化损伤时线粒体功能的影响

目的 评价异丙酚对乳鼠心肌细胞氧化损伤时线粒体功能的影响.方法 SD乳鼠20只,分离乳鼠心肌细胞,接种于96孔培养板原代培养48 h,随机分为5组,每组32孔,对照组(C组):继续培养4 h;氧化损伤组(OI组):加入叔丁基过氧化氢,终浓度为100 μmol/L,孵育4 h;异丙酚1 μmol/L组、10 μmol/L组和30 μmol/L组(P1-3组):加入叔丁基过氧化氢,终浓度为100 μmol/L,同时加入异丙酚,终浓度分别为1、10、30,μmol/L,孵育4 h.于细胞培养或孵育4 h时,测定上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性,细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物岐化酶(SOD)活性、心肌细胞线粒体活力、线粒体膜电位和心肌细胞凋亡率.结果 与C组比较,其余4组上清液LDH活性、心肌细胞MDA含量、凋亡率升高,心肌细胞线粒体活力、膜电位降低、心肌细胞GSH含量、SOD活性降低(P<0.05);与OI组比较,P2,3组上清液LDH活性、心肌细胞MDA含量、凋亡率降低,心肌细胞线粒体活力、膜电位升高,P3组心肌细胞GSH含量、SOD活性升高(P<0.05),P1组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);P2组与P3组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚减轻心肌细胞氧化损伤的机制与改善线粒体功能、抑制细胞凋亡有关.     

Preliminary study on overproduction of reactive oxygen species by neutrophils in diabetes mellitus

AIM:To assess the amount and pattern of reactive oxygen species(ROS)production in diabetic patientderived neutrophils.METHODS:Blood samples from type 2 diabetes mellitus(DM)patients and volunteers(controls)were subjected to neutrophil isolation and the assessment of neutrophil oxidative burst using chemiluminescence assay.Neutrophils were activated by using phorbol myristate acetate(PMA)and neutrophils without activation were kept as a negative control.The chemilu-minescence readings were obtained by transferring cell suspension into a 1.5 m L Eppendorf tube,with PMA and luminol.Reaction mixtures were gently vortexed and placed inside luminometer for a duration of 5 min.RESULTS:Our results showed that in the resting condition,the secretion of ROS in normal non-diabetic individuals was relatively low compared to diabetic patients.However,the time scale observation revealed that the secreted ROS declined accordingly with time in non-diabetic individuals,yet such a reduction was not detected in diabetic patients where at all the time points,the secretion of ROS was maintained at similar magnitudes.This preliminary study demonstrated that ROS production was significantly higher in patients with DM compared to non-diabetic subjects in both resting and activated conditions.CONCLUSION:The respiratory burst activity of neutrophils could be affected by DM and the elevation of ROS production might be an aggravating factor in diabetic-related complications.     

醛固酮通过线粒体源性氧化应激促进表皮生长因子受体活化及肾小球系膜细胞增殖

目的 研究活性氧（ROS）在醛固酮（ALDO）诱导的表皮生长因子受体（EGFR）信号通路活化及系膜细胞增殖中的作用并探讨ROS的来源。 方法 体外培养人肾小球系膜细胞,应用3H-胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法和细胞计数测定系膜细胞增殖;荧光探针2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸（DCFDA）检测细胞内ROS 的产生;Western印迹法检测EGFR活化。 结果 ALDO可显著促进肾小球系膜细胞增殖,应用100 nmol/L ALDO刺激系膜细胞24 h后,3H-TdR掺入量及细胞数分别是基础状态下的2.63倍和2.15倍。盐皮质激素受体（MR）阻断剂依普利酮（EPLE）几乎完全阻断ALDO诱导的系膜细胞增殖（P < 0.01）,而糖皮质激素受体（GR）阻断剂RU-486对ALDO诱导的细胞增殖无显著抑制作用。ALDO明显促进肾小球系膜细胞ROS产生,100 nmol/L ALDO刺激60 min,系膜细胞内ROS释放是对照组的2.14倍,EPLE显著抑制ALDO诱导的系膜细胞ROS产生（P < 0.01）。线粒体复合体 I抑制剂鱼藤酮（ROT）几乎完全阻断ALDO诱导的ROS产生（P < 0.01）,NADPH 氧化酶抑制剂夹竹桃麻素（apocynin）和二联苯碘（DPI）对ALDO诱导ROS产生的抑制率为30%~35%（P < 0.05）,而黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇、环氧化酶抑制剂吲哚美辛、脂氧化酶抑制剂去甲二氢化愈创木酸、细胞色素P450氧化酶抑制剂酮康唑以及一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯对ALDO诱导的ROS产生均无明显影响。乙酰半胱氨酸（NAC）和ROT对ALDO诱导系膜细胞增殖的抑制率为75%~80%,apocynin和DPI的抑制作用仅为25%~30%。ALDO可显著活化系膜细胞EGFR,ALDO刺激60 min,EGFR活性是对照组的4.95倍,EPLE和NAC几乎完全阻断ALDO诱导的EGFR磷酸化（P < 0.01）,而NAC和EGFR拮抗剂AG1478则阻断ALDO诱导的系膜细胞增殖（P < 0.01）。 结论 ALDO通过氧化应激依赖的EGFR磷酸化促进肾小球系膜细胞增殖,ALDO诱导的系膜细胞氧化应激主要来源于线粒体。