靶向胰腺癌PANC-1细胞整合素连接激酶基因RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的:构建整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组质粒并检测其对胰腺癌PANC-1细胞ILK基因表达的干扰效率,为进一步研究胰腺癌中ILK基因功能奠定实验基础和理论依据.方法:设计并构建3条含有针对ILK基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列的重组质粒并进行DNA测序.通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418压力筛选至得到稳定转染细胞克隆,利用Real-Time PCR和Western blot检测ILK基因的表达抑制情况.筛选出干扰效率最高的重组质粒.结果:经DNA测序证实胰腺癌PANC-1细胞ILK基因的R NA干扰重组质粒构建成功;重组质粒稳定转染Panc-1细胞后(各组转染效率均>90%),各实验组ILK基因表达均被有效地抑制,其中重组质粒-2的干扰效率最高,其mRNA及ILK表达显著下调,其抑制率分别为93.01%和65.69%;ILK mRNA表达较阴性对照组、空质粒组表达量显著下降(0.090±0.009vs 1.147±0.110,1.005±0.121,P<0.01).结论:成功构建ILK基因RNA干扰重组质粒,重组质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞ILK基因表达.为进一步研究ILK在胰腺癌中的基因功能奠定基础.     

siRNA沉默Bmi-1基因对人肝癌细胞株MHCC97-H侵袭迁移能力的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默Bmi-1基因表达后,对人肝癌细胞株MHCC97-H侵袭迁移能力的影响.方法:设计并合成针对Bmi-1基因序列特异性的双链小干扰RNA(Bmi-1-siRNA),转染高转移性人肝癌细胞株MHCC97-H,用流式细胞仪观察转染效率,荧光实时定量PCR和Westernblot检测Bmi-1基因的mRNA和蛋白表达水平;通过体外Transwell小室基质侵袭和迁移实验,观察Bmi-1表达沉默后对人肝癌细胞株MHCC97-H侵袭和迁移能力的影响.结果:将针对Bmi-1基因序列特异性的小干扰RNA(Bmi-1-siRNA)转染高转移性人肝癌细胞株MHCC97-H后,流式细胞仪显示,转染效率可达到91%.与空白组、对照siRNA组相比,实验组Bmi-1-siRNA能有效抑制MHCC97-H细胞中Bmi-1基因的mRNA(F=56.199,P<0.05)和蛋白表达水平.通过Transwell小室基质侵袭和迁移实验,我们分析了不同组细胞的侵袭迁移能力.结果发现,与空白组、对照siRNA组相比,Bmi-1-siRNA转染的MHCC97-H细胞穿透能力明显降低(F=186.66,12.746,P<0....     

siRNA抑制PTTG表达对人结肠癌LoVo细胞生物学活性的影响

目的 探讨PTTG干扰质粒对人结肠癌LoVo细胞黏附、侵袭及迁移能力的影响.方法 分别采用MTT和Transwell小室研究转染PTTG-siRNA对结肠癌细胞LoVo黏附、侵袭及迁移的作用.结果 特异性siRNA干扰PTTG表达后,LoVo细胞黏附百分率显著低于正常对照组(P＜0.01),穿透Transwell小室的细胞百分率显著低于正常对照组,细胞迁移百分率低于正常对照组.结论 特异性siRNA干扰PPTTG表达后,LoVo细胞黏附、侵袭及迁移能力受到抑制.     

ILK-siRNA抑制衰老大鼠系膜细胞纤维连接蛋白积聚的研究

目的观察整合素连接激酶（integrin linked kinase,ILK）小干扰RNA（small interference,siRNA）对衰老大鼠系膜细胞细胞外基质纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的影响,探讨ILK在衰老肾脏肾小球硬化中的作用.方法分离培养3月龄和24月龄雄性Wistar大鼠原代肾小球系膜细胞（mesangial cells,MCs）,脂质体转染抑制ILK表达的siRNA或无关siRNA（con siRNA）.利用RT-PCR、Western blot和免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测ILK和FN的表达情况.结果ILK-siRNA转染可抑制3月龄和24月龄大鼠系膜细胞ILK和FN的表达水平（P＜0.05）;对24月龄大鼠系膜细胞的抑制程度更显著（P＜0.05）,几乎使ILK和FN下降到正常青年大鼠系膜细胞的水平.结论通过RNAi技术抑制ILK的表达,可减轻衰老大鼠系膜细胞FN的积聚,为肾脏器官衰老的防治提供新的干预靶点.     

小干扰RNA抑制MDM2对HepG2细胞的影响及机制

目的探讨小干扰RNA对HepG2细胞泛素蛋白链接酶(MDM2)基因表达的干扰效应和增殖影响的分子机制。方法建立装载靶向MDM2基因小干扰RNA(siRNA)的表达载体;用脂质体法将此表达载体转染HepG2细胞株,以转染阴性对照质粒组作对照;采用RT-PCR检测MDM2,p53,Bcl2和p21基因的表达;MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,划痕实验检测细胞迁移能力的改变。结果转染siRNA MDM2后的HepG2细胞MDM2和Bcl2基因表达明显减低,而p53和p21基因表达被明显增强,与空白组比差异具有显著性。siRNA MDM2明显抑制了HepG2的增殖并诱导其凋亡,同时使细胞迁移能力明显下降。但转染阴性对照质粒组未出现基因的表达变化和增殖抑制及凋亡。结论 siRNA MDM2可明显抑制HepG2增殖诱导其凋亡,并减弱肿瘤细胞迁移力。可能与抑制MDM2,增强p53表达,从而影响细胞周期和凋亡相关的基因表达变化有关。     

干预Bcl-2基因表达对骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力的影响

目的探究干扰B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2基因表达对骨肉瘤细胞侵袭、迁移的影响及可能的作用机制。方法采用siRNA特异性下调Bcl-2基因表达,实验分为空白组、MG-63-NC组(转染siRNA-NC)和MG-63-siRNA组(转染siRNA-Bcl-2)。Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力,Western印迹检测细胞中Bcl-2、β-连环蛋白(catenin)、c-Myc蛋白的表达量。结果 MG-63-siRNA组Bcl-2蛋白表达量显著低于空白组(P0.05);MG-63-siRNA组细胞侵袭、迁移能力显著抑制(P0.05);与空白组相比,MG-63-siRNA组细胞中β-catenin、c-Myc蛋白表达显著下调(P0.05)。结论干扰Bcl-2抑制骨肉瘤MG-63细胞的迁移和侵袭,可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路介导的下游靶蛋白c-Myc的表达。     

沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用

目的 探讨RNA干涉技术(RNAi)沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的影响,阐明GRP78基因沉默对SKOV3细胞侵袭力抑制作用的生物学机制.方法 设计并构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3细胞.RT-PCR和Western印迹法检测GRP78基因表达;RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测细胞迁移率.结果 RT-PCR及Western印迹检测转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞GRP78基因表达抑制;RT-PCR结果显示与对照组相比转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞穿透细胞数(P＜0.05)和迁移率均明显降低(P＜0.05).结论 ①转染GRP78 siRNA重组质粒有效抑制SKOV3细胞GRP78基因表达;②抑制GRP78基因表达能降低SKOV3细胞的侵袭力和迁移力,有望为抑制卵巢癌转移基因治疗提供新的靶点.     

干扰ECT2基因表达对结直肠癌SW620细胞侵袭和迁移的影响及机制研究

目的探讨转染小干扰RNA(siRNA)干扰上皮细胞转化序列2(ECT2)基因的表达对人结直肠癌SW620细胞侵袭和迁移的影响及机制。方法采用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂将ECT2特异性siRNA或非特异性siRNA转染至SW620细胞,分别记为si-ECT2组和si-NC组,将未行转染的SW620细胞记为Control组。采用实时荧光定量PCR法(real-time qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)分别检测各组SW620细胞中ECT2的mRNA和蛋白表达水平,采用Transwell侵袭实验检测各组SW620细胞的侵袭能力,采用划痕愈合实验检测各组SW620细胞的迁移能力,采用Western blotting法检测各组SW620细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达水平。结果与si-NC组相比,si-ECT2组SW620细胞中ECT2的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,穿膜细胞数量明显减少,划痕愈合率明显降低,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(P均0.05)。Control组的上述各项指标与si-NC组之间的差异均无统计学意义(P均0.05)。结论干扰ECT2基因的表达能够抑制结直肠癌SW620细胞的侵袭和迁移能力,其作用机制可能与下调MMP-2和MMP-9蛋白表达有关。     

Six1对甲状腺癌细胞侵袭迁移的影响

目的探讨Six1对甲状腺癌细胞侵袭迁移的影响。方法甲状腺癌BCPAP细胞转染Six1小干扰RNA(Six1 siRNA)和小干扰RNA阴性对照(siRNA control),采用细胞划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室检测细胞侵袭,Western印迹检测Six1、神经钙黏素(N-cadherin)、上皮钙黏附素(E-cadherin)蛋白表达。结果转染siRNA control后的BCPAP细胞迁移率、侵袭细胞数目及细胞中Six1、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达水平与没有转染的BCPAP细胞相比无变化。转染Six1 siRNA后的BCPAP细胞迁移率、侵袭细胞数目及细胞中Six1、N-cadherin蛋白表达水平与没有转染的BCPAP细胞相比明显降低,而E-cadherin蛋白水平明显升高。结论敲低Six1可能通过影响E-cadherin、N-cadherin表达抑制甲状腺癌细胞侵袭迁移。     

干扰Wnt1基因表达对乳腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响

目的探讨干扰Wnt1基因表达对乳腺癌细胞侵袭、迁移的影响及可能的作用机制。方法采用RNA干扰技术下调Wnt1基因表达,实验分为对照组(未做处理的细胞)、shRNA NC组(转染siRNA-NC)、shRNA Wnt1组(转染siRNA-Wnt1)。细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,Transwell法检测细胞的侵袭能力,免疫印迹实验(Western印迹)观察细胞中Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素(cyclin)-D1蛋白的表达量。结果转染siRNA-Wnt1到MCF-7细胞后,Wnt1蛋白的表达量受到显著抑制(P0.05);细胞的侵袭、迁移能力受到显著抑制(P0.05);β-catenin、cyclin-D1蛋白的表达下调(P0.05)。结论干扰Wnt1基因表达可以抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭,其机制可能与Wnt1/β-catenin信号通路及其下游靶基因cyclin-D1蛋白表达下调有关。     

整合素连接激酶经磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路促进胃癌细胞增殖和迁移

目的探讨整合素连接激酶(ILK)对胃癌细胞增殖、侵袭的影响及相关机制。方法利用基因转染建立过表达ILK基因的HGC-27及KATOⅢ胃癌细胞株;细胞计数试剂(CCK)8和Transwell实验研究上调ILK基因表达对HGC-27及KATOⅢ细胞增殖和迁移能力的作用;Western印迹实验检测上调ILK基因表达是否可影响HGC-27及KATOⅢ细胞Akt及p-Akt蛋白的表达。结果上调ILK基因表达可显著促进HGC-27及KATOⅢ细胞的增殖和迁移能力;上调ILK基因表达可明显上调HGC-27及KATOⅢ细胞p-Akt蛋白水平。结论 ILK经磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路参与及影响胃癌细胞的致癌潜能。     

MACC1在卵巢癌组织中表达及对卵巢癌细胞生物学特性的影响

目的探讨结肠癌转移相关基因(MACC)1在卵巢癌组织中的表达及对卵巢癌细胞生物学特性的影响。方法收集卵巢癌组织及对应的癌旁组织,Western印迹检测组织中MACC1表达水平。以卵巢癌细胞A2780为研究对象,细胞转染MACC1小干扰RNA(MACC1 siRNA)、siRNA对照(siRNA control),细胞分为未转染组(只加入转染试剂)、siRNA control组(转染siRNA control)、MACC1 siRNA组(转染MACC1 siRNA)。培养24 h后,Western印迹检测细胞中MACC1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力。结果卵巢癌组织中MACC1表达水平高于癌旁组织。siRNA control组细胞中MACC1、MMP-2、MMP-9表达水平及细胞存活率、迁移率、侵袭细胞数目与未转染组相比均没有差异,MACC1 siRNA组细胞中MACC1、MMP-2、MMP-9表达水平及细胞存活率、迁移率、侵袭细胞数目均明显低于未转染组。结论 MACC1在卵巢癌组织中过度表达。干扰MACC1能够抑制卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力,作用机制可能与抑制MMP-2、MMP-9表达有关。     

IL-6对肝癌细胞HepG2浸润迁移能力的影响

目的观察肝癌细胞系HepG2自身分泌的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对其浸润迁移能力的影响。方法 RNA干扰技术沉默IL-6,同时设空白对照组(不加转染试剂)、正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)、实验对照组(转染沉默IL-6的siRNA)。进行细胞划痕损伤实验检测细胞的迁移能力。结果 RT-PCR检测各组IL-6 mRNA的表达分别为100±7.87、303±19.95、160±10.95、23±7.02;IL-6在沉默组细胞的浸润迁移能力受到抑制,正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)细胞的浸润迁移能力增强。结论 IL-6被沉默能抑制肝癌细胞系HepG2的迁移,肝癌细胞系HepG2IL-6表达增高能促进其自身发生迁移。     

RNA干扰基质金属蛋白酶-9对骨肉瘤MG-63细胞侵袭、迁移的影响

目的探讨RNA干扰基质金属蛋白酶(MMP)-9基因对人骨肉瘤MG-63细胞体外侵袭和迁移能力的影响。方法通过慢病毒载体介导shRNA-MMP-9转染MG-63细胞,实验分为:转染组(转染shRNA-MMP-9序列)、对照组(转染shRNA-MMP-9-NC序列)、空白组(磷酸盐缓冲液);RT-PCR检测各组MMP-9和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;Western印迹检测各组MMP-9和VEGF蛋白的表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力;细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。结果转染组MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达量显著低对照组和空白组(P0.05);转染组穿膜细胞数[(56.37±3.29)个/视野]显著低于对照组和空白组[(92.06±3.56)个/视野、(93.05±1.52)个/视野](P0.05);转染组划痕愈合率(23.63%±1.47%)显著低于对照组和空白组(57.17%±3.86%、58.13%±2.35%)(P0.05)。结论 RNA干扰沉默骨肉瘤MG-63细胞的MMP-9基因表达,通过作用于VEGF靶基因,抑制其细胞侵袭及迁移能力。     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

ABCE1基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨ATP结合盒转运FE1ABCE1基因对细胞的生长、细胞周期及肿瘤迁移等方面的作用。方法设计及合成ABCE1的siRNA序列,Lipofectamine TM2000转染SMMC-7721细胞。通过RT-PCR、Western印迹检测ABCE1在干扰后的mRNA和蛋白的表达情况,通过流式细胞仪检测细胞周期。通过CCK-8增殖实验、划痕愈合实验、细胞侵袭实验评价沉默ABCE1基因对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响。结果 ABCE1 mRNA和蛋白表达,实验组较对照组和空白组显著降低(P<0.05)。实验组细胞的生长速度明显减慢,细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少(P<0.05)。CCK-8增殖实验显示,与对照组和空白组相比,实验组MMC-7721细胞的增殖受到明显抑制(P<0.05)。划痕愈合实验显示,实验组迁移能力显著下降(P<0.05)。Transwell小室法示,实验组MMC-7721细胞的侵袭能力显著下降(P<0.05)。结论特异性干扰ABCE1基因表达可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的迁移能力,并抑制肿瘤细胞增殖,因此,ABCE1的siRNA序列可能成为治疗肝癌的有效靶点。     

LOX基因对人绒癌Bewo细胞侵袭转移的影响及意义

目的探讨采用赖氨酰氧化酶(LOX)小干扰RNA(siRNA)敲低LOX基因表达对人绒癌Bewo细胞侵袭转移的影响。方法将LOX基因的siRNA转染至人绒癌Bewo细胞株,细胞分对照组、阴性对照组、siRNA组,利用实时定量PCR、Western印迹方法检测,确定siRNA沉默效率(LOX mRNA、蛋白表达)、上皮间质转化(EMT)相关蛋白神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-7表达情况,Transwell检测细胞迁移能力的改变。结果对照组N-cadherin,MMP-2及MMP-7表达显著高于siRNA组(P<0.05)。结论沉默LOX基因能抑制绒癌Bewo细胞上皮间质转化,有效抑制人绒癌细胞转移和侵袭。敲低LOX基因可能是人绒毛膜癌基因治疗靶点。     

抑制干扰素诱导蛋白16表达对人脑血管外膜成纤维细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的探讨抑制干扰素诱导蛋白16(IFI16)表达后对人脑血管外膜成纤维细胞(HBVAF)增殖、凋亡与迁移的影响及其可能机制。方法培养HBVAF分3组,未经处理的HBVAF作为空白对照组,转染非特异性小干扰RNA(siRNA)的HBVAF作为阴性对照组,转染IFI16siRNA的HBVAF作为IFI16siRNA组。应用蛋白免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定细胞中IFI16、p53、p21蛋白和mRNA表达水平。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,Transwell法测定细胞迁移情况。结果与阴性对照组比较,转染IFI16siRNA后,HBVAF中IFI16、p53及p21蛋白和mRNA表达水平下调,IFI16siRNA组MTT吸光度值增高(0.70±0.01比0.65±0.01,P0.05),IFI16siRNA组、阴性对照组与空白对照组之间在细胞迁移数目与凋亡比例上差异无统计学意义。结论抑制IFI16表达可促进HBVAF增殖,其机制可能部分与抑制p53及p21表达有关。     

siRNA沉默Annexin-1基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响

目的观察RNA干扰技术沉默Annexin-1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响。方法针对Annexin-1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞,转染后应用半定量RT-PCR和Western印迹法检测Annexin-1mRNA和蛋白的改变,透射电镜观察细胞凋亡情况,用MTT法检测沉默Annexin-1表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响。结果转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin-1mRNA和蛋白水平显著下降(P0.05),转染siRNA沉默Annexin-1基因表达后膀胱癌T24细胞出现典型凋亡细胞,增殖能力显著下降(P0.05)。结论 RNA干扰Annexin-1基因后其mRNA和蛋白水平显著下降,诱导了膀胱癌T24细胞凋亡,并且抑制细胞的增殖。     

整合素连接激酶在重组结缔组织生长因子诱导大鼠肝星状细胞表型转化中的作用

目的研究整合素连接激酶(ILK)在重组结缔组织生长因子(rCTGF)诱导大鼠原代肝星状细胞(HSC)表型转化中的作用。方法应用胶原酶原位灌注+密度梯度离心法分离SD大鼠原代HSC,细胞贴壁培养24 h后以rCTGF处理,24 h后转染ILK小干扰RNA(siRNA)或对照siRNA,设rCTGF对照及空白对照。应用RT-PCR及Western Blot检测转染siRNA 24、48及72 h时HSCα平滑肌肌动蛋白(αSMA)、ILK及I型胶原基因表达水平变化。计量资料采用t检验。结果与空白对照相比,rCTGF处理可显著上调大鼠HSCαSMA、ILK蛋白及I型胶原mRNA表达。转染ILK siRNA可特异性抑制rCTGF诱导的ILK表达上调,与rCTGF对照相比,转染ILK siRNA 24、48及72 h时,HSC ILK蛋白表达分别下调72%±6%(t=21.39,P0.01)、87%±9%(t=68.25,P0.01)及47%±3%(t=18.25,P=0.003);αSMA蛋白及I型胶原mRNA表达分别下调5%±1%(t=2.52,P0.05)及6%±3%(t=1.63,P0.05)、31%±7%(t=34.77,P0.01)及20±5%(t=6.71,P0.05)和67%±8%(t=58.82,P0.01)及43%±6%(t=15.21,P0.01);转染对照siRNA时,HSC ILK、αSMA及I型胶原mRNA表达在相同时点无显著变化。结论 ILK可能部分介导了rCTGF诱导的大鼠HSC表型转化。