腹泻病人中志贺菌的耐药性和Ⅱ类整合子

目的:研究志贺菌的耐药表型、携带的耐药基因及整合子的流行现状。方法:对2008年-2009年从闵行区腹泻病患者大便标本分离的63株志贺菌,用KB法测定其对9种抗生素的药物敏感情况;PCR筛查整合子种类;长片段扩增Ⅱ类整合子可变区并测序。结果:63株志贺菌均表现出明显的多重耐药和交叉耐药现象,福氏志贺菌对复方新诺明、氨苄青霉素、四环素和萘啶酸的耐药率达90%以上。宋内氏志贺菌对复方新诺明和四环素的耐药率达85%以上。92.1%(58/63)的志贺菌中检出II类整合子,未检出I类整合子。58株II类整合子保守区阳性的标本,可变区扩增亦全部阳性,大小约3 kb～4 kb之间。测序结果显示耐药菌株含有编码对磺胺类抗生素耐药的基因dfrA1、对链丝菌素耐药的基因sat1和对氨基糖甙类抗生素耐药的基因aadA1。结论:多重耐药和交叉耐药在志贺菌中广泛存在;耐药志贺菌携带II类整合子,II类整合子与耐药表型之间存在一定关联。     

志贺菌临床分离株耐多药与调控基因突变关系

目的 研究志贺菌的耐多药性及其耐多药调控基因acrR、marOR的变异性.方法 对56株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、诺氟沙星等5种药物的药敏试验,对其acrR、marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,TaqI限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析.结果 筛选出35株耐多药株与11株敏感野生株.56株临床分离的志贺菌属细菌的耐多药率为62.5%;35株耐多药株与11株敏感野生株均扩增出acrR、marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析发现,acrR基因突变率为6.52%,marOR基因突变率为10.87%,11株敏感野生株均未检出以上2种基因突变.结论 志贺菌耐多药率较高,acrR、marOR基因突变可能是其耐多药的调控机制之一.     

志贺菌耐多药相关基因水平转移研究

目的 验证志贺菌耐多药相关基因水平转移及对该基因的位置进行初步判定。方法 培养已筛选出的包含耐多药差异基因片段阳性克隆,提取其质粒,PCR扩增其耐多药差异基因片段、纯化、制备探针,与志贺菌敏感株Z23、耐多药大肠埃希菌E.667、转移株的基因组DNA、质粒进行斑点杂交。结果 该耐多药差异基因片段制备的探针与耐多药大肠埃希菌、敏感株、转移株的基因组DNA、质粒进行杂交后,转移株、耐多药大肠埃希菌的全基因组及质粒均有杂交信号,与Z23的全基因组、质粒均没有杂交信号。结论 此耐多药相关基因片段在液体结合实验中由耐多药大肠埃希菌水平转移给志贺菌敏感株,根据斑点杂交结果可判断其存在于耐多药大肠埃希菌和转移株的质粒中。     

志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析

目的对志贺菌敏感株与诱导耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较，寻找细菌耐多药相关蛋白。方法采用4类抗生素的次抑菌浓度，对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验；对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳；电泳图谱采用ImageMaster2DPlatinum软件分析；差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MOLDITOF-TOF质谱）分析。结果成功获得志贺菌诱导耐多药株，在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出（946±37）个和（1096±189）个蛋白质斑点；共发现48个差异表达的蛋白点，其中5个质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白；其中前3个蛋白中在耐多药株中表达量增强，后2个减弱。结论5个耐多药相关蛋白中在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调；ABC转运蛋白在志贺菌诱导耐多药机制中起重要作用。     

志贺菌诱导耐多药相关基因抑制性消减杂交法筛选

目的应用抑制性消减杂交技术研究志贺菌诱导耐多药株与其敏感株之间差异基因,筛选耐多药相关基因,探讨基因表达差异与志贺菌诱导耐多药的相关性。方法以志贺菌诱导耐多药株DNA为检测子(tester),以其敏感株DNA为驱赶子(driver),构建DNA消减文库,采用PCR鉴定及斑点杂交进行筛选,并随机挑取阳性克隆测序,所得结果在GenBank中做同源性比较分析。结果成功构建了志贺菌诱导耐多药株的特异性DNA消减杂交文库;选取部分阳性克隆进行杂交筛选,获得12个诱导耐多药差异片段,对其中6个基因片段经克隆测序并与GenBank数据库进行初步比对,3个未知基因可能为新基因,3个已知基因分别为16S rRNA 核糖体基因、预测的rep蛋白质(解螺旋酶)、位点特异性Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(Hsds)等相关基因。结论志贺菌耐多药是多基因参与的复杂过程,筛选的新基因片段为进一步克隆其全长基因进而研究其功能打下基础。     

Ⅰ、Ⅱ类整合子在变形菌属中的分布及耐药性研究

目的了解Ⅰ、Ⅱ类整合子在变形菌属中的分布及其耐药性,为临床合理选用抗菌药物提供参考依据。方法 125株变形菌属采用聚合酶链式反应扩增Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因,微量稀释法测定细菌对抗菌药物的药敏率。结果 125株变形菌属中检出携带Ⅰ类整合子46株占38.60%,检出携带Ⅱ类整合子32株占25.60%,同时携带Ⅰ、Ⅱ类整合子17株,阳性率为13.60%;携带Ⅰ类或Ⅱ类整合子或同时两种整合子的菌株对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林、环丙沙星、哌拉西林、头孢哌酮、头孢吡肟耐药率高于整合子阴性菌株,差异有统计学意义(P<0.05);携带有Ⅰ、Ⅱ类整合子的变形菌属对庆大霉素、环丙沙星、氨苄西林、哌拉西林、头孢哌酮的耐药率均>60.00%;125株变形菌属对哌拉西林/他唑巴坦、头孢西丁耐药率均<10.00%。结论临床分离的变形菌属中携带Ⅰ、Ⅱ类整合子的菌株比例较高,Ⅰ、Ⅱ类整合子与变形菌属的多药耐药具有相关性,临床上需合理应用抗菌药物,避免新耐药菌株的产生。     

温州地区志贺菌属耐药性及整合子相关性研究

目的研究温州地区志贺菌属整合子的携带情况,分析其与抗菌药物敏感性的关系,为预防和治疗志贺菌属感染提供依据。方法 2006年6月-2008年6月从温州地区不同医院腹泻患者粪便标本分离得到志贺菌属57株;用K-B法进行十种常用抗菌药物的敏感性检测,通过PCR检测Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因,以了解整合子携带情况,并进行测序分析。结果志贺菌属对萘啶酸、氨苄西林、哌拉西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率均>70.0%,多药耐药率高达84.2%;Ⅰ、Ⅱ类整合子检出率分别为64.9%和59.7%;Ⅰ类整合子阳性组志贺菌属对萘啶酸、氨苄西林、氯霉素的耐药率均明显高于Ⅰ类整合子阴性组(P<0.05);Ⅱ类整合子阳性组志贺菌属对氨苄西林、头孢噻肟、氯霉素和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率均明显高于Ⅱ类整合子阴性组(P<0.05)。结论志贺菌属整合子携带率较高,且整合子与其耐药相关,Ⅰ、Ⅱ类整合子的耐药相关有重叠性。     

志贺菌敏感株诱导耐药与marOR基因突变关系

目的 对志贺菌敏感株进行诱导使其耐多药,研究其诱导耐药前后marOR基因的差异.方法 用4类抗生素的次抑菌浓度对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验.对志贺菌敏感株及诱导耐多药株的marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,测序比较其诱导耐药前后marOR基因序列的差异.结果 成功获得志贺菌诱导耐多药株,命名为YD株;其最小抑菌浓度(MIC)分别为初始菌株的6～8倍;该诱导耐药株对庆大霉素、诺氟沙星、磺胺甲基异恶唑、头孢噻吩等均耐药;测序结果发现诱导耐药株marOR基因YD株有6个位点出现突变,其中5个为同义突变,1个为错义突变(1630位点A→G,赖氨酸→精氨酸).结论 marOR基因的突变可能是志贺菌诱导耐药的调控机制之一.     

铜绿假单胞菌整合子与其多药耐药的相关性分析

目的调查北京大学人民医院自血液中分离的铜绿假单胞菌整合子携带情况,并分析整合子与其多药耐药的相关性。方法收集2006~2008年自血液分离的铜绿假单胞菌42株,仪器法鉴定,K-B法测定其药敏情况,简并引物PCR法扩增整合子的整合酶基因,对阳性PCR产物采用HinfⅠ内切酶作限制片段多态性(RFLP)分析进行整合子分类。结果42株铜绿假单胞菌对20种抗菌药耐药率显示,有54.8%的菌株表现出对12种抗菌药物耐受,45.2%的铜绿假单胞菌检出Ⅰ类整合子,PCR-RFLP结果显示,均为Ⅰ类整合子,未检出Ⅱ、Ⅲ类整合子。结论Ⅰ类整合子广泛存在于血中分离的铜绿假单胞菌中;整合子检出率逐年上升;整合子与铜绿假单胞菌多药耐药具有相关性。     

肺炎克雷伯菌中Ⅰ类整合子与qacE△1-sul1基因的研究

目的 了解医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌Ⅰ类整合子和qacE△1-sul1耐消毒剂基因的携带情况.方法 收集临床住院患者分离出的产ESBLs肺炎克雷伯菌108株;采用K-B法测定抗菌药物的敏感性;聚合酶链反应(PCR)检测Ⅰ类整合子和qacE△1-sul1基因.结果 Ⅰ类整合子基因总检出率为53.70％,qacE△1 -sul1基因总检出率为63.89％;产ESBLs肺炎克雷伯株Ⅰ类整合子阳性株除对氨苄西林和哌拉西林的耐药率与Ⅰ类整合子阴性株差异无统计学意义以外,对其他抗菌药物的耐药率均明显高于整合子阴性株,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 医院产ESBLs肺炎克雷伯菌Ⅰ类整合子和qacE△ 1-sulⅠ耐消毒剂基因携带率均较高,应进一步加强Ⅰ类整合子和耐消毒剂基因菌株的流行病学监测,并根据耐消毒剂状况,在消毒剂的使用上作出相应的调整.     

肠出血性大肠埃希菌1类整合子与耐药性关系

目的研究48株(国内28株，美国20株)肠出血性大肠埃希菌(EHEC)的耐药特点以及1类整合子的分布，探讨整合子中耐药基因盒的种类及与细菌耐药性的相互关系。方法琼脂稀释法对18种抗生素进行耐药性监测和分析；PCR法鉴定1类整合子阳性株；PCR产物测序及分析。结果48株肠出血性大肠埃希菌中23株为O157：H7；2个地域的肠出血性大肠埃希菌对抗生素的耐药情况大多无差别，只存在对氨苄西林和红霉素耐药率的差异，前者为国内分离株(60．7％)高于美国分离株(30％)，后者为美国分离株(95％)高于国内分离株(60.7％)。耐3种以上抗生素的肠出血性大肠埃希菌18株(美国3，中国15)。48株分离株中有11株(22．9％)鉴定出1类整合子，PCR产物测序分析可见，9株携带aadA1基因盒，2株携带aadA2基因盒，传递对氨基糖苷类抗生素的耐药性。结论1类整合子及其相关的基因盒广泛存在于肠出血性大肠埃希菌中，而且决定着对氨基糖苷类抗生素的耐药性。     

Ⅰ类整合子与铜绿假单胞菌多重耐药相关性研究

目的了解Ⅰ类整合子在临床分离的铜绿假单胞菌多重耐药株及敏感株中分布的差异,初步阐明Ⅰ类整合子是否与铜绿假单胞菌多重耐药性形成相关。方法应用聚合酶链反应（PCR）法分别检测临床分离的67株多重耐药铜绿假单胞菌和62株敏感株中Ⅰ类整合子的阳性率,并进一步用PCR证实Ⅰ类整合子阳性菌中整合子相关基因盒的存在。结果铜绿假单胞菌多重耐药株中,32株（47.76%）为Ⅰ类整合子阳性;敏感株中仅1株（1.61%）为Ⅰ类整合子阳性,多重耐药株的Ⅰ类整合子分布显著高于敏感株（χ2=36.02,P〈0.05）。PCR进一步证实多重耐药铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子基因盒,而敏感株携带空整合子。结论多重耐药铜绿假单胞菌具有较高的Ⅰ类整合子阳性率,Ⅰ类整合子可能与铜绿假单胞菌的多重耐药性相关。     

食品中变形杆菌第1类整合子鉴定和特征

目的探讨肉类食品中变形杆菌第1类整合子的分布、特征及所含基因盒的种类。方法常规方法分离变形杆菌；纸片扩散法对9种抗生素进行耐药性监测和分析；PCR鉴定1类整合子；阳性株PCR产物测序并对结果进行分析。结果91份标本中共鉴定出27株变形杆菌，有13株（48．1％）对至少4种以上抗生素表现多重耐药，耐药谱为复合磺胺-氨苄西林-红霉素-四环素-链霉素。13株中有3株鉴定出1类整合子，2株携带0，75和1．8kb2个整合子。1株携带1．0kb整合子，PCR产物测序，1．0kb整合子携带,aadA2基因盒。传递对氨基糖苷类抗生素的耐药性。结论肉类食品中变形杆菌携带第1类整合子，1．8kb整合子携带pse-1-aadA1-dfrA14基金盒，传递对β-内酰胺类、磺胺类、氨基糖苷类抗生素的耐药性。携带复杂的基因盒，决定着对β-内酰胺类、氨基糖苷类和磺胺类抗生素的耐药性．     

73株志贺菌属细菌对11种抗生素的耐药性分析

目的研究志贺菌属细菌的耐药状况及其特点。方法采用改良Kirby-Bauer纸片法对临床分离的73株志贺菌属细菌进行11种抗生素的药敏试验,并对其耐药特点进行分析。结果志贺菌属细菌对除庆大霉素以外的传统抗生素四环素、链霉素、氯霉素、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林的耐药率较高,在68.5%～86.3%之间;对头抱类性抗生素头孢噻吩的耐药率为34.2%;对不同喹诺酮类药物的耐药率在36.9%～79.5%之间,差异有显著性(P值均小于0.05);志贺菌属细菌的多重耐药率为79.5%,存在地区及菌型分布差异(P<0.05)。结论志贺菌属细菌对多种抗生素表现耐药,但存在地区和菌型差异,特别是对庆大霉素耐药率较低,可增加其临床应用;使用喹诺酮类药物治疗菌痢时,应做多种喹诺酮类药物药敏试验。     

志贺菌诱导耐药相关基因序列分析

目的获取并分析志贺菌由抗生素诱导产生的耐多药相关基因序列。方法以志贺菌敏感株(Z23)和诱导株(YD)基因组DNA为模板,利用引物设计软件Primer 5.0根据已测得基因序列(Y16B3、Y16B8和Y16A11)设计引物,PCR扩增诱导耐多药相关基因并将相关基因克隆到pMD19-T载体上,测序并将结果在序列相似性搜索工具Blast上检索分析相关基因序列。结果Y16B3和Y16B8基因片段分别在诱导株中扩增出320和225 bp产物,在敏感株中未扩增出;而Y16A11基因片段在诱导株扩增出310 bp产物,在敏感株中扩增出554 bp产物,并且产物序列同源性极低。结论志贺菌在抗生素诱导下产生的耐多药株与敏感菌株比较,具有基因组差异。     

健康人群大肠埃希菌Ⅰ类整合子与耐药性关系

目的 研究健康人群大肠埃希菌中Ⅰ类整合子携带情况及分子特征,分析其与细菌耐药性关系。方法 采用V itek32细菌分析仪和纸片扩散法,检测150株大肠埃希菌抗生素敏感性,PCR检测总DNA中Ⅰ类整合子,扩增产物进行限制性核酸内切酶分析,测序确定携带基因盒种类,脉冲场凝胶电泳对整合子阳性菌株分子分型。结果 150株大肠埃希菌中,83株菌耐受>3种抗生素,耐多药率55.3%;超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性5株,阳性率3.3%;携带Ⅰ类整合子42株,扩增子150~3 000 bp,有8种带型;耐药基因盒主要是dfr和aadA类,最常见基因盒排列dfr17~aadA5;整合子分布在不同基因型菌株中。结论 健康人携带的大肠埃希菌中广泛存在Ⅰ类整合子,与细菌耐多药性密切相关;分子分型结果提示整合子能在细菌种内水平传播,整合子是介导细菌耐药性的重要分子机制。