人脐带Wharton胶间充质干细胞的生物学特性及雪旺细胞分化研究

[目的]研究人脐带Wharton胶间充质干细胞(WJMSCs)的生物学特性及向雪旺细胞诱导分化的可能性,为神经组织工程提供新的种子细胞.[方法]去除新鲜人脐带动、静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,采用组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,免疫荧光鉴定WJMSCs的细胞表面特异标记CD44,CD105,CD34,CD45,Stro-1,Vimentin和Nestin,评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和Forskolin等诱导WJMSCs向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物p75和GFAP的表达;Western分析诱导前后雪旺细胞特异性标记物GFAP的表达.[结果]分离培养的WJMSCs免疫荧光染色CD44、CD105、Stro-1和Vimentin表达阳性,而CD34、CD45和Nestin表达阴性,具有间充质干细胞的生物学特性;WJMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色p75和GFAP阳性;Western结果显示诱导的雪旺细胞标记物GFAP表达阳性.[结论]人脐带Wharton胶间充质干细胞可诱导分化成为雪旺样细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

无血清诱导脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的实验研究

目的探索无血清诱导脂肪间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法。方法取大鼠双侧睾丸周围脂肪组织,分离培养原代脂肪间充质干细胞,CD90、CD44和CD45流式鉴定。将脂肪间充质干细胞分成两组,实验组无血清诱导培养,对照组有血清诱导培养。采用雪旺细胞化学诱导因子逐步诱导2周,比较形态学变化以及细胞免疫荧光S-100和GFAP阳性率。结果分离的脂肪间充质干细胞相关的CD90和CD44表达阳性,CD45表达阴性。诱导后两组形态学相似,实验组S-100、GFAP阳性率与对照组比较无明显差异(P0.05)。结论无血清诱导培养可作为诱导脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的方法。     

体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化

目的探讨体外诱导猕猴骨髓基质干细胞向雪旺细胞分化的实验方法。方法采用BME、b-FGF、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、PDGF依次联合诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率。结果诱导后的猕猴骨髓基质干细胞具有类似雪旺细胞的形态,免疫细胞化学结果显示S-100蛋白、GFAP和P75受体的表达率分别为(66.8±4.6)%、(57.3±5.4)%和(72.4±5.9)%。结论采用BME、ATRA、BDNF、heregulin、Forskolin、b-FGF、PDGF依次联合诱导,可使猕猴骨髓基质干细胞在体外向雪旺样细胞分化。     

同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定

目的：探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外的共培养方法，并行神经分化诱导。方法：分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，各传至第3代后。取等量细胞混合后共培养，共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导，并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态，经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论：同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞。     

低氧对脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的影响

目的探讨低氧对脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向雪旺细胞（SCs）分化能力的影响。方法分离培养SD大鼠ADMSCs并用流式细胞仪、茜素红染色、油红O染色鉴定。将成功分离的ADMSCs随机分为3组：常氧诱导组,在常氧条件下（5％CO2,21％O2,37℃）诱导;低氧处理＋常氧诱导组,低氧处理（5％CO2,0．5％O2,37℃）后在常氧条件下诱导;低氧诱导组,低氧条件下（5％CO2,0．5％O2,37℃）诱导。观察各组细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,免疫荧光染色和Westernblot检测SCs标志物GFAP和S-100的表达。结果细胞分离后,经流式细胞仪分析可见细胞表面CD44阳性、CD45阳性、CD90阳性,茜素红及油红O染色均为阳性。MTT法检测结果：低氧处理＋常氧诱导组A值为0．861±0．039,高于常氧诱导组0．837±0．017,差异具有统计学意义（P〈0．05）;低氧诱导组A值为0．931±0．041,均高于常氧诱导组和低氧处理＋常氧诱导组（P均〈0．05）。免疫荧光染色发现常氧诱导组和低氧处理＋常氧诱导组大量细胞GFAP和S-100表达阳性,低氧诱导组仅少量细胞S-100和GFAP表达阳性。Westernblot检测发现常氧诱导组S-100蛋白表达最高,低氧处理＋常氧诱导组GFAP蛋白表达最高,低氧诱导组S-100蛋白、GFAP蛋白表达均最低。结论低氧抑制ADMSCs向SCs的分化,低氧处理后的ADMSCs在常氧条件下仍可向SCs分化。     

体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向许旺细胞样细胞分化的研究

目的探讨体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向许旺细胞样细胞转化的有效方法。方法分别进行成年大鼠许旺细胞原代培养和BMSC分离培养。根据诱导方法不同,分为化学诱导组和共培养诱导组。采用显微镜观察许旺细胞和BMSC的生长情况,分别采用免疫荧光化学染色法[检测神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和S-100抗体等许旺细胞标志蛋白]和流式细胞术鉴定两种细胞;显微镜下动态观察两组细胞的形态和生长情况;共培养诱导组共培养3 d后,化学诱导组诱导作用4 h、1 d后分别采用免疫荧光化学染色的方法评估两组细胞的诱导分化情况。结果化学诱导组诱导后的细胞发生了明显的许旺细胞样细胞形态改变,预诱导4 h后即出现GFAP抗体表达阳性,维持诱导1 d后,GFAP抗体阳性表达率为(80.9±3.5)%,S-100抗体阳性表达率为(59.0±1.1)%。诱导2 d后分化细胞开始出现脱落死亡,3 d后大部分分化细胞脱落死亡。共培养诱导组共培养3 d后,被诱导的BMSC未出现类似化学诱导组明显的细胞形态改变,GFAP抗体阳性表达率为(89.8±2.4)%,S-100抗体阳性表达率为(80.9±1.7)%。共培养诱导组S-100、GFAP抗体阳性表达率均高于化学诱导组,差异均有统计学意义(均为P0.01)。结论共培养诱导法不仅对BMSC向许旺细胞样细胞定向分化具有明确的效果,而且对BMSC的存活和增殖均有促进作用,因此该法相对于化学诱导法更加安全和有效。     

骨髓间充质干细胞联合定向诱导的神经元样细胞移植治疗脊髓损伤

[目的]探讨一定条件下骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的能力,并进一步研究两种细胞联合移植治疗脊髓损伤(spinalcord injury,SCI)的效果。[方法]选取3个月龄雌性SD大鼠62只,2只处死后提取骨髓间充质干细胞用于细胞培养和分化研究,剩余大鼠采用改良Allen’s法制备T9～11SCI模型,然后随机分为4组(n=15),A组为空白对照组,B组为干细胞组,C组为神经元样细胞组,D组为联合移植组。诱导后的细胞采用免疫荧光方法检测细胞表面特异性标志,各组细胞用Hoechst33342标记,脊髓损伤模型建立1周后将细胞以局部注射的方法移植到损伤区,细胞移植后的1、2、4、6周对各组动物进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分,并行HE染色、荧光显微镜、免疫荧光法检测细胞在体内的存活和分化。[结果]术后2、4、6周各细胞移植组BBB评分较空白对照组相比显著增加(P0.05),D组高于B、C两组(P0.05),B、C两组组间比较差异无统计学意义(P0.05)。HE染色示B、C、D组术后6周的脊髓空洞较A组均减小,以D组最明显;荧光显微镜显示移植的细胞存活于脊髓损伤的区域;免疫荧光染色显示诱导后的细胞与体内存活的细胞表面特异性标志神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、神经丝蛋白200(neuroflament200,NF-200)表达呈阳性,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达呈弱阳性,其中D组NSE和NF-200阳性细胞数量较多,B、C两组较少。[结论]体内体外一定条件下骨髓间充质干细胞都有向神经元样细胞分化的能力;骨髓间充质干细胞和定向诱导的神经元样细胞都可用于移植治疗脊髓损伤,但以两者联合移植治疗的效果最佳。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞及肝内移植研究

目的 观察体外诱导骨髓问充质干细胞分化及肝纤维化形成环境中移植情况。方法 首先行骨髓间充质干细胞提取、分离和培养，加入肝细胞生长因子（HGF，20μg／L）和表皮生长因子（EGF，1．5mg／L）诱导定向分化。肝纤维化形成的大鼠随机分成2组，每组10只。使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记诱导的骨髓间充质干细胞，经门静脉向肝纤维化形成的SD大鼠肝脏移植，对照组用BrdU标记未经诱导的骨髓间充质干细胞。2周后通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏标记细胞的分布及BrdU^＋／ALB^＋细胞数量。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化的细胞CK8及ALB表达阳性。移植2周后大鼠肝脏均可检测到BrdU标记细胞，与对照组相比诱导后骨髓问充质干细胞组BrdU^＋／ALB^＋细胞数较多，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 经体外诱导骨髓间充质干细胞能分化为肝细胞，移植在大鼠肝纤维化形成环境中，白蛋白表达细胞数更多。     

人羊膜间充质干细胞来源的雪旺细胞样细胞移植在皮瓣神经再生中的作用

目的通过将人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)在体外诱导分化为雪旺细胞样细胞(Schwann cells-like cells,SCs-like cells),分别观察两种细胞移植对皮瓣神经再生的作用。方法采用胰蛋白酶/胶原酶二步消化法分离提取hAMSCs并传代,流式细胞术和免疫荧光法鉴定hAMSCs。取第3代培养6 d的hAMSCs体外诱导分化为SCs-like cells,诱导分化19 d后,分别采用免疫荧光法、Western blot及实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qPCR)检测SCs-like cells和第3代培养6 d的hAMSCs中S-100、p75和神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达;ELISA检测第3代培养6 d的hAMSCs以及加入诱导液1、2、3诱导后19 d内上清液中BDNF和NGF表达量。另取SD雌性大鼠75只,建立大鼠腹壁失神经支配穿支皮瓣模型,分为3组(n=25),A、B、C组分别于大鼠皮瓣标记处皮下多点注射培养6 d处于增殖期的第3代hAMSCs 1×10~6个、SCs-like cells 1×10~6个和等体积PBS,分别于移植后2、5、7、9、14 d采用免疫荧光法观察神经丝重链多肽抗体(neurofilament heavy polypeptide antibody,NF-01)阳性表达的神经再生情况。结果经流式细胞术和免疫荧光法鉴定提示培养的细胞为hAMSCs。免疫荧光法、Western blot及qPCR检测结果显示,SCs-like cells的S-100、p75和GFAP阳性细胞百分比、蛋白表达量及基因相对表达量均明显高于hAMSCs,差异均有统计学意义(P0.05)。ELISA检测示:第3代培养6 d的hAMSCs中加入诱导液1后,BDNF和NGF表达量明显降低,随着诱导液2及诱导液3的依次添加,BDNF和NGF表达量逐渐升高,且浓度明显高于第3代培养6 d的hAMSCs,各时间点间差异均有统计学意义(P0.05)。免疫荧光法观察示,移植后5~14 d B组再生神经纤维数高于A组和C组。结论 hAMSCs在体外经适当的化学因子调节后可诱导分化为SCslike cells,在诱导分化过程中释放了大量促进神经生长的因子;且SCs-like cells移植后通过释放大量BDNF和NGF,在神经再生数量方面高于hAMSCs移植。     

Study of in vivo differentiation of rat bone marrow stromal cells into schwann cell-like cells

In order to raise an abundant and accessible reservoir for Schwann cells (SCs), which are used as seed cells for constructing tissue-engineered nerve grafts, we investigated the feasibilty of in vivo differentiation of bone marrow stromal cells (MSCs) into SC-like cells. In this study, MSCs were harvested from adult rats' bone marrow, culture-expanded, and characterized. Subcultured MSCs were then labeled with Hoechst 33342, followed by transplantation into the nerve regeneration chamber, which was made of a silicone tube bridging the sciatic nerve defect of the rats. Four weeks after surgery, some of the differentiated MSCs turned into SC-like cells immunopositive to S-100 protein, accompanied by myelination of the regenerated nerve fibers. Walking-track analyses provided evidence that transplantation of MSCs contributed to reconstruction of the sciatic nerve and reinnervation of target tissues. The experimental results suggest that MSCs are capable of differentiating into SC-like cells in vivo, making them a promising candidate for cell transplantation in peripheral nerve repair.     

Nerve regeneration promoted in a tube with vascularity containing bone marrow-derived cells

Bone marrow-derived cells (BMCs) are multipotent cells that have the potential to differentiate into bone, cartilage, fat, muscle, or neuronal lineages such as neurons and glial cells. A silicone tube model containing reverse-pedicled sural vessels was created in the sciatic nerves of Lewis rats. About 1 x 10(7) BMCs, removed from the bone marrow of synergetic rat femurs and cultured in vitro, were transplanted into the 15-mm-long chambers of the silicone tubes. Nerve regeneration in vessel-containing tubes that had received BMCs was significantly greater at 12 and 24 weeks after surgery than in tubes that did not receive cells. Transplantation of fibroblasts instead of BMCs into the vessel-containing tube resulted in reduced axonal regeneration, which was inferior to regeneration in the vessel-containing tube that did not receive cells. Polymerase chain reaction (PCR) studies revealed that in vessel-containing tubes containing transplanted BMCs, about 29% of cells in the regenerated nerve originated from BMCs. Cells identified by in situ hybridization and PKH26 prelabeling as being of BMC origin stained positively for S100 and GFAP. Transplanted BMCs differentiated into cells with phenotypes similar to those of Schwann cells under the influence of neurochemical factors and survived by obtaining nutrients from vessels that had been preinserted into the tube. They thus functioned similarly to Schwann cells, promoting nerve regeneration.     

骨髓间充质干细胞移植对周围神经损伤后施旺细胞的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对周围神经损伤后宿主施旺细胞的保护作用。方法 分离、培养SD大鼠的BMSCs,制作坐骨神经横断损伤模型,将第4代BMSCs植入坐骨神经损伤远侧段,HE染色和免疫荧光染色检测施旺细胞的形态和数量。结果 HE染色和免疫荧光染色均显示,BMSCs植入后,损伤坐骨神经的施旺细胞数量增多,细胞结构更加清晰完整,排列更加整齐有序。结论 BMSCs植入可以促进坐骨神经损伤后施旺细胞的存活或再生,可作为治疗周围神经系统损伤的干细胞移植的种子细胞。     

激活态雪旺细胞恶性潜能的实验研究

目的 探索来源于成年大鼠周围神经体外培养的激活态雪旺细胞是否具有恶性潜能.方法 从成年大鼠坐骨神经中分离、体外培养激活态雪旺细胞.通过对细胞形态连续动态观察、免疫学标志物鉴定、增殖率和纯度检测、迁移和侵袭能力检测、染色体核型分析及全基因组表达谱基因芯片、细胞因子抗体芯片检测,对激活态雪旺细胞是否具有恶性潜能进行评估.同时做自体体内接种试验,观察经体外激活、扩增后的激活态雪旺细胞接种到自体内是否可以致瘤.结果 激活态雪旺细胞在体外培养形态较均一,无异质性变化.连续传代不丢失S100、P75LNGFR、GFAP等免疫标识物,激活前后迁移和侵袭能力略有增加,但远低于恶性细胞.染色体仍为2倍体.基因和蛋白表达存在动态平衡,第2、3代总体表达最高.动物自体接种可见细胞在体内非正常内环境下至少存活2个月,未见肿瘤生长.结论 从成年大鼠周围神经分离、体外培养获得的激活态雪旺细胞,基本不具备恶性潜能,可用于填充人工神经导管修复周围神经缺损.     

大鼠外周神经损伤后许旺细胞表型改变的初步探讨

目的 探讨用免疫标记方法观察外周神经修复过程中许旺细胞表型改变的意义.方法 用SD雄性大鼠18只,制作右侧坐骨神经损伤模型,模拟临床常见的神经外膜相对扭转的缝合方法,分别于术后1、2、3周取缝合点远近各2 mm长坐骨神经标本,采用GFAP、Sox2、Krox20抗体标记许旺细胞. 结果 术后各观察点许旺细胞的GFAP表达均高于正常,且1周时表达最为明显;未见Sox2表达;术后1周Krox20几乎不表达,2、3周时Krox20的表达均高于正常,且Krox20阳性的许旺细胞明显增殖. 结论 通过免疫标记方法可以反映修复不同阶段许旺细胞的分化状态;对此现象的观察有利于判断神经再生状态并寻找影响神经再生的因素.     

大鼠骨髓基质干细胞体外诱导分化为类许旺细胞

目的 研究大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞的方法。方法 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子等依次按顺序诱导。神经胶质纤维酸性蛋白、S—100免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后不同时间的细胞阳性表达率。结果 诱导后骨髓基质干细胞形态改变，胞体呈椭圆形，有2—3个纤细的细胞突起，成纵形栅栏状排列，免疫细胞化学染色神经胶质纤维酸性蛋白表达率为42．5％-68.7％、S—100表达率为39．6％-60.2％。结论 采用β—巯基乙醇、全反式视黄酸、Forskolin、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、HRG可以诱导大鼠骨髓基质干细胞在体外分化为类许旺细胞。     

PKH26标记法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用

目的 探讨PKH26标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效果及其应用于组织工程神经种子细胞体内示踪实验的可行性.方法 取Wistar大鼠股骨和胫骨的骨髓,用全骨髓贴壁的方法分离、培养BMSCs.用PKH26荧光染料进行标记,荧光显微镜下观察标记效果,流式细胞仪检测荧光标记率,MTT法测定细胞的活性,体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力,并与未标记细胞进行比较;使用显微注射的方法将BMSCs植入去细胞神经支架内制备成组织工程神经,于体外培养3 d、5 d、7 d、14 d,行组织切片,观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况.另外,将体外构建组织工程神经桥接Wistar大鼠坐骨神经15 mm的缺损,于术后1周、4周、6周、8周取出移植物,行组织切片观察植入的BMSCs在支架内的存活情况.结果 PKH26能有效地标记BMSCs,标记率达95%以上,标记后细胞活性及诱导成骨成脂分化能力与未标记细胞无明显差异.在体外培养的环境下,BMSCs能在去细胞神经支架里粘附生长,并沿着支架迁移;在体内外周围神经再生的微环境下,BMSCs可存活8周以上.结论 PKH26荧光染料标记法是一种有效的标记BMSCs的方法,可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究.     

Bridging small-gap peripheral nerve defects using biodegradable chitin conduits with cultured schwann and bone marrow stromal cells in rats

Nerve regeneration requires not only an autologous, allogenous, or biodegradable scaffolding, but additional interactions with regeneration-promoting Schwann cells. Considering the pluripotency of bone marrow stromal cells into different lineages, the authors compared biodegradable conduits with the application of cultured Schwann cells and bone marrow stromal cells in a rat sciatic injury model. Simple conduit bridging served as controls. Electrophysiologic evaluation and histologic morphometrical analysis were performed after 6 weeks; both groups with cultured cells showed a statistically significantly higher number of axons, more well-shaped remyelinated axons, and an advance in clinical functional recovery (SFI) than the simple conduit-bridging group. Confocal microscopy found that bone marrow stromal cells adopted the Schwann-cell phenotype, expressing S100 protein. Considering the ease of aspiration and greater resource of bone marrow stromal cells, the implantation of a biodegradable conduit with cultured bone marrow stromal cells was capable of presenting an alternative to conduits with Schwann cells for bridging nerve defects.     

陈旧性神经损伤后雪旺细胞的变化实验研究

目的 观察大鼠坐骨神经损伤后雪旺细胞的变化。方法 切断成年SD大鼠右侧坐骨神经，形成10mm缺损。于术后1～12个月不同时间段取材。标本用p75受体（p75 neurotrophin receptor．p75NTR）、S-100免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，另部分标本进行超微结构观察。结果 神经损伤后1个月，损伤远端神经中p75NTR和S-100的表达最多，在损伤后6个月时p75NTR降至正常水平，S-100则在损伤后9个月时消失。电镜下，雪旺细胞出现在神经内膜管内，神经内膜管下及内膜管周围有大量胶原原纤维增生。结论 大鼠坐骨神经损伤后，雪旺细胞中p75NTR的表达增加，但随损伤时间的延长呈进行性下降，伤后6个月时消失。     

ATP对兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

摘要：目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在ATP诱导下体外分化成神经细胞的可行性：方法抽取兔骨髓,淋巴细胞分离液密度梯度分离单个核细胞,体外培养传代,第3代时加入ATP,观察MSCs分化为神经细胞的形态学变化,并行诱导细胞的组织化学染色。结果MSCs在体外可以扩增,住ATP诱导下向神经样细胞分化,行巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(cFAP)抗体免疫反应染色,阳性数分别约为Nestin30％、NsE：32％、GFAP15％。结论ATP能够诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。