小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达。方法利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3′末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcD-NA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定。将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3mRNA及蛋白的表达情况。结果所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 cDNA片段和442bp的FABP3-FlagcDNA片段,经测序证实正确。转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达。结论构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础。     

大鼠糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及功能研究

目的：构建大鼠糖皮质激素受体变异体表达载体，研究其表达和功能。方法：运用RT—nested PCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD结构域的cDNA序列，将PCR产物定向克隆至pEGFP—N2质粒载体，测序筛选重组质粒；荧光显微镜观察重组质粒转染后的表达情况；相对荧光素酶法检测转录激活活性。结果：扩增出长1612bp的cDNA序列，测序证实：克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100％；重组质粒表达产物定位于细胞核；转染组细胞转录激活活性增强。结论：成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体，该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。     

HA表位标记的人Axud1基因的构建及在肺腺癌SPC-A1细胞中的表达

构建在哺乳动物细胞中表达的血凝素HA表位标记的人Axud1融合蛋白表达载体。RT PCR从人外周血淋巴细胞中扩增Axud1全长cDNA ,用含HA序列的特异引物PCR扩增HA Axud1,经BamHⅠ、XbaⅠ酶切后插入到经BamHⅠ、XbaⅠ酶切的真核表达载体pcDNA3 .1( ) 中 ,重组质粒PCR、酶切和测序鉴定正确 ,最后将该质粒转染入肺腺癌SPC A1细胞中 ,Westernblot检测HA Axud1融合蛋白的表达。结果显示 ,筛选的G418抗性克隆SPC A1细胞中均有HA Axud1融合蛋白的表达 ,为进一步研究Axud1蛋白在肿瘤细胞中的功能提供了一个重要工具     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。     

凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡

目的：克隆凋亡素（apoptin)的全长基因,在肿瘤细胞HeLa中表达并诱导其凋亡,方法：从CAV病毒基因组TK5803中通过PCR技术扩增凋亡素基因,直接克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo,序列测定证实其正确性,并克隆至pCIneo真核表达载体构建重组表达载体,采用脂质体转染HeLa细胞,转染3d后Honchest33258染色并于荧光显微镜下观察细胞状态,结果与讨论：核酸序列分析证实所克隆的凋亡基因与文献报道的一致,将其成功克隆至真核表达载体,pCDNA3.1/his/Topo和pCIneo,构建了真重组质粒pCIneo-apoptin和pCDNA3.1/His/Topo-apoptin,转染Hela细胞3d后可见明显的细胞凋亡,而只转染空质粒的对照组则较少,表明凋亡素能够有效地诱导HeLa细胞凋亡,本研究为进一步研究凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制打下了基础。     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因转染胃癌GC9811细胞的功能研究

通过RT—PCR从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞扩增出编码小鼠α1，3—半乳糖基转移酶基因的全长cDNA并构建其真核表达载体pCDNA3．1／V5—HisAα1，3GT，pCDNA3.1／V5-HisAα1，3GT通过脂质体转染胃癌GC9811细胞，使胃癌细胞表达Galα(1，3)Gal糖表位，G418筛选2个月内的阳性克隆，RT—PCR鉴定转染细胞，间接免疫荧光染色检测转染真核表达载体的癌细胞Galα(1，3)Gal的表达，利用人体血清内针对Galα(1，3)Gal糖表位的天然抗体对癌细胞进行杀伤。结果表明，成功构建了α1，3—半乳糖基转移酶基因真核表达载体，转染α1，3—半乳糖基转移酶基因的癌细胞高表达Galα(1，3)Gal糖表位，人血清对表达该表位的癌细胞具有杀伤作用。     

ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编友区序列，构建反义真核表达载体，通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR阿霉素（ADM）积蓄能力的影响，评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列，PCR产物经DNA序列测定证实后，采用分子克隆技术，将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC7901／VCR，流式细胞仪（FACS）检测SGC7901／VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段，经DNA序列,下实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致；构建了反义真核表达载体pcDNA3.1-ZNRD1；转染SGC7901／VCR细胞后，可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后，胃癌多药耐药细胞株SGC7901／VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高，提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。     

辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN的构建及其体外抗肿瘤作用的研究

目的 克隆人野生型抑癌基因PTEN／MMAC1 cDNA序列、构建辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN并研究其体外稳定转染联合X-射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖的抑制作用。方法 利用RT—nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约1200bp的PTEN片段，并将其重组人pcDNA3．1-Egr载体中，构建为表达质粒pEgr-hPTEN，体外转染肿瘤细胞并经G418筛选稳定转染细胞株SHG-44-sPTEN，接受不同剂量X射线照射，观察基因-放射联合作用对肿瘤细胞生长的影响。结果 经全自动测序证明克隆得到了野生型PTEN基因；辐射诱导表达载体pEgr—hPTEN构建正确；稳定转染联合X-射线照射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖，5Gy以内随吸收剂量的增加，肿瘤抑制作用更明显。结论 本研究成功克隆了人野生型抑癌基因PTEN／MMAC1 cDNA序列并构建了辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN，体外基因-放射联合治疗具有明显的肿瘤抑制作用。本研究为提高临床恶性肿瘤放疗疗效奠定了理论和实验基础。     

基因转染增加免疫低下大鼠肺内γ-干扰素水平的研究

探讨肺内基因转染、补充肺内IFN－γ水平的可行性。构建重组大鼠IFN－γ真核表达载体，转染免疫低下大鼠肺内。鉴定外源性质粒，并检测BALF和血清中IFN－γ浓度和活性。结果发现：构建的重组载体中IFN－γ的基因序列与Gene Bank中大鼠的IFN－γ cDNA序列相同。转染后BALF中细胞基因组DNA的PCR产物电泳可见转染的基因片段条带，转染后21天仍可见其表达。pLXSN-IFN载体组BALF中大鼠IFN-γ浓度和活性显著高于pLXSN空载体组。血清中IFN－γ浓度和活性二组间差异无显著性意义（P＞0．05）。提示本研究构建的重组大鼠IFN－γ真核表达载体可成功地转染大鼠肺内，整合入基因组DNA，分泌有活性的IFN－γ，并较长期地表达。     

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的：构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素(hEnS)融合基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RCR的方法扩增hEDN基因，克隆人含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS后，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PACE及Westen-blot分析及鉴定。结果：成功构建了抗肝癌HdsFv-hEDN融合基因原核表达载体；SDS-PACE和wbsten—blot分析显示，诱导表达产物出现一条Mr约为45．0KD的新生蛋白带，表达量占菌体总蛋白量的x％，主要以包涵体形式存在。结论：抗肝癌hdsFv—hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达，为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

人白血病抑制因子的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

白血病抑制因子（ＬＩＦ）是一种多功能的细胞因子，正常生理条件下，人体各组织细胞并不产生ＬＩＦ，只有在一定条件刺激下，一些细胞如淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞才产生ＬＩＦ，此外，一些白血病细胞系如Ｕ９３７、ＨＬ－６０在一定条件刺激下亦产生ＬＩＦ。该实验根据Ｍｏｒｅａｕ报道的ＬＩＦｃＤＮＡ序列，通过激活ＬＩＦ基因、逆转录ＰＣＲ等步骤成功地克隆了ＬＩＦｃＤＮＡ后，将ＬＩＦｃＤＮＡ亚克隆至表达载体ｐＢＶ２２０形成重组表达质粒ｐＢＶ２２０／ＬＩＦｌ，该重组质粒转化ＤＨ５α大肠杆菌，经过诱导后ＬＩＦ在ＤＨ５α中的表达量达１０％。     

免疫毒素IL-18-PE38原核表达载体的构建及其鉴定

目的 构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体,并鉴定其产物在大肠杆菌中的表达.方法 首先经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得小鼠IL-18基因,再通过酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL18-PE38,重组载体经PCR、限制性内切酶及DNA序列测定证实连接片段正确后,转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性.结果 成功构建了IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-18的特异性抗体所识别.结论 获得了IL-18-PE38融合基因在原核系统的表达,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础.     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.