表皮生长因子对肝细胞DNA合成作用的体内与体外研究

本文应用单克隆抗溴脱氧脲嘧啶抗体(Monoclonal anti-bromodeoxyuridine)标记DNA 技术和流式细胞术(Flow cytometry)对表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、胰高血糖素(G)和胰岛素(I)对犬鼠肝细胞DNA 合成的刺激作用分别进行了体内和体外研究。     

胶原三维培养下卵巢癌细胞生物学性状研究

目的 建立卵巢癌HO-8910PM细胞胶原Ⅰ三维培养模型,对胶原Ⅰ基质中卵巢癌HO-8910PM细胞的形态、活力及功能进行研究,为体外卵巢癌的研究提供参考。方法 透射电镜表征胶原Ⅰ结构特点,以胶原Ⅰ为支架材料,建立卵巢癌细胞体外三维培养模型;倒置显微镜观察卵巢癌细胞生长形态及增殖情况;钙黄绿素-AM染色观察胶原Ⅰ基质中卵巢癌细胞的活力;ELISA检测二维培养及三维培养中卵巢癌细胞血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的分泌。结果 透射电镜下可见胶原Ⅰ呈交联网络状结构,胶原Ⅰ基质中卵巢癌细胞集聚成不规则团状,细胞在胶原Ⅰ中的活力较好,细胞与基质具有良好的生物相容性;与二维培养细胞比较,三维培养体系中VEGF-A、EGF和IGF-1的分泌量均较高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论 胶原Ⅰ具有良好的结构与性能,适宜于卵巢癌细胞体外三维培养,并能较好地维持卵巢癌细胞的形态和功能。     

胶原夹心培养大鼠肝细胞及其细胞色素P450酶活性的测定

目的　自制大鼠尾腱Ⅰ型胶原培养原代大鼠肝细胞 ,测定肝细胞中细胞色素P450 (cytochromeP450 ,CYP)酶活性。方法　制备无菌大鼠尾腱Ⅰ型胶原 ,比较单层胶原铺底法 (collagencoated ,CC)及胶原夹心法 (collagensandwichsys tem ,CSS)培养大鼠肝细胞的生长及功能维持情况。CSS法培养肝细胞 ,分别加入泼尼松龙 (10 0 μmol·L- 1,3d)、尼莫地平 (50 μmol·L- 1,2d)和利福平 (50 μmol·L- 1,2d) ,测定CYP1A、CYP2E1及CYP3A酶活性。结果　CSS法培养 6d后 ,肝细胞生长良好。CC法培养 3d后细胞开始脱落 ,此后持续增多 ;6d后 ,培养上清液中ALT、AST与LDH活性升高 ,均高于同期CSS法培养细胞上清液中的水平。加入经CYP3A代谢药物 ,CSS培养肝细胞CYP1A活性无明显改变 ;尼莫地平使CYP3A活性升高 3 3 % ,而CYP2E1活性下降 45% (P <0 0 5) ;利福平使CYP3A活性升高为对照组的1 94倍 (P <0 0 5) ,对CYP2E1活性无作用。结论　同为CYP3A底物 ,泼尼松龙、尼莫地平和利福平对CYP亚型的影响不同 ,但不改变肝细胞CYP1A对致癌物的活化。CSS培养法可作为体外模型用于药物代谢研究     

肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对急性心梗大鼠心肌胶原合成的影响

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)基因转染骨髓间充质干细胞(MSCs)对急性心梗大鼠心肌胶原合成的影响.方法 通过结扎大鼠冠状动脉前降支制作SD大鼠急性心梗模型.40只SD大鼠随机分为对照组、假手术组、心梗组、MSCs组和MSCs-HGF组.所有MSCs移植前进行无血清、无氧条件培养6 h;移植后4周HE染色与苦味酸天狼猩红染色观察大鼠心肌组织胶原分布、容积分数,ELISA法测心肌组织胶原Ⅰ、Ⅲ含量.结果 HE染色结果显示心梗组心肌细胞减少,结构紊乱,可见大量增生组织;MSCs-HGF组细胞形态结构较为完整,心肌组织间隙仅见少量增生组织.苦味酸天狼猩红染色显示:心梗组有大量红染纤维,呈束状或片状;MSCs-HGF组仅可见细束状红染纤维.ELISA结果可见:与心梗组相比较,MSCs-HGF组心肌组织胶原Ⅰ、Ⅲ含量均明显减少(P＜0.05).结论 HGF基因转染MSCs可抑制急性心梗大鼠心肌胶原的合成.     

原代培养人肝细胞的简易高效法

二步胶原酶灌注术分离大鼠肝细胞已比较成熟,但是用大鼠肝细胞所得的实验结果还需外推于人,而人的整肝或肝叶的获取来源极其有限,不宜在一般实验室推广[1]。人肝癌细胞、传代肝细胞株等体外虽然容易增殖,但其生物学特性已发生显著变化,因此,原代人肝细胞是公认用来研究药物代谢     

大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

肝细胞生长因子对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用

采用大鼠离体肝细胞原代培养２４ｈ，并利用ＣＣｌ４造成急性肝细胞损伤模型，检定肝细胞生长因子（ＨＧＦ）对肝细胞损伤的影响．结果表明：ＨＧＦ可显著降低中毒肝细胞及细胞膜脂质过氧化物水平，抑制肝细胞脂质过氧化，并降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，稳定质膜；显著促进中毒肝细胞ＲＮＡ和ＤＮＡ的合成；超微病理证实ＨＧＦ能减轻ＣＣｌ４对肝细胞质膜，染色质，线粒体，内质网及核蛋白体的损害     

肝细胞生长因子对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用

采用大鼠离体肝细胞原代培养24 h，并利用CCl₄造成急性肝细胞损伤模型，检定肝细胞生长因子(HGF)对肝细胞损伤的影响. 结果表明：HGF可显著降低中毒肝细胞及细胞膜脂质过氧化物水平, 抑制肝细胞脂质过氧化, 并降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平, 稳定质膜；显著促进中毒肝细胞RNA和DNA的合成；超微病理证实HGF能减轻CCl₄对肝细胞质膜，染色质, 线粒体, 内质网及核蛋白体的损害.     

大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立

目的:分离大鼠肝细胞,建立体外大鼠肝细胞损伤模型.方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸转移酶)、LDH(乳酸盐脱氢酶),同步测定肝细胞的细胞增殖活性(MTT)反应.结果:平均肝细胞产量(8.92±0.47)×108,Trypan blue拒染实验细胞活性率96.23%±2.41%,培养体系中加入D-氨基半乳糖后,部分肝细胞胞膜破损,随剂量增加及时间延长而逐渐加重;各剂量组随时间延长,培养上清液中生化指标水平逐渐升高,而MTT反应水平逐渐下降,以3 h与6 h变化最为明显;各时间点生化指标及MTT反应变化随剂量增加呈现相同趋势.结论:该方法可获得高产量高活性大鼠肝细胞;D-氨基半乳糖可成功诱导大鼠肝细胞体外损伤模型.     

Cyclosporin A induces apoptosis in rat hepatocytes in culture

Cyclosporin A (CsA) at concentrations up to 1 μM induced apoptosis in a dose-dependent manner in cultured rat hepatocytes for 48 h in the presence of insulin and epidermal growth factor (EGF). The effect of CsA was evidenced by the DNA fragmentation pattern constituted by fragments of multiples of 180–200 base pairs, which is a characteristic of programmed cell death. The metabolic activity did not change significantly in the presence of 0.1 μM CsA and diminished to 49% of control in the presence of 1 μM CsA. Changes in the metabolic activity were correlated with a decrease in both [methyl-³H]thymidine uptake and DNA content, which reflects a decrease in the cell number. The treatment of cells with CsA (1 μM) decreased the metabolic activity/DNA content ratio by 24% with respect to dimethyl sulphoxide (DMSO) control, which also suggests, under these conditions, that the necrosis achieved is at most only 24%. In addition, the changes observed (apoptotic process, arrest of the cell cycle and apparition of a necrotic process) were correlated with an increase in the high-affinity guanosine triphosphatase (GTPase) enzymes. Received: 17 February 1998 / Accepted: 20 April 1998     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导分化

目的 探讨上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺(NIC)、肝细胞生长因子(HGF)、葡萄糖(Glu)、角脘蛋白生长因子(KGF)和β细胞素在大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导分化的作用.方法 采用健康SD大鼠胰腺导管上皮细胞,分于70个培养孔中,加入含有多种营养因子(不含血清)的PRMI 1640培养液中培养.每个孔中6种诱导剂均进行随机组合.在胰岛样细胞团(ICCs)形成前后的不同天数进行细胞计数、电镜观察、胰岛素测定以及免疫细胞化学和荧光分析.结果 胰腺导管上皮细胞培养7d后,单个贴壁上皮细胞分裂增殖,呈鹅卵石样细胞片,单层覆盖;加入诱导和促生长因子后,单层覆盖上皮细胞中逐渐产生一定数量类似胰岛样球状细胞团,直径为80～130μm.结论 6种促生长和诱导因子中,Glu、NIC、KGF、EGF作用较强;在所设定的浓度范围内,其作用均随着浓度的增加而增强.     

Induction by cyproterone acetate of DNA synthesis and mitosis in primary cultures of adult rat hepatocytes in serum free medium

The aim of this study was to elucidate whether serum-free conditions could be found in primary hepatocyte cultures under which the growth inducing properties of xenobiotics and hormones could be tested. Cyproterone acetate (CPA), a steroid with anti-androgenic and progestogenic activity, was chosen as a model compound because of its known strong mitogenic properties in rat liver in vivo. EGF served as a positive control. Induction of DNA synthesis was studied by [³H]-thymidine labeling and autoradiography. Mitoses were counted in hematoxylin stained specimens. The main steps which led to an efficient stimulation of DNA synthesis by CPA were (i) reduction of hormone concentrations to levels approaching (approx. 10 x) physiological concentrations better than the previously used pharmacological ones (up to 2500 x); (ii) supplementation with glucocorticoid (most effective at 10–100 nM dexamethasone); (iii) selection of the interval for cumulative labeling with thymidine at 44–68 h; (iv) lowering of cell density at seeding to 50 000 cells/cm² (subconfluency); (v) treatment with concentrations of 10–100 M CPA. With these conditions CPA labelling was 13–20% (increase 4-to 9-fold). Mitotic incidence was 0.56% (CPA) versus 0.08% in controls. From a dose response study (0.1–100 M) a no-effect-level for induction of DNA synthesis was found in the range of 0.1–1 M. None of the high concentrations of CPA did cause cytotoxicity as estimated by morphological observations or release of lactate dehydrogenase into the medium. This work demonstrates that CPA under appropriate, defined culture conditions induces DNA synthesis and mitosis. The findings suggest that CPA action on the liver in vivo is at least in part a direct one. The extent of induction was in the same range as found in vivo. The effective concentrations were almost equivalent to CPA liver concentrations after treatment in vivo. Thus the present culture conditions appear to simulate quite well in vivo liver growth control mechanisms. This stresses the versatility of primary hepatocyte cultures as a tool in toxicology for the study of normal and drug-induced growth responses.Abbreviations CPA cyproterone acetate - DEX dexamethasone - EGF epidermal growth factor - LI labeling index     

EGF对肝部分切除术后促进肝再生的实验研究

目的：寻找能够促细胞再生的药物。方法：采用形态计量技术，^3H-TdR活体掺入实验以及动脉血中酮体比率的变化来研究上皮生长因子（EGF）对大鼠部分肝切除术后残肝能量代谢、DNA合成、肝细胞有丝分裂以及肝再生的变化。结果：肝细胞核分裂指数、肝细胞核体积密度、新生肝细胞数目密度、酮体比率及^3H-TdR活性掺入实验结果均显著高于对照组（P＜0．05或P＜0．01）。结论：EGF对大鼠肝部分切除术后残肝有促进其再生作用。     

创面愈合过程中EGF、EGFr变化的临床研究

目的 探讨内源性EGF、EGFr变化在创面愈合过程中的作用。方法 取22例中厚断层供皮区创面病人术后4天、10天和16天时创面组织,行HE和ABC免疫组织化学染色对照创面大体变化,观察创面愈合过程中内源性EGF、EGFr的变化及其与组织修复的关系。结果 伤后10天时内源性EGF、EGFr有明显的表达,伤后4天和16天时表达较弱,这些变化与组织学改变较一致。结论 内源性EGF、EGFr变化为机体的生理变化,可以促进修复,也可避免疤痕形成。     

急性肾衰患者尿液和肾组织中表皮生长因子的检测及动态变化的意义

应用放射免疫法对6例急性肾功能衰竭（ARF）患者尿中表皮生长因子（EGF）的水平进行测定和动态观察，并用免疫组化法对其中5例患者肾活检组织中肾小管上EGF和EGF受体（EGF－R）进行定量分析。结果ARF恢复期尿中EGF含量的不断增加，血清肌酐水平和钠滤过分数逐渐下降，在伴有肾小管上皮细胞再生表现者其肾小管上EGF的增加尤为明显，并且与肾活检时尿中EGF含量的变化相平行。揭示在ARF恢复期尿中EGF含量的变化可反映肾小管和肾功能的恢复状态，而肾小管上EGF的增加可能有利于肾小管上皮细胞的再生。     

肝脏注射促肝细胞生长素和地塞米松对肝硬化肝窦病变及Ⅳ型胶原表达的影响

目的观察肝脏注射促肝细胞生长素和地塞米松对肝硬化肝窦组织病变的体视学改变及肝窦Ⅳ型胶原表达的影响。方法在超声引导下,对98例肝硬化患者肝脏注射促肝细胞生长素80mg及地塞米松1mg,每周注射2次,12次为一疗程,治疗1个疗程后,通过肝脏穿刺活检病理观察肝窦组织病变变化情况及Ⅳ型胶原的表达情况。结果98例肝硬化患者治疗1个疗程后,肝窦组织病变明显改善（P〈0．01）,Ⅳ型胶原表达显著减弱（P〈0．01）。结论对肝硬化患者行超声引导下肝脏注射促肝细胞生长素和地塞米松能明显改善肝窦组织病变及Ⅳ型胶原的表达。     

EGF对大鼠背部随意皮瓣存活的影响

目的探讨皮下局部注射表皮生长因子(EGF)对SD大鼠背部随意皮瓣存活的影响。方法将16只SD大鼠背部制成2cm×8cm随意皮瓣,随机分为EGF治疗组和对照组,分别进行皮瓣存活率、微血管密度(MVD)的检测。结果EGF组皮瓣第5天、第10天时存活率均高于对照组;EGF组皮瓣内见较多新生血管,高倍镜视野下单位MVD超过对照组(P<0.01)。结论EGF一次性皮瓣内用药能促进大鼠背部超长皮瓣的存活比例,其机制可能与促进皮瓣血管新生有关。     

肝细胞生长因子对心肌成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的通过体外培养的新生大鼠心肌成纤维细胞研究肝细胞生长因子(HGF)对结缔组织生长因子表达(CTGF)的影响。方法差速贴壁法分离新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)及免疫组化法对其进行鉴定,选AngⅡ(10~(-6)mol/L)作诱导浓度,与HGF100ng/ml孵育48h,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定CFsCTGFmRNA的表达,WesternBlot法测定CTGF蛋白的表达。结果肝细胞生长因子能够在mRNA及蛋白水平上大部分抑制AngⅡ对CTGF表达的诱导。结论初步证实在心肌纤维化的过程中,HGF与CTGF是一对拮抗生长因子,HGF可能通过抑制CTGF表达的途径逆转心肌纤维化。     

慢性阻塞性肺病大鼠结缔组织生长因子的表达

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)在慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型的表达以及与肺结构重塑的相关性。方法通过烟熏及气管内注入脂多糖法建立COPD大鼠模型。RT-PCR和免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中CTGF mRNA与蛋白表达水平;天狼猩红偏振光法观察大鼠Ⅰ、Ⅲ胶原沉积情况,并对大鼠肺组织作病理形态学分析。结果CTGF mRNA早期出现高峰,后期出现下降并保持在一较高水平。对照组、7d组大鼠肺组织未检测到CTGF蛋白表达,从14d组开始CTGF表达逐步增加。结论CTGF在COPD间质纤维化的形成与进展过程中起着重要作用。