Ad5/F35-MAGE-A3的构建及其对黑素瘤患者DC成熟和凋亡的影响

目的：构建含人黑素瘤相关抗原3（melanoma-associated antigen 3,MAGE-A3）的重组5/35型腺病毒（adenovirus serotype 5/35,Ad5/F35）,观察腺病毒介导的MAGE-A3过表达对黑素瘤患者树突状细胞（dendritic cell,DC）的成熟和凋亡的影响。方法：选择转染效率最高的腺病毒载体,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒颗粒Ad5/F35-MAGE-A3。免疫组化和Western blotting检测Ad5/F35-MAGE-A3感染对健康人、肾癌患者及黑素瘤患者DC中MAGE-A3表达的影响,流式细胞术检测Ad5/F35-MAGE-A3感染对黑素瘤患者DC成熟和凋亡的影响。结果：成功构建了含人MAGE-A3的重组腺病毒载体并包装腺病毒颗粒Ad5/F35-MAGE-A3,病毒感染滴度为7.94×108 IU/ml。Ad5/F35-MAGE-A3感染显著提高了健康人和肾癌患者DC中MAGE-A3的表达（P<0.05）,不影响黑素瘤患者DC中MAGE-A3的表达\[（0.3352±0.1272）vs（0.4672±0.0704）,P>0.05\]。Ad5/F35-MAGE-A3感染后黑素瘤患者DC共刺激分子CD80\[（20.42±0.58）% vs（10.22±1.04）%、（8.95±02）%\]、CD86\[（85.3±3.98）% vs（39.85±2.86）%、（34.1±4.32）%\]和HLA-DR\[（86.87±4.36）% vs（63.68±3.15）%、（60.69±4.81）%\]的表达明显高于阴性对照组和空白对照组（均P<0.05）,但DC凋亡率无显著差异\[（1.18±0.09）% vs （1.09±0.11） %,P>0.05\]。结论：重组腺病毒载体Ad5/F35-MAGE-A3能够高效转染黑素瘤患者的DC,感染后不影响MAGE-A3在DC中的表达,能够促进DC的成熟,无明显细胞毒作用。     

肿瘤细胞表面柯萨奇病毒 腺病毒受体与5型腺病毒感染效率的关系

目的〖HT5"SS〗: 探讨不同肿瘤细胞系柯萨奇病毒腺病毒受体（CAR）和整合素的表达水平与5型腺病毒感染效率的关系,为腺病毒基因治疗研究奠定基础。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗: 利用瞬时转染CAR的真核表达质粒提高肿瘤细胞表面CAR的表达,应用抗体封闭细胞表面的CAR和整合素后,通过流式细胞仪和荧光素酶分析法测定腺病毒Ad5CMVEGFP和Ad5CMVLuc对肿瘤细胞的感染效率和基因表达水平的变化。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗： 不同肿瘤细胞表面CAR和整合素的表达水平是不同的,其中SMMC7721和A549细胞CAR的表达量最高,而K562细胞CAR的表达水平最低;荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad5CMVEGFP对肿瘤细胞的感染效率,结果显示5型腺病毒对于SMMC7721和A549细胞的感染效率最高,而对于K562细胞则很低;瞬时转染表达CAR的真核质粒可提高多种肿瘤细胞表面CAR的表达,较大幅度提高了5型腺病毒的感染效率。而抗体封闭肿瘤细胞表面的CAR或整合素后,腺病毒感染效率显著下降。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗:肿瘤细胞表面CAR和整合素的表达水平决定了腺病毒对肿瘤细胞的感染效率。     

CAR的表达调节对肝癌基因治疗中腺病毒载体感染效率的影响

目的: 通过抑制RafMEKERK信号转导途径调节肝癌细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackieadenovirus receptor,CAR)的表达,探索肝癌基因治疗中CAR表达与腺病毒(adenovirus, Ad)感染效率之间的关系。方法: 选择两株人肝癌细胞株SMMC－7721及HepG2，以RafMEKERK信号转导抑制剂U0126作用后,应用Western blotting检测细胞表面CAR蛋白的表达水平。选用能表达GFP的非复制型E1A缺陷的Ad感染人肝癌细胞SMMC－7721及HepG2,应用FACS分析U0126处理前后Ad感染效率的变化。结果: 细胞经MEK抑制剂U0126处理后，细胞膜表面CAR的表达呈明显上调趋势。FACS检测显示,经U0126处理后,在相同感染复数(10 MOI)AdGFP的感染下,GFP+细胞率明显升高, SMMC7721细胞由（71.65±6.21）％上升至（86.54±5.70）％；HepG2细胞由（77.53±4.62）％上升至（87.06±2.83）％ (均P<0.05)。结论: 抑制剂U0126抑制RafMEKERK信号转导途径后,可上调肝癌细胞膜表面CAR的表达,从而导致Ad在肝癌细胞感染效率的提高。     

重组TRAIL腺病毒抑制肺癌细胞生长和诱导凋亡的作用

目的：研究重组TRAIL腺病毒（Ad-TRAIL）对人非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460抑制生长和诱导凋亡的作用,探讨Ad-TRAIL用于非小细胞肺癌基因治疗的可能性。方法：培养肿瘤细胞,分别加入Ad-TRAIL、sTRAIL,并设Ad、PBS作对照。倒置显微镜、吖啶橙染色后荧光显微镜、电镜进行细胞形态结构观察;肿瘤细胞生长抑制实验检测细胞存活率,绘制肿瘤细胞生长抑制曲线;DNA凝胶电泳、PI染色、TUNEL染色和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡;集落形成实验观察肿瘤细胞集落形成能力。结果：Ad-TRAIL组、sTRAIL组与空腺病毒Ad组、PBS阴性对照组相比均明显抑制非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460的增殖。DNA凝胶电泳出现DNA梯形条带;形态学观察发现Ad-TRAIL组的肿瘤细胞具有细胞凋亡的形态;Ad-TRAIL作用的YTMLC细胞有较高比例（8.55%）的亚二倍体凋亡峰,而Ad和PBS组分别为1.08%和0.47%;Ad-TRAIL组被TUNEL标记的细胞比例为10.6%,高于Ad组的1.13%。Ad-TRAIL组的集落数为28±7,而PBS和Ad对照组分别为257±18,193±12。结论：Ad-TRAIL对非小细胞肺癌细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用,Ad-TRAIL有可能用于非小细胞肺癌的基因治疗。     

mda-7/IL-24对裸鼠肝癌移植瘤的生长抑制和促凋亡作用

目的:探讨mda7/IL24对裸鼠肝癌细胞移植瘤的生长抑制和促凋亡作用及其相关机制。方法：构建携带mda7基因的重组腺病毒载体Admda7。以HepG2细胞皮下接种建立裸鼠肝癌移植瘤模型,采用瘤内单点注射的方法分别给予AdGFP、Admda7和ALLN（毒胡萝卜素,NAcLLnorleucinal）+Admda7,观察瘤质量和瘤体积的变化,通过免疫组化和TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡相关蛋白caspase3活化、细胞增殖相关抗原ki67和微血管密度、细胞凋亡率,并通过Western blotting检测caspase12、caspase3和Bax的表达。结果： Ad.mda7治疗组和Ad.GFP对照组肿瘤体积分别为（312.6±30.2）mm3和（520.6±30.0）mm3（P<0.01）,两组的肿瘤质量分别为（0.321±0.031）g和（0.534±0.030）g（P<001）;Ad.mda7治疗后瘤细胞的凋亡率显著高于对照组（P<0.01）;Ad.mda7可抑制肝癌组织ki67表达、微血管密度和促进caspase3的表达。 经 ALLN 处理的裸鼠,明显抑制Ad.mda7对肝癌细胞的致凋亡作用（P<0.05）,并且下调Ad.mda7诱导的caspase12、caspase3和Bax的表达。结论： Ad.mda7可显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长和新生血管的形成,并通过内质网应激通路显著诱导肿瘤细胞的凋亡。     

重组人P53腺病毒增强肝癌细胞放疗的敏感性

摘 要 目的: 探讨重组人P53腺病毒(recombinant human adenovirus P53，rAdP53)对不同P53状态肝癌细胞生长的抑制和放射增敏作用。 方法: 以重组人P53腺病毒分别感染突变型P53肝癌细胞PLC/PRF/5和野生型P53肝癌细胞SMMC7721， Western blotting检测肝癌细胞P53蛋白表达，MTT法检测细胞存活率，台酚蓝染色绘制细胞生长曲线。肝癌细胞感染rAdP53 48 h后照射不同剂量的X射线，克隆形成法检测放射增敏比，TUNEL法检测细胞凋亡。 结果: 50 MOI rAd-P53转染PLC/PRF/5和SMMC7721细胞后转染效率分别为89.37%和87.53%，转染48 h可见P53蛋白高表达，MTT法显示细胞存活率分别为341%和35.44%，细胞生长曲线显示感染后第5天两种细胞生长抑制率分别为41.91%和17.03% (P<0.01)，PLC/PRF/5细胞的凋亡率\[(8.8±1.4)%\]显著高于SMMC7721 [(4.1±1.1)%] (P<0.01)。应用20 MOI的rAd-P53转染细胞48 h后加X射线(4 Gy)照射，PLC/PRF/5细胞的凋亡率为(26.9±5.6)%，显著高于SMMC7721细胞凋亡率(16.4±29)% (P<0.01)；20 MOI的rAdP53转染后加照射PLC/PRF/5和SMMC7721，细胞的放射增敏比SER(Dq)值分别为1.30和1.16；SER(D0)值分别为1.57和1.25。 结论: rAdP53能显著抑制人肝癌细胞生长、诱导细胞凋亡并提高细胞的放射敏感性，其对PLC/PRF/5细胞作用显著强于SMMC7721细胞；表明不同内源性P53状态的肝癌细胞对rAdP53治疗及其协同的放疗敏感性可能不同。     

重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用

目的: 探讨含腺病毒基因E1A、融合自杀基因CDglyTK及报告基因GFP的重组腺病毒rAdE1ACDglyTK与酶前体药物5FC和(或)GCV联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。方法: 将重组腺病毒质粒prAdE1ACDglyTK经脂质体介导转染293细胞，进行病毒的扩增、纯化与PCR鉴定，以紫外分光光度法与TCID50法测定纯化病毒的颗粒浓度与感染性滴度，计算病毒比活性；在SKOV3细胞中观察重组病毒的复制能力及感染效率，确定感染率达90%以上的最小MOI。用MTT法观察感染重组病毒的SKOV3细胞对5FC或GCV的敏感性，并计算IC50；观察一定MOI的rAdE1ACDglyTK或重组复制缺陷型腺病毒rAdCDglyTK与IC50的5FC和(或)GCV联合应用对SKOV3细胞生长的抑制作用。结果: 经PCR和琼脂糖凝胶电泳证实，纯化重组腺病毒中存在E1A和CDglyTK两个基因片段，其病毒颗粒浓度和感染性滴度分别为9.47×1011VP/ml和3.16×1010IU/ml，病毒比活性为3.34%。重组病毒可在SKOV3细胞中复制，对SKOV3细胞的感染效率随MOI的增加而增加，可致细胞感染率达90%以上的最小MOI为50 IU/cell。5FC或GCV明显抑制感染细胞的生长，且存在明显的剂量依赖效应。两种重组腺病毒/前药系统的抑瘤作用比较显示，rAdE1ACDglyTK组细胞生长抑制率\[(16.57±1.59)%\]显著高于rAdCDglyTK组\[(10.44±1.80)%，P<0.01\]；与IC50的5FC和GCV双药联合应用，其抑制率达(71.68±2.63)%，显著高于rAdCDglyTK/5FC+GCV组的(63.64±2.91)%（P<0.01）。结论: 重组腺病毒rAdE1ACDglyTK与酶前体药物联合应用对卵巢癌SKOV3细胞具有显著的抑制作用，其效果优于重组复制缺陷型腺病毒rAdCDglyTK。     

肿瘤细胞CAR表达水平与5型腺病毒转导效率的关系

目的: 通过体外、体内实验探讨肿瘤细胞柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor, CAR)表达水平与腺病毒转导效率的关系,为腺病毒相关的生物制剂在临床个体化应用提供实验依据.方法: 将载有绿色荧光蛋白的Ad5 型腺病毒(Ad-GFP) 以100 MOI、200 MOI分别感染人食管癌细胞系KYSE510、KYSE150、EC9706、人宫颈癌细胞系HeLa、人卵巢癌细胞系SKOV3、人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞系A549,感染后48 h通过流式细胞术检测Ad-GFP对不同细胞系的转导效率.采用Western blotting方法检测这些细胞中CAR的表达水平.将HeLa、A549、SKOV3、EC9706细胞分别接种于裸鼠腋下,接种细胞数分别为3×106、3×106、3×106、2×106,建立裸鼠移植瘤模型.待肿瘤长径达5～7 mm时,在裸鼠移植瘤内注射Ad-GFP,每次1×109PFU,间隔48 h注射第2次.第2次注射后48 h处死裸鼠,剖取瘤组织,荧光显微镜观察冰冻切片中GFP的表达情况以判定腺病毒在瘤体内的转导效率,同时用免疫组化法检测瘤组织内的CAR表达水平.结果: 200 MOI Ad-GFP感染A549、HeLa、HepG2、KYSE150细胞48 h后分别有92.67%、89.31%、84.98%、74.59%的细胞表达GFP;而SKOV3、KYSE510、EC9706细胞中腺病毒的转导效率明显降低,GFP阳性率分别为30.06%、27.40%、18.93%;各种细胞的CAR蛋白表达水平与腺病毒的转导效率呈正相关.注射Ad-GFP的裸鼠移植瘤组织中可见HeLa、A549瘤组织内有明显的点状绿色荧光,而SKOV3、EC9706瘤组织内表达GFP的细胞数明显少于前两种瘤组织;HeLa、A549裸鼠移植瘤组织内大多数瘤细胞高表达CAR ( ),SKOV3、EC9706移植瘤组织内CAR表达水平较低( 或-),表明瘤体内CAR表达水平与Ad-GFP的转导效率也呈正相关.结论: 体内外实验均显示肿瘤细胞的CAR表达水平与5型腺病毒转导效率密切相关.肿瘤患者治疗前检测组织中CAR表达水平有助于规范腺病毒载体的基因治疗药物的个体化使用.     

Bestrophin 3高表达促进人肝癌细胞株HepG2的凋亡

目的：研究Bestrophin 3高表达对人肝癌细胞株HepG2凋亡能力的影响,并初步探讨其作用机制。 方法： 将Bestrophin 3腺病毒以感染复数(multiplicity of infection, MOI)10、20、40、80转染HepG2细胞株,Western blotting检测转染细胞内Bestrophin 3的表达,确定最佳MOI值。设对照组（未转染病毒）、LacZ组（转染携带LacZ的对照腺病毒载体）、Ad-Best3组（以最佳MOI值转染Bestrophin 3腺病毒）,CCK-8法和流式细胞术分别检测Bestrophin 3过表达对HepG2细胞增殖、凋亡的影响,Western blotting检测Bestrophin 3过表达对HepG2细胞内Bcl-2、Bax以及细胞色素C表达的影响,JC-1染色观察Bestrophin 3过表达对HepG2细胞线粒体膜电位的影响。 结果： Bestrophin 3腺病毒转染HepG2细胞的最佳MOI为40,转染后细胞过表达Bestrophin 3。Ad-Best3组的细胞存活率显著低于对照组和LacZ组\[(79.37±1.76)% vs (98.67±3.02)%、(99.67±325)%,均P<0.05\],而其细胞凋亡率显著升高\[（29.47±2.37）% vs （5.47±0.37）%,（4.95±0.44）%,均P<0.05\]。 Ad-Best3组HepG2细胞内Bcl-2的蛋白表达显著减少,Bax的蛋白表达显著增加,导致Bcl-2/Bax比值显著降低（0.32±0047 vs 1.00±000, P<0.05）;Ad-Best3组HepG2细胞的线粒体膜电位显著降低 \[(0.64±0.09)% vs （1.00±0.00)%, P<0.05\],同时线粒体中细胞色素C明显减少（P<0.05）,而细胞质中细胞色素C水平显著升高（P<0.05）。结论：过表达Bestrophin 3可能通过促使线粒体释放细胞色素C从而促进肝癌细胞株HepG2的凋亡。     

低氘水对肺癌细胞增殖的抑制作用及其可能的机制

目的：初步探讨低氘水（deuteriumdepleted water,DDW）在体内外对人肺癌细胞增殖的抑制作用及其可能机制。方法：MTT法检测DDW对肺癌A549细胞和正常人胚肺成纤维细胞HLF1增殖的抑制作用,TUNEL法检测A549细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期的变化。建立BALB/c裸鼠人肺癌H460细胞移植瘤模型,低氘水饮用60 d后观察裸鼠移植瘤的生长情况。结果：与对照组比较,培养10 h时体积分数为0.0025％、0.0050％和0.0105％的DDW对A549 细胞增殖具有显著抑制作用（P<0.05）,随后抑制作用消失,48 h后又逐渐出现抑制现象,72 h抑制作用显著（P<0.05）;相同条件下不同体积分数的DDW对正常人胚肺成纤维细胞HLF1无显著抑制作用。TUNEL染色显示,0.005%DDW作用后A549细胞出现凋亡,凋亡率显著高于对照组细胞\[（25.38±3.90）% vs (10.87±1.11)%), P<0.05\]。流式细胞仪检测显示,DDW作用后A549细胞S期细胞显著增加（P<0.05）。人肺癌细胞H460移植瘤裸鼠饮用DDW后,能够明显提高裸鼠的生活质量,抑瘤率达30.08%。结论：DDW对肺癌细胞增殖的抑制作用仅限于一定的剂量范围,且具有波动性和时段性的特点;其机制可能与诱导肺癌细胞S期阻滞和细胞凋亡有关。     

Selective effects of a fiber chimeric conditionally replicative adenovirus armed with hep27 gene on renal cancer cell

Adenoviruses mediated cancer gene therapies are widely investigated and show a promising effect on cancer treatment. However, efficient gene transfer varies among different cancer cell lines based on the expression of coxsakie adenovirus receptor (CAR). Hep27, a member of dehydrogenase/reductase (SDR) family, can bind to Mdm2, resulting in the attenuation of Mdm2-mediated p53 degradation. Here we constructed a fiber chimeric adenovirus carrying hep27 gene (F5/35-ZD55-Hep27), in which the fiber protein of 5-serotype adenovirus (Ad5) was substituted by that of 35-serotype adenovirus (Ad35), aiming to facilitate the infection for renal cancer cells and develop the role of hep27 in cancer therapy. We evaluated the CAR and CD46 (a membrane cofactor protein for Ad35) expression in four kinds of renal cancer cells and assessed the relationship between receptors and infection efficiency. 5/35 fiber-modified adenovirus had a much promising infectivity compared with Ad5-based vector in renal cancer cells. F5/35-ZD55-Hep27 had enhanced antitumor activity against human renal cancer cells compared to the other groups. Further, hep27 mediated p53 and cleaved-PARP upregulation and mdm2 downregulation was involved and caused increased apoptosis. Moreover, F5/35-ZD55-Hep27 significantly suppressed tumor growth in subcutaneous renal cancer cell xenograft models. Our data demonstrated that 5/35 fiber-modified adenovirus F5/35-ZD55-Hep27 transferred into renal cancers efficiently and increased p53 to induce cancer cell apoptosis. Thus 5/35 fiber-modified adenoviral vector F5/35-ZD55-Hep27 might a promising vector and antitumor reagent for renal cancer gene therapy.     

Testin在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达及其对癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨Testin基因(TES)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞株中的表达及其对人肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响.方法:收集2015年1月至2015年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院手术切除的27例NSCLC患者的癌组织及癌旁组织标本,用Western blotting法检测癌组织和癌旁组织,以及正常人胚肺成纤维细胞株MRC5和肺癌细胞株A427、A549、H1299、LK2、PC9和SW900中TES蛋白的表达水平.应用短发卡RNA(shRNA)瞬时转染肺癌细胞株A549干扰TES基因的表达,并进一步检测TES低表达对A549细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响,同时检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cas-pase-3的表达.结果:在NSCLC组织和细胞株中TES蛋白的表达明显下降(均P＜0.05).shTES干扰A549细胞后,TES mRNA和蛋白表达水平均显著下降(均P＜0.05).抑制TES表达显著增强A549细胞的增殖[(2.75±0.04) vs (1.79±0.06),P＜0.05]、迁移[(52.3±2.6)％s(19.7±1.4)%,P＜0.05]和侵袭能力[(31.2±3.9)％vs(14.5±4.1)％,P＜0.05],同时降低了细胞凋亡率[(8.2±1.1)％s(23.1±1.7)％,P＜0.05].TES低表达使A549细胞Bax和Caspase-3蛋白表达明显下降(P＜0.05)、Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05).结论:TES在NSCLC组织中呈低表达,TES表达下调具有促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡等生物学效应,其有可能成为肺癌治疗一个新靶点.     

Concomitant use of Ad5/35 chimeric oncolytic adenovirus with TRAIL gene and taxol produces synergistic cytotoxicity in gastric cancer cells

Chimeric adenoviral vectors possessing fiber derived from human adenovirus subgroup B (Ad35) have been developed for their high infection efficiency in cell types which are refractory to adenovirus serotype 5 (Subgroup C). The present study constructed an E1B-deleted chimeric oncolytic adenovirus, SG235-TRAIL, which carries a human TRAIL gene expression cassette and whose fiber shaft and knob domains are from serotype Ad35. It was found that SG235-TRAIL preferentially replicated in gastric cancer cell lines, SGC-7901 and BGC-823 compared to in normal human fibroblast BJ cells. Also, when compared with a replication-deficient chimeric vector Ad5/35-TRAIL, SG235-TRAIL mediated a higher level of the transgene expression via viral replication in the cancer cells. Further, because of the more efficient cell-entry and infection, SG235-TRAIL induced stronger cell apoptosis than the Ad5 CRAD vector, ZD55-TRAIL. In addition, SG235-TRAIL in combination with the chemotherapeutic drug, taxol, produced a synergistic cytotoxic effect in cancer cells in vitro without causing significant toxicity to normal cells. In the gastric tumor xenograft mouse model, intratumoral SG235-TRAIL injection produced a significant antitumor effect 14 days after treatment. Pathological examination demonstrated TRAIL expression and associated apoptosis in majority of SG235-TRAIL-treated tumor cells. These results suggest that SG235-TRAIL is a potential novel, efficient anti-cancer agent, and in combination with taxol, it would be even more useful with considerably low toxic side effects.     

miR-769-5p在非小细胞肺癌中的表达及其对细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

目的 探讨微小RNA-769-5p （miR-769-5p） 在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）技术检测miR-769-5p 在5种NSCLC细胞（A549、NCI-H1299、NCI-H157、ANIP-973和GLC-82）中的相对表达量,选择相对表达量最低和最高的细胞株分别转染miR-769-5p mimics／miR-769-5p inhibitor,另设miRNA mimics control／inhibitor control对照组;采用MTS 实验、克隆形成实验及Transwell 小室实验检测miR-769-5p对NSCLC 细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力的影响。结果 miR-769-5p在A549、NCI-H1299、NCI-H157、ANIP-973 及GLC-82细胞中的相对表达量分别为 0.06、0.40、0.09、1.04和2.31。在miR-769-5p表达水平最低的A549细胞中瞬时转染miR-769-5p mimics,在miR-769-5p表达水平最高的GLC-82细胞中瞬时转染miR-769-5p inhibitor。MTS结果显示,与对照组比较,miR-769-5p mimics 能够抑制A549细胞的增殖 （P＜0.05）,而miR-769-5p inhibitor能够促进GLC-82细胞的增殖 （P＜0.05）。平板克隆实验结果显示,与对照组比较,miR-769-5p mimics 能够抑制A549细胞的平板克隆形成数 （124.7±14.7 vs. 399.4±46.0,P＜0.05）;而miR-769-5p inhibitor能够促进GLC-82细胞的平板克隆形成数 （555.7±29.7 vs. 366.3±28.7,P＜0.05）。Transwell实验结果显示,与对照组迁移和侵袭跨膜细胞数比较,miR-769-5p mimics能够抑制A549细胞的迁移和侵袭 （94.4±18.1 vs. 157.8±22.9,84.4±15.1 vs. 135.6±16.7,P＜0.05）;miR-769-5p inhibitor能够促进GLC-82细胞的迁移和侵袭 （226.7±40.3 vs. 153.3±38.7,196.7±39.1 vs. 138.9±40.4,P＜0.05）。结论 miR-769-5p可以抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移,可能成为NSCLC的潜在靶点。     

Metuzumab enhanced chemosensitivity and apoptosis in non-small cell lung carcinoma

Targeted therapeutics is used as an alternative treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC); however, treatment effect is far from being satisfactory, and therefore identification of new targets is needed. We have previously shown that metuzumab inhibit tumor growth in vivo. The present study was performed to investigate the anti-tumor efficacy of metuzumab combined with gemcitabine and cisplatin (GP), paclitaxel and cisplatin (TP) or navelbine and cisplatin (NP) regimens in multiple NSCLC cell lines. Our results demonstrate that, in comparison to single agent metuzumab or GP treated cells, metuzumab combined with GP display inhibitory effects on tumor growth. Furthermore, we found that metuzumab elevated the sensitivity of cell lines to gemcitabine, which was identified by MTT assay. Flow cytometric analysis showed that metuzumab combined with gemcitabine (GEM) treatment led to an obvious G1 arrest and an elevated apoptosis in A549, NCI-H460 and NCI-H520 cells. Western blot analysis also demonstrated a significantly reduced level of cyclin D1, Bcl-2, and an obviously increase level of Bax and full-length caspase-3 in A549, NCI-H460 and NCI-H520 cells treated with metuzumab/gemcitabine combination in comparison with single agent treated cells. In addition, metuzumab/gemcitabine treated A549, NCI-H460 and NCI-H520 cells also demonstrated a significantly increase in deoxycytidine kinase (dCK) protein level compared with single agent metuzumab or gemcitabine treated cells. Xenograft models also demonstrated that this metuzumab/gemcitabine combination led to upregulation of dCK. Taken together, the mechanisms of metuzumab combined with GP repress tumor growth were that the combined treatment significantly inhibited the tumor cell proliferation, apoptosis and cell cycle in vitro and in vivo and at least partially by induction of dCK expression. Our results suggested that metuzumab could significantly enhance chemosensitivity of human NSCLC cells to gemcitabine. Metuzumab/gemcitabine combination treatment may be a potentially useful therapeutic regimen for NSCLC patients.     

A novel fiber chimeric conditionally replicative adenovirus-Ad5/F35 for tumor therapy

Significant progress has been made in the diagnosis and treatment of cancer; however, significant challenges remain. Conditionally replicating adenoviruses (CRAds), which not only kill cancer cells, but also serve as vectors to express therapeutic genes, are a novel and effective method to treat cancer. However, most adenoviruses are Ad5, which infect cells through the coxsackie and adenovirus receptor (CAR). The transduction efficacy of Ad5 is restricted because of the absent or low expression of CAR on several cancer cells. Ad serotype 35 has a different tropism pattern to Ad5. Ad35 attaches to cells via a non-CAR receptor, CD46, which is expressed widely on most tumor cells. Thus, chimeric adenoviral vectors consisting of the knob and shaft of Ad35 combined with Ad5 have been constructed. The chimeric fiber adenoviral vectors can transduce CAR-positive and CAR-negative cell lines. In this review, we explore the application of the novel fiber chimeric conditionally replicative adenovirus-Ad5/F35 in tumor therapy in terms of safety, mechanism, transduction efficacy, and antitumor effect.     

Vacquinol-1对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨Vacquinol-1对非小细胞肺癌细胞系A549、NCI-H1299细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。方法:以不同浓度的Vacquinol-1作用于A549和NCI-H1299细胞,应用CCK-8法检测其对细胞增殖能力的影响;以半数致死浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）作用于细胞,流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测细胞的凋亡情况;Western blotting法检查凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达的变化情况。结果:CCK-8结果显示Vacquinol-1能显著抑制A549、NCI-H1299细胞的增殖能力;并且流式细胞术检测结果显示Vacquinol-1能诱导A549、NCI-H1299细胞的凋亡;Western blotting结果显示Vacquinol-1促进A549、NCI-H1299细胞Caspase-3、Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。结论:Vacquinol-1能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,并且通过激活线粒体通路诱导细胞凋亡。     

PAGE5对非小细胞肺癌细胞生长、凋亡和侵袭能力的影响

目的：探讨前列腺相关基因5（PAGE5）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其对肺癌细胞生物学行为的影响。方法：采用实时定量PCR和Western blot方法检测37例NSCLC及其癌旁组织中PAGE5的表达;采用MTT法、流式细胞术、Transwell以及Western blot法检测转染PAGE5 siRNA对A549和H1299细胞生长、凋亡、侵袭以及Bax、Bcl－2和MMP－2表达的影响。结果：在37．84％（14／37）的肺癌组织样本中PAGE5基因表达上调。转染PAGE5 siRNA的A549和H1299细胞生长无明显变化、细胞凋亡显著增加、侵袭能力显著下降（P＜0．05）,Bax蛋白表达显著上调,Bcl－2和MMP－2蛋白表达显著下调（P＜0．05）。结论：PAGE5可能通过调控Bax、Bcl－2及MMP－2蛋白的表达影响NSCLC细胞的生长、凋亡与侵袭,有望成为肺癌诊断标志物及潜在的治疗靶点。     

腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用

目的:以增殖缺陷型腺病毒载体介导p16基因感染人肺腺癌细胞系,观察并鉴定该基因在细胞中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响.方法:采用293细胞内同源重组的方法,制备重组腺病毒Ad5-p16,感染肺腺癌细胞SPC-A1;免疫组化方法鉴定P16蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果:以M0I=10的重组增殖缺陷型腺病毒Ad5-p16感染SPC-A1细胞48 h后,P16蛋白表达的阳性细胞比率为71%;以MOI=100感染SPC-A1细胞后第2天,细胞开始出现生长抑制及细胞病变;FCM分析发现细胞在感染腺病毒后出现细胞周期阻滞和细胞凋亡.结论:以腺病毒为载体介导p16基因在SPC-A1细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡的作用.本项基因治疗策略以直接调控细胞周期的抑癌基因为靶向治疗基因,为肺癌基因治疗提供了可靠的理论依据.