反义核酸--研究基因功能的有效工具

反义核酸作为新药开发的重要途径 ,正被广泛应用于病毒性疾病、高血压病、心血管病、白血病等疾病治疗领域药物的研究中。目前 ,已有不少反义核酸药物进入临床 ,也已有经 FDA批准的新药上市。近年来 ,随着基因功能研究的深入和新基因的不断发现 ,作为基因表达抑制剂的反义核酸被越来越多地应用于与信号传导、细胞凋亡、胚胎发育等过程相关的基因功能的研究之中。迄今为止 ,已有针对诸如 ICAM- 1、p5 3、n NOS、cyclin D1、Rho A等多个基因分别应用反义核酸抑制其表达 ,进而确证基因功能的成功范例。随着反义技术的迅速完善 ,反义核酸必将在后基因组时代对基因功能的研究中发挥出更重要的作用。     

反义核酸技术及其在恶性黑素瘤中的应用进展

恶性黑素瘤对化疗等多种通过凋亡途径杀伤肿瘤细胞的治疗方法疗效均不理想。近年来利用反义核酸技术选择性地封闭与细胞增殖、凋亡及耐药密切相关的靶基因,在恶性黑素瘤研究中取得了较大进展,为恶性黑素瘤的治疗提供了新的途径。体内外研究结果显示反义核酸治疗可有效抑制黑素瘤细胞增殖、促进细胞凋亡及逆转细胞耐药性。特别是针对抗凋亡基因BCL-2的反义核酸已作为一种最有希望的反义核酸药物同化疗药物联合用于恶性黑素瘤Ⅲ期临床试验。     

K-ras反义核酸抑制肺腺癌细胞A549的生长

目的: 探讨K-ras反义核酸抑制肺癌生长的机制。方法: 应用Western blotting检测K-ras基因在6例肺腺癌标本和A549细胞中的表达;构建K-ras基因的反义表达载体(命名为antisense-K-ras-pcDNA3.1),转染后,MTT法测细胞的生长曲线,Annexin V检测细胞凋亡;Western blotting检测cyclin A、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、P53、Rb和caspase-3的表达。结果: 在A549细胞和6例肺腺癌标本中,A549细胞和4例标本中K-ras基因高表达;MTT结果显示从第4 d开始,转染K-ras反义核酸的细胞生长明显受到抑制,而且细胞凋亡现象较明显;Western blotting显示转染反义K-ras基因的细胞中cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的表达降低,而caspase-3、P53和Rb的表达升高。结论: K-ras基因反义核酸能够抑制细胞生长,可能与cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的表达降低和caspase-3、P53、Rb的表达升高有关。     

Caspase-3 mRNA反义核酸对γ-射线诱导的HL-60细胞凋亡的影响

目的　观察caspase 3mRNA反义寡核苷酸 (ASODN)对HL 6 0细胞凋亡的抑制作用 ,筛选有效ASODN。　方法　用脂质体介导法将针对caspase 3mRNA不同序列的 4条ASODN导入HL 6 0细胞中 ,γ 射线照射。应用电泳法检测DNA梯状条带 ;Hoechst332 5 8 碘化丙啶染色 ,荧光显微镜分析凋亡细胞百分率 ;流式细胞术进行细胞凋亡定量。　结果　以caspase 3mRNA 5′非编码区 (- 6 2至 - 4 6位 )与编码起始区 (- 1至 16位 )ASODN转染 ,当转染终浓度≥ 3μmol L时 ,DNA电泳梯状条带消失 ,流式细胞术亦未见明显的亚二倍体峰 ;荧光染色分析 ,凋亡细胞百分率比未转染对照组和错配寡核苷酸对照组显著降低 (P <0 0 1) ,且随转染终浓度的增加 ,凋亡抑制率显著增加。另外 ,5′非编码区ASODN的抑制作用显著强于编码起始区ASODN(P <0 0 5 )。　结论　caspase 3mRNAASODN可抑制γ 射线诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,其作用有序列特异性及剂量依赖性     

Livin反义寡核苷酸对人HL60细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Livin mRNA反义寡核苷酸（ASODN）对人白血病细胞（HL60）增殖及凋亡的影响。方法 用免疫组织化学检测Livin蛋白表达,设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体转染HL60细胞。用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测细胞增殖,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Livin mRNA的表达,原位末端标记技术（TUNEL）、电镜检测细胞凋亡率和形态学改变。结果Livin ASODN在终浓度为600nmol／L作用HL60细胞48h时,能明显地抑制其增殖,降低Livin mRNA的表达,HL60细胞在形态学上出现明显的凋亡改变,细胞凋亡率显著增加 (P<0.01)。结论Livin ASODN可有效抑制HL60细胞的增殖,下调Livin基因表达,并促进HL60细胞凋亡,在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

hTERT 基因反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的 在体外实验中，探讨hTERT反义核酸诱导卵巢癌细胞发生凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与bcl-2和bax之间的关系。方法采用TUNEL染色法，定性、定量地研究hTERT反义核酸与卵巢癌细胞凋亡的关系；通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果hTERT反义核酸在体外能诱导卵巢癌细胞发生凋亡。下调bcl-2的表达，增强bax的表达。结论诱导卵巢癌细胞发生凋亡是hTERT反义核酸抗卵巢癌作用的机制之一。hTERT反义核酸可能通过下调bcl-2的表达及增强bax的表达诱导卵巢癌细胞发生凋亡。     

Ki67反义多肽核酸抑制肾癌生长的体外及动物实验研究

为研究肿瘤增殖基因Ki67反义多肽核酸(AS-PNAs)对人肾癌细胞的体内外抑制作用.将AS-PNAs(10.0μmol/L)转染人肾癌786-0细胞,采用免疫组化、Western印迹技术检测Ki67表达;3H-TdR掺入试验检测细胞增殖;免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。裸鼠移植瘤内注射AS-PNAs(10.0μmol/L)连续4d后,第3、6、12天处死小鼠,取瘤组织检测肿瘤体积、Ki67表达、细胞凋亡。结果发现,AS-PNAs处理组786-0细胞Ki67表达明显降低,3H-TdR掺入率明显降低,细胞凋亡率明显增加,与随机PNAs对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。动物实验AS-PNAs处理组小鼠肿瘤体积明显缩小,Ki-67抗原表达明显降低,细胞凋亡明显增加,与对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。Ki67基囚AS-PNAs在体外及动物体内均有抑制增殖、促进凋亡作用,是一种有前途的反义治疗药物。     

hTERT基因反义核酸提高原代复发急性淋巴细胞白血病细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的反义核酸（AS PS-ODN）能否增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。 方法:采用免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平，以台盼蓝拒染法计数细胞数，通过细胞形态学观察及流式细胞仪细胞周期的分析来检测凋亡。 结果:hTERT基因反义核酸能降低hTERT蛋白的表达。顺铂与hTERT基因反义核酸联合应用能明显抑制培养原代细胞的增殖，与单用顺铂组比较P<0.05。凋亡检测，用药48 h后，单用顺铂、顺铂联用反义核酸或正义核酸组，经Hoechst33258和PI双染法观察细胞均表现典型的细胞凋亡的形态学改变；顺铂联用反义核酸组，细胞的凋亡率明显高于单用顺铂组（P<0.05）。 结论:hTERT基因反义核酸能增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。     

小鼠β_2m反义核酸重组荧光蛋白表达载体的构建及表达研究

本研究应用分子生物学技术 ,构建小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN ,经过酶切、PCR鉴定 ,以及序列分析证实克隆的正确性。然后用脂质体转染NIH3T3细胞 ,经过RT PCR及Westernblot检测 ,观察重组质粒对细胞β2 mmRNA和蛋白表达的影响 ,同时在荧光显微镜下直接观察细胞转染的结果。结果证明pEGFP β2 mAN已成功导入NIH3T3细胞中 ,且有效表达 ,在荧光显微镜下可见梭形绿色荧光细胞 ;与同步转染的小鼠 β2 m正、反义核酸表达载体pcDNA3 β2 mSN、pcDNA3 β2 mAN的转染结果一起进行分析 ,转染pcDNA3 β2 mSN细胞的 β2 mmRNA和蛋白表达水平升高 ,而转染pcD NA3 β2 mAN和pEGFP β2 mAN的细胞 β2 mmRNA和蛋白表达水平降低。小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN的转染结果显示 :它不但可以降低NIH3T3细胞 β2 m基因的表达 ,而且为观察脂质体转染效果提供了直观、即时的方法     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。     

hTERT基因反义核酸促进顺铂诱导原代急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的研究

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASPS-ODN)抑制人原代急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞hTERT基因表达后,观察顺铂对ALL细胞凋亡的影响。方法:采用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达量的变化;以台盼蓝拒染法计数细胞数,确定细胞的增殖情况;Hoechst33258和PI双染色法观察凋亡细胞的形态变化;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果:hTERT反义核酸作用于ALL细胞72hhTERT蛋白表达阳性率为(32.17±3.00)%,与空白对照组(66.31±2.84)%及正义核酸作用组(62.56±6.11)%比有显著差异(P<0.05);而正义核酸作用组与空白对照组比无显著差异(P>0.05)。hTERT反义核酸作用于ALL细胞24h加入顺铂,再共同作用48h,ALL活细胞均数为1.750×10⁸cells/L,与单用顺铂组(2.090×10⁸cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组(1.990×10⁸cells/L)相比,对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERTASPS-ODN作用于ALL细胞24h再加入顺铂作用48h,细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERTASPS-ODN与25μmol/L顺铂联合作用于ALL细胞48h的凋亡细胞百分率(37.85±2.44)%分别同SPS-ODN与顺铂联合作用组(15.16±2.8)。     

hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Jurkat细胞凋亡的影响

目的:用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Jurkat细胞端粒酶活性后, 观察化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对Jurkat细胞凋亡的影响。方法:采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对Jurkat细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果: hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙, 对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide, SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比, 无显著差异(P>0.05) 。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂, 分别与SODN联合顺铂作用组、单用顺铂作用组相比, 对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂作用48 h, 细胞出现典型的凋亡形态学改变, 经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带, 而SODN与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到DNA梯形条带。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于Jurkat细胞48h的凋亡细胞百分率(25.18±3.63)%分别同SODN与顺铂联合作用组(10.07±2.12)%、单用顺铂作用组(9.73±2.43)%进行比较有显著差异(P<0.01)。 结论:hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Jurkat细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸联合化疗药物诱导儿童急性白血病细胞凋亡的实验研究

目的研究Survivin基因在儿童急性白血病细胞中的表达,Survivin反义寡核苷酸对儿童急性白血病细胞凋亡的影响,并探讨反义寡核苷酸与传统化疗药物对白血病的协同治疗作用。方法用PCR的方法检查儿童白血病细胞Sur-vivin表达,将Survivin基因反义寡核苷酸转染入白血病细胞,用TUNEL及流式细胞仪检查各组细胞的凋亡率。结果Sur-vivin基因在儿童急性白血病细胞中高表达,Survivin反义寡核苷酸及足叶乙甙均能够单独诱导白血病细胞凋亡,两者合用时细胞凋亡率更高。结论Survivin在儿童急性白血病细胞中高表达;Survivin反义寡核苷酸可诱导白血病细胞凋亡;Sur-vivin反义寡核苷酸可促进足叶乙甙诱导的儿童急性白血病细胞凋亡。     

反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究

目的： 研究反义c-myc寡核苷酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法： 设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞，通过MTT法、流式细胞仪、HE染色及透射电镜方法，观察和分析其对人骨肉瘤MG-63细胞作用的效果。结果： MTT法示反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖，10.0 μmol/L、作用48 h效果最明显；流式细胞仪检测证实反义c-myc寡核苷酸（终浓度10.0 μmol/L）诱导瘤细胞的凋亡率达37.92%，出现明显的凋亡峰，并可抑制c-myc基因蛋白的表达；细胞呈典型凋亡特征。结论： 反义c-myc寡核苷酸能有效诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

Bcl-2反义核酸增强HL-60、K562细胞对柔红霉素敏感性的研究

目的:研究bcl-2反义寡核苷酸作用后,白血病细胞株HL60、K562细胞对柔红霉素(DNR)敏感性的影响。方法:MTT法测HL60、K562细胞中DNR的半数抑制率(IC50);免疫荧光标记观测细胞Bcl-2蛋白水平;用Hoechest33258和碘化丙锭双染色法及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:靶向bcl-2mRNA蛋白编码区反义寡核苷酸(AS-ODN1)和靶向翻译起始区的反义寡核苷酸(AS-ODN2)分别与DNR联合作用于HL60细胞后DNR的IC50值分别为0.124±0.011、0.149±0.012,分别与不加寡核苷酸组DNR的IC50值(0.173±0.021)或无义寡核苷酸联用DNR的IC50值(0.180±0.023)相比有显著差异,P＜0.05。AS-ODN1和AS-ODN2分别与DNR联合作用于K562细胞后DNR的IC50值分别为0.078±0.007、0.079±0.008,分别与不加寡核苷酸组DNR的IC50值(0.106±0.011)或无义寡核苷酸联用DNR的IC50值(0.107±0.012)相比有显著差异,P＜0.05。AS-ODN1和AS-ODN2分别与DNR同时作用于HL60或K562细胞后抑制Bcl-2蛋白表达及诱导细胞凋亡率分别与单用DNR或无义寡核苷酸联用DNR相比有显著差异,P＜0.05。与AS-ODN2比较,AS-ODN1提高HL60细胞对DNR的敏感性作用要强些(P＜0.05)。结论:靶向bcl-2mRNA蛋白编码区反义寡核苷酸和靶向翻译起始区的反义寡核苷酸能增强HL60和K562细胞对DNR的敏感性。     

反义bcl-2硫代磷酸寡脱氧核苷酸对小细胞肺癌细胞株NCI-H446的抑制作用及诱导细胞凋亡的研究

目的:观察反义bcl-2硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN)对小细胞肺癌细胞株NCI-H446mRNA、蛋白以及增殖、活力和凋亡的影响。方法: 合成bcl-2AS-PS-ODN作用于小细胞肺癌细胞株NCI-H446, 半定量RT-PCR检测bcl-2mRNA表达;免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测Bcl-2蛋白表达;通过克隆形成率、细胞计数、流式细胞仪DNA倍体分析、TUNEL等指标观察bcl-2 AS-PS-ODN对细胞增殖、活力和凋亡的影响。结果:①bcl-2 AS-PS-ODN能特异性地降低NCI-H446细胞bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白的表达。1μmol/LAS-PS-ODN作用24h后bcl-2mRNA表达量下降69.5%, 48h后Bcl-2蛋白下降62.7%。②bcl-2 AS-PS-ODN能够抑制细胞增殖和活力, 诱导细胞凋亡, 1μmol/LAS-PS-ODN作用24h后, 细胞凋亡率约为22.3%-32.7%。结论:bcl-2 AS-PS-ODN能够特异性降低bcl-2mRNA、蛋白表达, 抑制NCI-H446细胞的增殖和活力, 并诱导细胞凋亡。     

CFTR对TF1细胞活力和凋亡的影响及相关机制

目的:探讨囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)在急性髓系白血病中的表达情况并探讨其对人红白血病细胞株TF1生物学功能的影响及潜在作用机制。方法:Real-time PCR技术检测急性髓系白血病患儿骨髓单个核细胞中CFTR的表达水平。常规培养的TF1细胞中加入CFTR特异性抑制剂CFTRinh-172,然后分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力、细胞周期及细胞凋亡情况;Western blot检测Wnt信号通路相关蛋白的表达水平。结果:CFTR在急性髓系白血病患者及白血病细胞中均呈高表达。TF1细胞中加入CFTR特异性抑制剂后,细胞的活力下降,G_0/G_1期细胞比例显著升高而S期细胞比例降低,细胞凋亡率显著增加,细胞中β-catenin、c-Myc及cyclin D1的蛋白表达水平显著降低(P0.05)。结论:CFTR在急性髓系白血病中表达显著升高;抑制CFTR可通过经典的Wnt信号通路抑制白血病细胞株TF1的生长,并促进其凋亡。     

三七皂甙R1诱导HL-60细胞凋亡的初步研究

目的：观察三七皂甙R1是否能诱导人白血病细胞株HL-60细胞凋亡及相关基因的变化。方法：300～1200μg／ml^-1三七皂甙R1处理HL-60细胞，光镜下观察细胞形态；MTT法测细胞生长抑制率；流式细胞仪检测凋忘峰。结果：300～1200μg／ml^-1三七皂甙R1可抑制HL-60细胞生长，抑制率有剂量依赖性。流式细胞仪检测凋亡峰随药物浓度增大而增加。结论：三七皂甙R1可抑制HL-60细胞生长，诱导其凋亡。     

转染肿瘤坏死因子-α及MDR1反义RNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的:转染肿瘤坏死因子-α(TNF-α)cDNA和多药耐药基因(MDR1)的反义RNA到乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,并观察它们在乳腺癌耐药逆转中的作用.方法:应用RT-PCR和DNA重组技术构建反义绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,检测转染前后细胞的生长曲线、细胞凋亡程度、MDR1-mRNA和P糖蛋白(P-gp)表达情况及对ADR敏感性的变化.结果:转染后的细胞生长明显减慢,凋亡率显著增加,MDR1-mRNA和P糖蛋白(P-gp)表达明显降低,对ADR的耐药性明显下降,敏感性增加.结论:联合运用不同的逆转耐药机制,将TNF-αcDNA及MDR1反义RNA分别或同时导入乳腺癌耐药细胞中,能有效达到逆转耐药的目的.