母体血浆中游离胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用研究

目的：建立一种从孕妇血浆中检测胎儿DNA的无创性产前诊断新方法。方法：对30例孕7－41周妇女血浆游离DNA进行聚合酶链反应，特异性扩增的胎儿基因为Y染色体上的DYZ1位点，扩增片段的大小为149bp.30例孕妇血浆均经过酚氯仿法提取DNA作为模板，进行聚合酶链反应。结果：20例妊娠男性胎儿孕妇中有17例出现DYZ1基因扩增条带，检出率为85．0％，10例妊娠女性胎儿孕妇中未出现阳性扩增条带，无假阳性结果，本研究中早，中，晚孕期性别符合率分别为80％，80％，90％，总符合率为85．0％，结论：用酚氯仿法提取血浆中的DNA，可以提高模板的浓度和纯度，可改善PCR条件，提高结果的准确性。     

母体血浆中游离胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用研究

目的 建立一种从孕妇血浆中检测胎儿DNA的无创性产前诊断新方法。方法 对30例孕7～41周妇女血浆游离DNA进行聚合酶链反应,特异性扩增的胎儿基因为Y染色体上的DYZ1位点,扩增片段的大小为149bp。30例孕妇血浆均经过酚氯仿法提取DNA作为模板,进行聚合酶链反应。结果 20例妊娠男性胎儿孕妇中有17例出现DYZ1基因扩增条带,检出率为85.0％。10例妊娠女性胎儿孕妇中未出现阳性扩增条带,无假阳性结果。本研究中早、中、晚孕期性别符合率分别为80％,80％,90％,总符合率为85.0％。结论 用酚氯仿法提取血浆中的DNA,可以提高模板的浓度和纯度,可改善PCR条件,提高结果的准确性。     

从母血浆提取胎儿DNA行产前诊断的研究

目的：从孕妇血浆中提取胎儿DNA， 寻找一种非创伤性产前诊断的新方法。方法：采用煮沸法从血浆中提取DNA，结合巢式聚合酶链反应技术对40例10－40孕周的孕妇血浆中的胎儿DNA进行特异性扩增，扩增的基因为Y染色体的重复序列（DYZ1）基因，扩增片段大小为102bp。结果：30例孕育男性胎儿孕妇中有26例血浆中出现DYZ1基因扩增带。10例孕育女性胎儿孕妇血浆中，仅1例出现假阳性结果。结论：采用巢式聚合酶链技术在不同的孕期检测母体血浆中的胎儿DNA均有较高的灵敏度和特异性，作为一种非创伤性产前诊断的方法应用于临床具有可行性。     

巢式PCR扩增孕妇血浆中胎儿ZFY基因的研究

目的：建立一种无创伤性产前基因诊断的方法。方法：自行建立巢式PCR方法对46例10～40孕周的初孕妇血浆中游离胎儿Y染色体ZFY基因进行扩增，扩增片段分别为354bp和307bp，46例均采用母体血浆直接作为模板进行巢式PCR。结果：39例妊娠男性胎儿孕妇血浆中有32例出现ZFY基因条带，检出率为82．1％(32／39)，其中24例2次扩增均为阳性，8例第2次扩增才出现阳性条带，巢式PCR可明显提高检测敏感性(从61．5％提高到82．1％)。7例妊娠女性胎儿孕妇血浆2次均未出现阳性扩增带，无假阳性结果。本研究的性别总符合率为84．8％(39／46)。结论：巢式聚合酶链反应检测母体血浆中游离胎儿DNA的敏感性和特异性较高，有希望成为无创伤性产前基因诊断方法应用于临床。     

应用引物延伸预扩增反应技术检测孕妇血浆中的胎儿DNA

目的：建立一种检测孕妇血浆中胎儿DNA的新方法。方法;对65例5－41孕周的孕妇血浆中胎儿DNA采用引物延伸预扩增（PEP）后行特异性位点聚合酶链反应（PCR）扩增,并用探针微孔板杂交法检测PCR产物。扩增的基因为Y染色体短臂SRY基因,扩增片段的大小分别为351bp和254bp。结果：46例妊娠男性胎儿的孕妇中41例血浆中出现SRY基因扩增带,检出率89．13％;19例妊娠女性胎儿的孕妇中3例（15．79％）为假阳性。本研究孕早、中、晚期的性别符合率分别为100％、90．91％、75％,总符合率86．15％。结论：利用PEP法能解决孕妇外周血中胎儿细胞数量太少达不到常规扩增条件所要求的最低模板量的问题,同时配合探针微孔板杂交法能使诊断结果更准确。     

应用实时荧光定量PCR检测母血浆胎儿DNA进行RhD基因型产前诊断

目的建立实时荧光定量PCR(real time PCR)技术检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿RhD基因型的方法。方法通过微量DNA抽提技术提取母血浆中胎儿游离DNA,利用Real time PCR检测22例妊娠15～40周的单胎RhD阴性孕妇血浆中胎儿游离DNA,进行男性性别决定基因(SRY)和RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,基因型结果与血清学RhD定型结果对比,评价该技术方法的准确性。结果孕妇血浆中存在游离胎儿DNA。19例RhD真阴性孕妇血浆中,14例均检测到胎儿游离DNA的RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,判断为RhD阳性,基因定型结果与血清学表型相符。3例未检测到胎儿游离DNA的RhD基因特异性扩增,结果与胎儿血清学表型相符。因此检测胎儿游离DNA的RhD基因型准确率达到89.5%。另外2例只检测到RhD基因外显子10扩增,通过新生儿脐血血清学吸收放散试验确定为RhDel型。3例RhDel型孕妇血浆中检测到RhD基因扩增,不适于胎儿RhD基因型的分型。结论实时荧光定量PCR方法检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性诊断胎儿RhD基因型...     

对孕妇外周血中的单个有核红细胞及游离DNA来源的鉴定

目的：探讨孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞及游离DNA在非创伤性产前诊断的可行性。方法：对116个孕妇外周血进行检测。（1）对51例14－26孕周的妇女外周血经密度梯度离心后用显微操作分离单个有核红细胞。（2）提取65例孕妇（5－40孕周）外周血血浆DNA。（3）应用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增单个有核红细胞的男性SRY基因,应用引物延伸预扩增（PEP）法及巢式PCR扩增孕妇血浆游离DNA的SRY基因。结果（1）分选单个有核红细胞的成功率为90．20％（46／51）。（2）单细胞SRY基因的结果与胎儿实际性别的符合率为82．61％（38／46）,敏感性为80．00％（24／30）,特异性为87．50％（14／16）。（3）游离DNA的SRY基因的结果与胎儿实际性别的符合率为90．77％（59／65）,敏感性为89．13％（41／46）,特异性为94．74％（18／19）。结论（1）孕妇外周单个有核红细胞及游离的DNA可来自胎儿,它可成为产前诊断的胎儿物质来源。（2）单细胞分离技术使孕妇外周血中的胎儿有核红细胞的分选纯度几乎达到100％。解决了母胎细胞混合的难题,为非创伤性产前诊断提供了一条新思路。     

利用孕妇血浆中胎儿DNA检测胎儿的ABO血型研究

目的：探讨一种胎儿ABO血型的无创性产前诊断方法。方法：从28例健康孕妇血浆中提取胎儿DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）法检测胎儿ABO血型,通过出生后全血血清学检测证实。结果：28例样本中,产前检查能正确显示胎儿血型的有22例,总准确率为78．6％。结论：利用孕妇血浆中胎儿DNA诊断胎儿ABO血型,是一种简便可行的无创性方法,值得推广应用。     

应用巢式PCR扩增孕妇血浆中胎儿SRY基因

目的:利用孕妇血浆中胎儿DNA进行无创产前诊断.方法:对包括10例X连锁隐性遗传病携带者的60例14～22孕周孕妇的血浆DNA进行巢式PCR,扩增胎儿来源的Y染色体特异性SRY基因.结果:38例妊娠男胎的孕妇中32例出现SRY基因扩增带,灵敏度为84.2%.22例妊娠女胎的孕妇中4例出现SRY扩增带,特异性为81.8%,总符合率为83.3%(50/60).10例X连锁隐性遗传病携带者中7例妊娠男胎的孕妇中6例检出SRY基因,3例妊娠女胎的孕妇均未检出SRY基因.结论:采用巢式PCR技术检测母体血浆中的胎儿DNA进行产前性别鉴定具有较高的灵敏度和特异性,在遗传病的产前诊断中具有很大的应用前景.     

孕妇血浆胎儿DNA定量分析在产前性别诊断中的应用

目的 探索一种早期、快速、非创伤性的围生期胎儿性别的诊断方法。方法 应用即时定量TagMan探针DNA扩增技术，检测6l例妊娠8～39周的正常孕妇游离在血浆内的无细胞胎儿DNA的SRY基因，并有针对性的对部分孕妇检测妊娠过程中及产后母体血浆中代表母体与胎儿DNA总和的β-珠蛋白基因和代表胎儿DNA的SRY基因的变化关系。结果 妊娠第8周可在母体外周血浆中检测出胎儿游离DNA，其数量随妊娠时间增加而增高；30例孕妇血浆中游离DNA检则SRY基因阳性，经证实均为男性胎儿，31例SRY基因阴性，经证实均为女性胎儿，符合率为100％，分娩6个月后，SRY基因基本从母体血浆中消失。结论即时定量TagMan探针DNA扩增技术，检测游离在孕妇血浆内的无细胞胎儿DNA，能早期鉴别胎儿性别，为早期诊断某些选择性遗传性疾病开拓了一条新的途径。     

从母血细胞和血浆提取胎儿DNA效率的比较研究

目的:通过比较全血和血浆中提取的胎儿DNA对诊断结果的影响,寻找最适的非创伤性产前诊断的方法。方法:取28例13-40孕周的孕妇外周血4 ml,等量分装于2个不同的采血管内,分别从两种不同的途径制备模板DNA,采用改良的聚合酶链反应(PCR)技术,对胎儿DYZ-1基因进行产前检测。以出生后直接观察结果作为对照。结果:23例孕育男性胎儿孕妇,从全血和孕妇血浆中提取DNA的DYZ-1基因检出率分别为65%和96%,5例孕育女性胎儿孕妇,没有1例出现假阳性结果。结论:血浆游离DNA直接分析法的检出率相对高于外周血细胞DNA模板制备法,血浆中游离DNA是极为适合的材料来源。     

母源性／胎源性基因组 DNA 中的甲基化特异性鉴定及其在唐氏综合征诊断 中的 价值

目的：研究3号染色体上 RASSF1A 基因、21号染色体上的 AIRE 基因在母源性／胎源性基因组DNA 中的甲基化特异性及产前诊断价值。方法收集30例孕妇（早、中、晚孕期各10例）外周血及胎儿组织,离心分离血浆和血细胞;所有血细胞和胎儿组织基因组 DNA 样本经过甲基化修饰后进行目的基因 PCR,即同时进行3号染色体 RASSF1A、21号染色体 AIRE 基因的甲基化引物和非甲基化引物的扩增;30例血浆基因组 DNA 甲基化修饰后进行 RASSF1A、AIRE 基因的甲基化引物扩增;1例唐氏综合征胎儿和 1例正常胎儿母血浆基因组DNA 甲基化修饰后,进行 AIRE 和 RASSF1A 基因的甲基化引物扩增,电泳后的目的条带进行 Gel －pro analyzer 软件光密度值分析。结果30例胎儿组织标本和30例母血细胞标本,均提取出基因组 DNA。胎盘组织 AIRE、RASSF1A 基因甲基化引物扩增出目的条带;母血细胞 AIRE、RASSF1A 基因非甲基化引物扩增出目的条带。RASSF1A、AIRE 基因存在母源性／胎源性的甲基化差异（P ＜0．05）;此差异性不受年龄、孕产史、妊娠阶段等妊娠状态的影响（均 P ＞0．05）。在保证30例血浆标本存在基因组 DNA 的前提下,进行 AIRE、RASSF1A 基因的 MS －PCR 扩增,阳性率分别为73％、77％。通过3号染色体上 RASSF1A 基因的对比消除误差因素影响,唐氏综合征胎儿和正常胎儿母血浆游离胎儿 DNA 进行21号染色体上的 AIRE 基因浓度对比,的确存在3∶2的数量关系。结论人类3、21号染色体上存在母源性／胎源性甲基化表观遗传学差异（即母体是非甲基化的而胎儿阶段是甲基化的修饰状态）,并且不受妊娠阶段、年龄和孕产史等妊娠状态的影响,是一种很好的胎儿遗传学标记;利用母源性／胎源性甲基化差异可以进行母血浆中胎儿 DNA 的鉴定,甲基化引物扩增出来的目的基因一定是胎儿基因,可以保证胎儿 DNA 的纯度和可信度;待检测标本的母血浆基因组 DNA 和正常胎儿母血浆基因组 DNA 甲基化修饰后,进行 AIRE 基因甲基化引物扩增,两者的 AIRE 基因定量对比代表着21号染色体数量之间的对比,可以作为一种无创性产前诊断唐氏综合征的确诊方法进行下一步探讨。     

孕妇血浆中胎儿DNA的SRY基因检测

目的:探索一种孕期、快速、非创伤性的胎儿性别的产前诊断方法.方法:应用DNA-PCR扩增技术,检测妊娠5～40周的正常孕妇游离在血浆内的无细胞胎儿DNA的SRY基因.结果:90例孕妇血浆中游离DNA检则SRY基因阳性结果32例,其中早孕11例,中孕9例,晚孕12例.最后经绒毛、羊水、脐带血和出生胎儿证实均为男性胎儿,符合率为100%.结论:PCR扩增技术,检测游离在孕妇血浆内的无细胞胎儿DNA能在孕期鉴别胎儿性别,尤其是对早期某些选择性遗传性疾病的非创伤性产前诊断意义重大.     

孕妇血浆中胎儿DNA的提取及STR基因的检测

目的探索在孕妇血浆中提取胎儿DNA及STR基因的检测方法。方法提取10名健康孕妇（12～40周）血浆标本中胎儿游离DNA,对15个短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）基因位点和1个性别Amelogenin基因进行聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增。同时,检测孕妇及其丈夫的基因组DNA,进行对照研究。结果经性别Amelogenin基因的检测,与胎儿实际的性别符合率为100%。经STR-PCR检测发现,所有10例孕妇血浆中均检测出父源性胎儿DNA的存在,检测数量为2.89±1.62。结论本实验采取的方法准确性较高,可作为符合国家法律规定范围内的一种无创性的产前诊断方法 。     

孕妇血浆中游离胎儿DNA短串联重复序列检测

目的:建立一种简便、不依赖于胎儿性别和父本DNA的无创性产前诊断方法.方法:应用降落PCR和二次PCR扩增技术,结合母源DNA对照,以34例孕妇外周静脉血血浆作为标本,口腔上皮细胞拭子作为母源对照,孕妇配偶外周血DNA作为父源对照,检测正常孕妇血浆中游离胎儿DNA D17S1293、D21S11及DXS8377等基因位点.结果:34例孕妇血浆DNA中均检出非母源性等位基因条带,其中17例经父源DNA验证.结论:采用降落PCR和二次PCR扩增技术,可以提高孕早期微量游离胎儿DNA的扩增效率,准确、快捷地获得不依赖于父本DNA的胎儿遗传信息.     

孕妇血浆Amelogenin基因6bp差异检测对产前胎儿性别的鉴定价值

目的 建立一种可靠性强的非创伤性鉴别胎儿性别的方法。方法 根据Amelogenin基因第3内含子在X-Y染色体上6bp的差异，采用PCR技术扩增孕妇血浆游离DNA，运用聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色鉴定其基因型，从而判断胎儿性别。结果 32例孕妇血浆DNA标本中，19例被诊断为男性，13例被诊断为女性，所得结果与产后胎儿实际性别相比较，符合率为96、88％。结论 通过检测孕妇血浆DNA Amelogenin基因6bp差异产前诊断胎儿性别方法可行，结果可靠。     

孕妇外周血血浆胎源性牙釉质蛋白基因和DYS19位点检测

目的:检测孕妇外周血血浆胎源性牙釉质蛋白(Amelogenin)基因和DYS19位点,探讨其对男性胎儿性别诊断的可能性与准确性.为伴性遗传病的产前诊断提供参考.方法:采集22例正常孕妇外周血2 mL,以1例未婚无妊娠史女性为阴性对照、1例正常男性为阳性对照.提取血浆DNA作为PCR模板,以巢式PCR技术分别扩增Amelogenin基因和DYS19位点.并将实验结果与娩出后的新生儿实际性别比较.结果:孕妇外周血血浆中Amelogenin基因检测与娩出后新生儿实际性别符合率为95.5%.DYS19位点榆测符合率90.9%,2指标检测结果与胎儿实际性别符合率较高(kappa=0.909,P:0.088;kappa=0.820,P=0.120).Amelogenin基因与DYS19位点检测的一致率为95.2%.结论:Amelogenin基因和DYS19位点预测胎儿性别符合率无差异.联合检测Amelogenin基因和DYS19位点,可以提高诊断结果的可信度.     

孕妇外周血血浆胎儿DNA的检测

目的：建立可靠有效的检测孕妇血浆胎儿DNA的方法,探讨其在非创伤性产前诊断中的价值。方法：采用引物引伸预扩增（PEP）法及巢式PCR技术对65例孕妇外周血血浆DNA进行正常男性SRY基因检测。结果：单用巢式PCR技术和联合应用PEP,PCR技术对怀男胎的孕妇血中SRY基因检出率分别为65．2％（30／46）和89．1％（41／46）,两组差异有极显著性,对怀女胎孕妇血中SRY基因的未检出率为78．9％（15／19）和94．7％（18／19）,两组差异无显著性。结论：应用PEP法可对胎儿DNA进行全基因组扩增使DNA模板量增加,并使继后的PCR技术检测SRY基因的敏感性明显提高,PEP法是解决母血中胎儿细胞数量太少的途径之一,孕妇血浆中胎儿DNA可成为非创伤性产前诊断的胎儿物质来源。     

Rh阴性孕妇外周血基因鉴定胎儿RhD血型的方法

目的建立可靠有效的检测孕妇外周血中胎儿游离DNA的方法,探讨其在非创伤性产前诊断中的价值。结论采用PCR技术对5例RhD阴性孕妇外周血血浆DNA进行分析,然后对出生后婴儿脐带血进行Rh血清学表型分析,回顾性评价无创性预测胎儿RhD基因分析的准确性。结果 5例RhD阴性血浆标本扩增出180bp与156bp两条特异性片段,产后新生儿脐血血清学检测结果为RhD阳性,与PCR检测结果完全吻合。结论孕妇外周血浆中胎儿游离DNA的测定能实现对胎儿RhD基因型的预测判定。孕妇外周血检测胎儿DNA可应用于非创伤性产前诊断。     

微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用

目的 探讨微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用价值。方法 收集138例4—12孕周孕妇的外周血液样品，提取血浆DNA。选取胎儿DNAY染色体上的6个特异性序列SRY1、SRY2、SRY3、DYS1、DYS14和DYZ3基因作为男性胎儿标志物，采用微乳液PCR进行扩增，同时标记荧光，以β-globin基因作为阳性内对照。扩增产物与固定在基因芯片上的探针分子杂交，采用ScanArray 5000扫描仪扫描芯片。检测结果与胎儿出生性别进行比较。结果 最早的检出样品来自孕31d的孕妇，在78份男性胎儿孕育者血样中，有76份样本6个Y染色体特异序列均为阳性；60份女性胎儿孕育者血样中没有一个Y染色体特异序列阳性。微乳液多重PCR基因芯片法对男性胎儿早孕期检测的灵敏度达到97．4％，特异度达到100％。结论 微乳液多重PCR基因芯片法检测孕妇外周血中男性胎儿DNA的方法具有较高的灵敏度和特异度，能够早期鉴定胎儿性别，对性连锁遗传病的筛选具有潜在的应用价值。