板蓝根诱导人肺腺上皮细胞β-防御素-2基因表达的研究

目的 研究板蓝根体外刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)是否诱导表达具有抗菌活性的人-β-防御素-2(HBD-2)表达,并进一步探讨该表达是否存在浓度和时间依赖性效应,为进一步在动物水平探讨HBD-2的表达与中药之间的量效关系及时效关系提供依据.方法 体外培养SPC-A-1细胞,设置板蓝根5个浓度梯度,另设阳性对照和空白对照各1个,分别刺激贴壁生长的SPC-A-1细胞,应用RT-PCR技术检测SPC-A-1细胞HBD-2mRNA的表达情况,获取最佳表达浓度;再以最佳浓度经不同时间点刺激SPC-A-1细胞,得到表达诱导时间和持续时间.结果 研究显示板蓝根能够上调(SPC-A-1)细胞HBD-2mRNA的表达,且这种表达与板蓝根具有浓度和时间依赖性,当浓度为100μg/ml,刺激8h时,HBD-2mRNA的表达达到最高.结论 板蓝根可诱导HBD-2基因的表达,当浓度为100μg/ml,刺激8h时,其表达达到最高.     

卡介苗增强人β-防御素-1基因在肺腺上皮细胞表达的分子调节机制

目的 研究人β-防御素-1(hBD-1)基因启动子结构及卡介苗胞壁蛋白增强其mRNA在肺腺上皮细胞(SPC-A-1)中表达的转录调控机制。方法 hBD-1基因5′-端上游序列被连接入无启动子的pEGFP-1质粒和pCAT basic质粒，构建了系列5′-端缺失的pEGFPhBD-1及pCAT hBD-1报告质粒．pEGFP hBD-1质粒转染细胞后用荧光倒置显徽镜观察绿色荧光表达强度。pCAThBD-1报告质粒和pSV-β-Galactosidase control质粒(内对照)共转染SPC—A-1细胞后，给予卡介苗胞壁蛋白活性组分刺激，用ELISA检测CAT和β-Gal浓度．结果 hBD-1基因上游-314段有较强的启动子活性，-69段则启动活性减弱IBCG刺激后，即使上游序列缩短至-69位点时，报告基因CAT相对表达量仍明显增高。该区域有-同源性极高的C／EBPβ(CCAAT／Enhancer—binding proteinp)结合元件．结论 hBD-1基因上游-314bp段具有较完整的启动子活性，其中含有C／EBPβ结合位点的-69／ 54bp序列介导卡介苗对hBD-1基因转录的增强作用。     

卡介苗诱导人肺腺上皮细胞hBD—1 mRNA的增强表达

使用热灭活的卡介苗刺激培养的人肺腺上皮细胞（ＳＰＣ－Ａ－１）,利用逆转录聚合物酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,证实了卡介苗能诱导ＳＰＣ－Ａ－１细胞β－防御素－１基因（ｈＢＤ－１）的增强表达。卡介苗菌量和刺激时间与ＳＰＣ－Ａ－１细胞ｈＢＤ－１基因表达量的关系曲线显示,ｈＢＤ－１ ｍＲＮＡ在人肺腺上皮细胞的增强表达在一定范围内表现为具刺激剂量和时间依赖关系。实验为开发增强粘膜抗菌     

重组人β防御素2在膀胱上皮细胞中的表达及活性检测

目的探讨重组人β防御素2(hBD2)真核表达载体在人膀胱上皮细胞中的表达,并观察重组hBD2的体外抗菌活性。方法采用脂质体转染法将hBD2重组真核表达质粒pCAGG-hBD2导入无血清培养的人膀胱上皮细胞株T24细胞,利用RT-PCR法、Western blotting分别在核酸水平及蛋白质水平检测hBD2的表达。ELISA测定培养上清中hBD2的浓度,菌落计数法检测上清对尿路致病性大肠杆菌(UTI89)和克雷白杆菌(TOP52)的临床分离株的抗菌效果。结果 RT-PCR和Western blotting结果显示,转染后hBD2可在T24细胞中有效地表达。上清中hBD2的含量为(36.5±3.2)ng/106个细胞,菌落计数法显示,hBD2对UTI89和TOP52临床分离株有显著的杀菌作用。结论 hBD2重组真核表达载体脂质体法转染人膀胱上皮细胞后,可高效表达具抗菌活性的基因重组hBD2。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2 mRNA的表达

目的 检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞β-防御素-2(hBD-2)基因的激活作用及其活性组分．方法 应用遵转录聚合膏链反应(RT—PCR)法和Northern杂交检测HT-29细胞hBD-2mRNA的表达；采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞璧蛋白质成分．结果 RT—PCR和Northern杂交分析显示，在正常培养条件下HT-29细胞无可见的hBD-2mRNA表达信号，但在双歧杆菌菌体、细胞璧和胞璧蛋白刺激下均检测出显著的hBD-2mRNA表达．结论 双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD-2基因的表达。双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性成分。     

脂多糖及前炎症细胞因子诱导人原代气道上皮细胞β防御素-2表达的实验研究

目的观察脂多糖（LPS）及前炎症细胞因子白细胞介素1w（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导人原代气道上皮细胞人β防御素-2（hBD-2）的表达,探讨呼吸道先天性病原体防御机制。方法LPS、IL-1β及TNF-α刺激培养人原代气道上皮细胞后,RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达,Westernblot和免疫组化法检测hBD-2mRNA蛋白的表达。结果正常人原代上皮细胞有微量hBD-2mRNA表达,不同质量浓度的12S、IL-1β及TNF-α刺激细胞后,hBD-2mRNA表达呈剂量依赖性增加,与对照组差异显著。0．1μg／mL的LPS、1ng／mL的IL-1β和10ng／mL的TNF-α刺激上皮细胞4h后,细胞均可见hBD-2蛋白表达。结论一定剂量的12S及前炎症细胞因子可诱导人气道上皮细胞hBD-2表达,且诱导hBD-2表达时间较短,hBD-2的表达可能是气道最初的防御反应。     

白介素-22诱导肺泡上皮2型人β防御素表达的初步研究

目的:初步探讨对于直接或间接引起的肺内感染,炎症反应产生的白介素(IL)-22能否刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,并且诱导其生成?释放2型人β防御素(human β-defensin-2,HBD-2)发挥抗感染作用?方法:流式细胞术检测肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞膜表面IL-22R表达水平?重组人IL-22(20 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,RT-PCR检测不同时间(0?2?4?8?16?24 h)HBD-2表达情况?不同浓度的重组人IL-22(0?4?20?100?500 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,RT-PCR检测HBD-2表达情况?结果:肺泡Ⅱ型上皮细胞膜表面IL-22R表达呈强阳性,阳性率达(99.90 ± 0.13)%?比较6个时间点HBD-2表达差异,发现HBD-2表达具有时间依赖性?比较不同浓度IL-22处理下HBD-2表达差异,IL-22 100 ng/ml为最佳干预浓度,且HBD-2表达与IL-22浓度具有依赖关系?结论:IL-22能显著诱导肺泡上皮细胞生成并释放HBD-2,且具有时间和剂量依赖性?     

人β防御素-2研究进展

内源性抗生素肽(endogenous antibiotic peptides)是动、植物天然免疫的重要介质,在哺乳动物(包括人)中,由于对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、螺旋体、分枝杆菌及某些包膜病毒等均有很强杀伤活性,故将其命名为防御素(defensin).迄今为止,在人体中已发现的防御素共有两类(α、β)10种.其中β防御素家族共发现3种,分子量为4～5kD,含38～47个氨基酸残基阳离子,分别为人β防御素-1,2,3(human β-defensin-1,2,3. hBD-1,2,3).德国Harder J等[1]于1997年首先发现hBD-2,他们用大肠杆菌亲和柱结合高压液相层析法在牛皮癣病人皮肤中分离并纯化到约4.3kD的多肽,经氨基酸序列分析表明与牛的TAP(气管抗菌肽)、LAP(舌抗菌肽)及hBD-1同源,属于人β抗菌肽成员之一,命名hBD-2.已证实hBD-2是黏膜和上皮细胞抵抗微生物入侵的重要介质,在持续暴露在病原微生物的器官表面发挥重要的抗菌作用.     

卡介苗诱导人肺腺上皮细胞hBD-1 mRNA的增强表达

使用热灭活的卡介苗刺激培养的人肺腺上皮细胞(SPC－A－1),利用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）法和Northern杂交分析,证实了卡介苗能诱导SPC－A－1细胞β－防御素－1基因(hBD－1)的增强表达。卡介苗菌量和刺激时间与SPC－A－1细胞hBD－1基因表达量的关系曲线显示,hBD－1 mRNA 在人肺腺上皮细胞的增强表达在一定范围内表现为具刺激剂量和时间依赖关系。实验为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下了基础。     

人β防御素2评价肺部疾病临床研究进展

人β防御素2(HBD2)是一类在肺部上皮呈可诱导性表达的抗菌肽。由于其抗菌活性和免疫调节功能,HBD2在肺部感染和炎症性疾病中发挥重要作用,可能参与肺部疾病的发生、发展。故检测肺组织或体液中HBD2的水平对临床上指导肺部疾病的诊疗有积极的作用。该文就HBD2的结构、功能及其作为一个炎性因子在评价肺部疾病中的临床应用进展予以综述。     

阿托伐他汀对脂多糖诱导下人肺上皮细胞C反应蛋白表达的影响

目的:探讨阿托伐他汀能否调节脂多糖(LPS)诱导下人肺上皮细胞CRP的表达.方法:对LPS诱导的人肺上皮细胞给予不同浓度的阿托伐他汀干预,同时设置对照组,分别提取细胞RNA,采用RT-PCR方法比较CRP mRNA表达;收集培养上清液,采用ELISA方法比较CRP的浓度.结果:在LPS诱导下,人肺上皮细胞有CRP mRNA的表达及蛋白的分泌,并呈时间和剂量依赖关系;阿托伐他汀明显降低LPS诱导下人肺上皮细胞CRP mRNA的表达及蛋白的分泌,并呈剂量依赖关系.结论:阿托伐他汀能降低LPS诱导的人肺上皮细胞CRP mRNA表达及蛋白分泌,提示阿托伐他汀可能具有直接抗炎作用.     

阿托伐他汀对脂多糖诱导的人肺上皮细胞分泌PGE2和IL-6的影响

目的：探讨阿托伐他汀（atorvastatin）对经脂多糖（LPS）诱导人肺上皮细胞(A549)的炎症细胞因子PGE2和IL-6分泌的影响。方法：对LPS诱导的人肺上皮细胞给予不同浓度的阿托伐他汀干预，同时设置对照组，分别收集其培养上清液，采用ELISA方法，比较PGE2和IL-6浓度。结果：①在不同浓度的LPS诱导下，肺泡上皮细胞不同时间分泌PGE2和IL-6浓度明显高于未经LPS诱导的对照组（P<0.05）。②阿托伐他汀不同浓度的干预，肺上皮细胞PGE2和IL-6的分泌浓度较无阿托伐他汀干预组均有不同程度的降低（P<0.05）。结论：阿托伐他汀能降低脂多糖诱导的人肺上皮细胞炎症因子PGE2和IL-6的分泌, 提示他汀类药物对肺上皮细胞有直接抗炎作用。     

机械拉伸下人肺上皮细胞增殖及整联蛋白再分布

目的 探讨机械拉伸应变对人肺上皮细胞增殖及其膜受体——整联蛋白α5、β1再分布的调控作用。方法 建立体外周期性拉伸装置，应用流式细胞术测定细胞的增殖活性，激光共聚焦显微镜分析整联蛋白α5、β1再分布。结果 在应变为15％，频率为20次／min、40次／min的拉伸刺激下，74h后，细胞的增殖活性指数明显降低，H727细胞的DNA合成受到显著抑制。在40次／min的拉伸频率下，整联蛋白α5、β1的分布发生重组并向基底层转移，形成局部粘附连接。结论 整联蛋白α5、β1可能在肺上皮细胞感应机械应力过程中起了重要的作用。     

吡那地尔对人肺动脉平滑肌细胞KATP通道mRNA表达的影响

目的:研究经典KATP开放剂吡那地尔对原代培养人肺动脉平滑肌细胞 KATP 通道mRNA表达的影响,以探讨KATP通道在肺动脉高压发生发展中的分子生物学机制.方法:分离人3～4级肺小动脉,原代培养人肺动脉平滑肌细胞.分成ET-1组、ET-1 吡那地尔组及ET-1 吡那地尔 格列本脲组.以Trizol法抽提总RNA,逆转录为cDNA,采用Real-time PCR方法检测各组细胞KATP通道SUR2B和Kir亚单位mRNA表达量.结果:ET-1 组 KATP通道SUR2B mRNA表达量较对照组明显减少,为对照组的0.09±0.01倍(P<0.05,n=3).加用吡那地尔可拮抗ET-1作用,提高SUR2B mRNA表达量,为ET-1组的10.94±1.13倍,为对照组的0.97±0.03倍(P>0.05,n=3).格列本脲可拈抗吡那地尔作用,减少SUR2B mRNA表达量,为ET-1 吡那地尔组的0.10±0.01倍,为对照组的0.07±0.02倍(P<0.05,n=3).各组细胞KATP通道 Kir6.1 mRNA 表达量无统计学差异.结论:KATP 开放剂吡那地尔可增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道SUR2B mRNA表达量,这可能是其调节肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达和功能的机制.     

机械拉伸对人肺上皮细胞粘附及[Ca2+]i的影响

目的探讨周期性拉伸应变对人肺上皮细胞H727的力学性质及其[Ca2 ]i的调控作用.方法应用微管吸吮系统测定细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积,用荧光探针Fluo-3/AM测定拉伸应变对人肺上皮细胞H727[Ca2 ]i的影响.结果在应变为15%,频率为40次/min的拉伸刺激下,与其静态对照组相比,细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积均增加;拉伸5 min后,[Ca2 ]i比对照组有明显增加,用三七总皂苷阻断胞内Ca2 离子通道后,细胞对应变的响应仍表现出[Ca2 ]i的升高,但与未加三七总皂苷的实验组相比,[Ca2 ]i响应应变后的升高由原来的3.4倍的增加降低为1.5倍的增加.结论在人肺上皮细胞H727响应周期性拉伸应变的过程中,[Ca2 ]i的升高既有胞外钙内流的参与,也有胞内钙库的释放作用,其中胞外钙通过跨膜通道的内流起主要作用.     

冻干鲜鱼腥草/干品酚类活性成分的HPLC含量测定

目的：比较冻干鲜鱼腥草/干品中的酚类成分含量。方法：Alltima C18柱,流动相：A0.2%的冰乙酸溶液,B乙腈,梯度洗脱：0～20min,5%～20%B;20～40min,20%～20.5%B;40～50min,20.5%～35%B;流速：0.6mL/min;检测波长280nm。结果：冻干鲜鱼腥草酚类成分含量高于干品,是干品的4～6倍。结论：冻干保鲜鱼腥草可提高酚类成分的含量,说明冻干保鲜具有一定的科学依据。     

缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞Akt mRNA表达的变化

目的通过观察缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC）3种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Akt1、Akt2、AkG）mRNA的表达水平变化,初步探讨Akt信号途径在缺氧肺动脉高压（hypoxia pulmonary hypertension,HPH）血管重建中的作用。方法组织贴片法建立纯PASMC细胞系。采用半定量RT-PCR技术检测常氧组（N组）、低氧2、8、12、24组的Akt1、Akt2和AkG基因mRNA的表达水平。结果建立了纯PASMC细胞系。各组均检测出Akt1、Akt2和AkG基因的mRNA,图像定量分析光值显示各组表达的mRNA含量与缺氧时限存在一定的关系。结论Akt信号通路可能是大鼠缺氧肺动脉高压中PASMC增殖和分化的重要传导途径,其中Akt1可能起主要作用。     

人羊膜上皮细胞的体外培养及标记

目的 改良人羊膜上皮细胞的培养方法,检测生长特性,观察DAPI标记HAECs的效率。 方法 取足月剖宫产术后羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化获得上皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞的生长周期,免疫组化对细胞角蛋白进行鉴定。并用DAPI标记,测1、2周荧光阳性率。 结果 培养的HAECs多角形,生长分为缓滞期、对数增长期和平台期,约80%处于细胞周期的静止期G0。细胞角蛋白keratin阳性表达。DAPI标记1周标记率为100%;2周细胞形态好,标记率不变,荧光强度减弱。 结论 本实验方法成功培养人羊膜上皮细胞。DAPI短期标记效果理想。     

小儿清肺饮与复方鱼腥草合剂治疗小儿肺炎的临床疗效观察

目的比较小儿清肺饮与复方鱼腥草合剂治疗小儿肺炎的临床疗效,为临床治疗提供科学依据。方法 2012年1月—2013年1月该院收治肺炎患儿104例,随机分为两组：观察组患儿52例在抗生素治疗的基础上给予小儿清肺饮治疗,对照组患儿52例在抗生素治疗的基础上给予复方鱼腥草合剂治疗。结果 1观察组临床总有效率为96.16%,对照组临床总有效率为86.54%,观察组组疗效优于对照组（P〈0.05）。2在咳嗽消失时间、肺部啰音消失时间以及住院天数方面观察组分别为：（6.15±2.10）,（6.81±3.63）,（7.11±3.55）,对照组为（8.74±3.78）,（8.89±3.79）,（9.53±4.58）,均P〈0.05）,但在发热消失时间方面观察组为（3.36±1.73）,对照组为：（3.59±1.91）两组对比差异无统计学意义（P〉0.05）;3用药依从性方面观察组依从性好41例,占78.85%,对照组13例,占25%,观察组明显优于对照组患儿（P〈0.05）。结论小儿清肺饮治疗小儿肺炎具有更好的临床疗效,并且患儿用药的依从性好,值得临床推广。