LY367385通过抑制细胞外信号调节激酶途径减轻小鼠脑血管痉挛后神经细胞凋亡

目的: 探讨代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)选择性拮抗剂LY367385对脑血管痉挛(CVS)后神经细胞凋亡的影响及细胞外信号调节激酶1/2(ERKl/2)途径的作用。方法: 采用非开颅血管内线栓法制备小鼠蛛网膜下腔出血(SAH)并CVS模型,随机分为3组:假手术组、模型对照组和mGluR1拮抗剂LY367385组,于SAH后10 min侧脑室注射生理盐水或LY367385(500 nmol)5 μL,术后行神经功能评分。分别在SAH后6、24和48 h 3个时点取右侧脑组织标本,在光镜和电镜下观察脑组织病理变化,采用逆转录-聚合酶链式反应检测各组mGluR1 mRNA的表达变化;蛋白免疫印迹法检测mGluR1和p-ERK1/2蛋白的表达;用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况。结果: 与假手术组比较,模型组小鼠神经功能评分显著降低,随CVS时间延长,各组小鼠mGluR1 mRNA、mGluR1和p-ERK1/2蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多,神经细胞出现变性坏死、神经轴索变性断裂。与模型组比较,拮抗剂组小鼠神经功能评分增加,mGluR1 mRNA、mGluR1和p-ERK1/2蛋白表达均有不同程度下调,神经细胞凋亡数目减少,脑组织形态学和超微结构损伤减轻。结论: (1)CVS后mGluR1的表达增强可通过激活ERK信号途径诱导神经细胞凋亡。(2)mGluR1选择性拮抗剂LY367385对CVS损伤具有拮抗作用。     

载脂蛋白E拟肽在脑血管痉挛中的保护机制

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)-细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路在脑血管痉挛后早期脑损伤中的作用,探讨载脂蛋白E(apoE)拟肽通过此途径发挥的保护机制.方法:采用非开颅血管内穿线法制备小鼠蛛网膜下腔出血(SAH)和脑血管痉挛模型,给予apoE-1410肽,术后脑血管铸型检测大脑中动脉(MCA)直径变化,分别在术后12、 24、 48h 3个时相点取右侧大脑动脉标本,应用免疫印迹法检测各组VEGF、 p-ERK1/2蛋白表达,TUNEL法检测MCA内皮细胞凋亡.结果:模型组MCA出现严重的血管痉挛,管腔直径减小,随脑血管痉挛时间延长,各组小鼠VEGF、 p-ERK1/2蛋白均有不同程度上调,凋亡细胞增多.与模型组比较,治疗组MCA管腔直径增加,各时相点3项指标的表达均不同程度下调.蛛网膜下腔出血12～48h VEGF表达与p-ERK1/2呈正相关;p-ERK1/2与TUNEL呈正相关.结论:脑血管痉挛后VEGF表达增强可通过激活ERK信号途径诱导大脑动脉内皮细胞凋亡;拟apoE-1410肽对脑血管痉挛具有一定的治疗作用,其机制之一可能是通过部分阻抑VEGF/ERK通路活化减少凋亡实现的.     

U0126对蛛网膜下腔出血小鼠细胞外信号调节激酶途径的调节作用

目的:研究细胞外信号调节激酶(ERK)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤中的作用,并探讨ERK特异性抑制剂U0126通过此途径发挥作用的保护机制。方法:采用稳定的非开颅血管内穿线法制备小鼠SAH模型,并于术前30 min经尾静脉给予U0126(0.1 mg/kg),分别在术后12、24、48 h 3个时相点取右侧大脑动脉标本,HE染色观察大脑动脉的形态改变,并检测大脑中动脉(MCA)的直径变化;应用免疫印迹法检测各组p-ERK1/2、caspase-8蛋白表达,TUNEL法检测MCA内皮细胞凋亡。结果:模型组小鼠MCA出现严重血管痉挛,直径减小,p-ERK1/2、caspase-8蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多。与模型组比较,治疗组小鼠各时相点上述3项指标的表达均呈不同程度下调,MCA管径增加,脑血管痉挛缓解。SAH 12～48 h时p-ERK1/2与caspase-8的表达呈正相关。结论:SAH后ERK表达增强可通过激活caspase-8信号途径诱导大脑动脉内皮细胞凋亡;U0126可减少大脑动脉内皮细胞凋亡,其机制之一可能是通过阻抑ERK通路活化实现的。     

痹肿消汤干预胶原诱导关节炎模型大鼠关节滑膜组织细胞外信号调节激酶1/2及细胞外信号调节激酶5的表达

背景：滑膜细胞信号转导异常是类风湿性关节炎的重要发病机制之一。中药复方痹肿消汤治疗类风湿性关节炎具有较好的临床疗效,但在细胞信号转导水平探讨痹肿消汤治疗类风湿性关节炎的作用机制是十分必要的。 目的：观察中药复方痹肿消汤对胶原诱导关节炎模型大鼠滑膜细胞外信号调节激酶1/2,5表达的影响。 方法：SD大鼠45只随机数字表法分为对照组、模型组、痹肿消汤组。胶原诱导关节炎模型大鼠,用痹肿消汤药液3.0~3.5 mL灌胃,1次/d,连续14 d。检测造模后第14,21,28天大鼠滑膜细胞外信号调节激酶1/2,5的磷酸化水平。 结果与结论：造模后,大鼠滑膜细胞外信号调节激酶1/2,5的磷酸化表达随时间而增加(P < 0.05)。痹肿消汤治疗后,细胞外信号调节激酶1/2,5磷酸化表达水平则明显下降(P < 0.05)。提示痹肿消汤能抑制细胞外信号调节激酶1/2,5蛋白激酶的激活,从而抑制细胞外信号调节激酶1/2, 5信号转导通路的活化,这可能是其阻抑类风湿性关节炎滑膜异常增殖、关节骨质侵蚀的重要机制之一。     

大鼠脑内代谢型谷氨酸受体2和3亚型的分布

用免疫组化技术观察了代谢型谷氨酸受体２和３亚型阳性神经元胞体和纤维在大鼠脑内的定位分布。证明此二亚型阳性胞体和纤维密集分布于小脑颗粒细胞层；中等密度淡染的阳性胞体和纤维见于大脑皮质浅层、屏状核吻侧部、尾壳核、苍白球、腹侧苍白球、斜角带核垂直部、隔区、终纹床核和外侧网状核等处；小脑Ｐｕｒｋｉｎｊｅ细胞层和分子层内仅有少量淡染的阳性纤维。     

单一连续应激大鼠内侧前额皮质细胞外信号调节激酶磷酸化增高

目的 探讨单一连续应激(SPS)大鼠内侧前额皮质(mPFC)磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK1/2)和c-fos表达的变化.方法将45只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、应激组和干预组.应激组和干预组大鼠接受SPS,干预组大鼠接受SPS前30min前额皮质局部注射ERK抑制剂2′-氨基-3′-甲氧黄酮(PD9805...     

细胞外信号调节激酶1/2的阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞增殖的影响

目的探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的特异性阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响。方法分离小鼠淋巴结细胞,藉羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色,用多克隆刺激剂刀豆A蛋白(ConA)或者佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激,以流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞增殖的影响;利用碘化丙锭(PI)染色分析PD98059对细胞周期的影响。结果CFDA-SE染色分析显示,当浓度为5、10、20、30、40μmol/L时,PD98059对ConA诱导的淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈现明显的剂量依赖关系(r=0.985,P<0.01)。选择最佳浓度30μmol/L的PD98059,观察其对不同时间淋巴细胞增殖的影响,结果发现,随着时间的延长,PD98059对淋巴细胞增殖的抑制作用明显降低(P<0.01),但抑制率随时间的延长而明显升高。细胞周期分析进一步表明,PD98059可阻止ConA刺激的淋巴细胞进入S期和G2/M期,而亚二倍体峰变化并不明显。PD98059对PDB Ion刺激的淋巴细胞细胞周期的影响与ConA刺激相似,不同的是S期和G2/M期的变化较ConA的作用更明显。结论PD98059对小鼠淋巴细胞的增殖有明显地抑制作用,并可阻止其进入S期和G2/M期,提示ERK1/2信号通路的活化在淋巴细胞增殖中起重要作用。     

细胞外信号调节激酶/miR-133b在甲基苯丙胺致PC12细胞神经毒性的作用及机制

目的 探讨甲基苯丙胺(MA)致神经细胞毒性过程中细胞外信号调节激酶(ERK)和miR-133b的表达变化及调控机制。方法 用MA建立PC12神经细胞损伤模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活性及镜下形态观察确定MA最佳损伤浓度;应用流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）水平;通过 Western blotting技术测定总ERK1/2和磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)的表达变化;并应用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定miR-133b的表达变化。为进一步分析ERK/miR133b分子通路的作用关系,经U0126特异阻断ERK通路,检测miR-133b的表达变化。 结果 给予不同浓度的MA,均可导致PC12细胞损伤,其中800μmol/L MA处理后,大部分胞体变圆,神经突起退缩,神经网络消失。MTT结果显示细胞活性明显下降。进一步的细胞毒性机制分析显示,MA处理后,细胞内ROS水平升高,p-ERK表达增高,miR-133b表达降低;并且给予ERK通路抑制剂U0126（10μmol/L）后,miR-133b表达升高,细胞活性增强,胞内ROS水平降低,镜下细胞损伤改善。 结论 MA可通过上调ERK磷酸化抑制miR-133b表达,介导神经元毒性损伤。     

不同标本制备法对小鼠小肠组织中ERK1/2和pERK1/2免疫组织化学定位的影响

目的:本研究针对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员细胞外信号调节激酶(ERK1/2),以及磷酸化的ERK1/2(pERK1/2),探讨不给任何刺激时,用不同标本制备法检测ERK1/2在小鼠小肠组织中的免疫组织化学定位。方法:分别应用灌流固定脱水法(PF-DH),浸泡固定脱水法(IM-DH),快速冻结-冻结置换法(QF-FS)制备的标本,通过免疫组织化学显色检测ERK1/2和pERK1/2在肠上皮中的定位。结果:应用PF-DH法,ERK1/2位于几乎所有上皮细胞的核中,而pERK1/2在上皮细胞中很难检测到。应用IM-DH法,ERK1/2位于所有上皮细胞的胞质和核内,pERK1/2仅位于小肠绒毛顶部的上皮细胞内,而不存在于肠隐窝区域的上皮细胞中。应用QF-FS法制备的标本中,ERK1/2定位于所有上皮细胞的胞质中,而pERK1/2主要存在于肠隐窝部位和肠绒毛顶部的上皮细胞中。结论:本研究结果提示,用不同的标本制备方法会影响ERK1/2的免疫组织化学定位。通过比较不同标本制备方法取材的小鼠小肠组织中的ERK1/2和pERK1/2的免疫组织化学定位,得出QF-FS法可能为最接近活体状态的小鼠小肠组织中的ERK1/2和pERK1/2定位的方法。     

创伤后应激障碍模型大鼠内侧前额皮质磷酸化细胞外信号调节激酶1/2及c-fos的变化

目的探讨创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠内侧前额皮质(mPFC)磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)和c-fos的表达变化。方法将30只成年健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组(15只)和PTSD模型组(15只),采用无连续单一应激(SPS)方法制备PTSD模型。用免疫组织化学和免疫印迹法检测mPFCpERK1/2的表达变化,RT-PCR检测c-fosmRNA表达变化。结果免疫组织化学分析显示,对照组和模型组pERK1/2阳性细胞数分别为10.4±2.07、48.8±10.08,阳性信号吸光度值分别为24.955±3.691、110.810±10.643,差异有统计学意义(P0.01);免疫印迹分析显示,对照组和模型组pERK/2相对表达量分别为0.510±0.052和1.109±0.106,差异有统计学意义(P0.01);RT-PCR分析结果显示,对照组和模型组c-fosmRNA相对表达分别为0.267±0.067和1.049±0.131,差异有统计学意义(P0.01)。结论mPFCpERK1/2和c-fos表达增高,可能参与了PTSD模型大鼠的病理生理过程。     

小鼠蛛网膜下腔出血后海马CA1区mGluR1和ERK1/2的表达变化

目的:探讨小鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后代谢型谷氨酸受体1(metabotropicglutamate receptor 1,mGluR1)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)调控神经细胞凋亡的分子机制。方法:采用非开颅血管内穿线法制备小鼠SAH模型,随机分为3组:假手术组、SAH+生理盐水(SAH+NS)组、SAH+LY367385(mGluR1抑制剂,SAH+LY367385)组,于SAH后10 min侧脑室注射生理盐水或LY367385(500 nmol/L)5μl,术后行神经功能评分。分别在SAH后6、24、48 h 3个时间点取右侧脑组织标本,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组mGluR1的表达变化,免疫印迹法(Western Blot)检测p-ERK1/2蛋白的表达,TUNEL法检测右侧海马CA1区神经细胞的凋亡。结果:与假手术组比较,SAH+NS组小鼠神经功能评分均显著降低(P<0.05),随SAH时间延长,各组小鼠mGluR1、p-ERK1/2蛋白均有不同程度增强,凋亡细胞增多(P<0.05)。与SAH+NS组比较,SAH+LY367385组小鼠神经功能评分增加,mGluR1、p-ERK1/2蛋白表达均有不同程度下调,神经细胞凋亡数目有所减少。SAH后6～48 h,mGluR1的表达与p-ERK1/2呈正相关。结论:mGluR1和ERK在SAH的发病机制中发挥了重要作用,SAH后海马内mGluR1的表达增强可通过激活ERK信号途径诱导神经细胞的凋亡。     

胰岛素样生长因子-1通过细胞外信号调节激酶1/2通路下调转录因子基本转录元件结合蛋白表达抗心肌细胞凋亡

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠心肌细胞凋亡保护作用的基因调控机制。方法 体外培养新生大鼠心肌细胞,10nmol/L IGF-1刺激的同时,分别加入磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）1/2和Raf-1 3条通路抑制剂（20μmol/L）,通过RT-PCR及Western blotting方法观察IGF-1调节基本转录元件结合蛋白（BTEB）的基因表达及其通路调控。100μmol/L H2O2处理诱导心肌细胞凋亡,通过DNA梯度分析、Annexin V-FITC/PI双染色法、Caspase-3活性测定、Hoechest33258染色法观察用BTEB特异性siRNA人为下调BTEB基因表达后对心肌细胞凋亡的影响。结果 大鼠心肌细胞经IGF-1刺激60min后,BTEB mRNA和蛋白表达均明显下降;与对照组相比,加入ERK1/2通路抑制剂PD98059组BTEB的mRNA和蛋白表达均明显增高（P＜0.01）;H2O2诱导的大鼠心肌细胞于下调BTEB表达后,DNA片段化改善,心肌细胞凋亡率下降（P＜0.05）,Caspase-3活性降低（P＜0.05）,凋亡小体减少,与IGF-1的抗心肌细胞凋亡效果相似。
结论 IGF-1可以通过ERK1/2通路下调转录因子BTEB基因表达而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。     

p-Akt、Bid与小鼠局灶性脑缺血后处理保护作用的关系

目的 探讨p-Akt、Bid在小鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)及缺血后处理(IP)后的启动规律,探讨p-Akt、Bid与IP保护作用的关系。方法 将315 只雄性昆明小鼠采用线栓法建立大脑中动脉栓塞模型后,随机分成假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血后处理组(IP组)、缺血后处理+PI-3K抑制剂LY294002组(IP+LY组)4组,于再灌注相应时间点取材,免疫组织化学方法检测p-Akt、Bid的表达及分布情况;免疫印迹法检测皮质p-Akt、Bid蛋白表达情况。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定脑梗死体积。结果 与Sham组比较,I/R组神经元胞质中可见p-Akt及Bid的表达明显上调,p-Akt表达于30min增加,1 h达高峰(P<0.05),24 h回落至基线水平,Bid表达于6 h增加,24 h达高峰(P<0.05),48~72 h有所回落;IP组各相应时间点较I/R组p-Akt表达显著增加(P<0.05),Bid表达明显降低(P<0.05)。应用PI-3K特异性阻断剂LY294002阻断PI-3K/Akt信号系统活化的同时,也抑制了IP的保护作用。p-Akt蛋白表达量与Bid免疫反应性呈负相关（r=-0.8265,P <0.05）。结论 p-Akt、Bid参与缺血后处理过程;缺血后处理可能通过PI-3K/Akt通路发挥脑保护作用;Akt可能通过死亡受体通路调控Bid的表达。     

藏红花素对人脐静脉内皮细胞增殖及细胞外调节蛋白激酶信号通路的影响

目的观察藏红花素(crocin)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外增殖、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2表达及活性的影响。方法用藏红花素及MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂PD98059分别处理HUVECs,Ed U细胞增殖法检测细胞体外增殖活力,Western blotting法检测crocin对磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和总ERK1/2表达的影响,激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)浓度。结果在1μmol/L和10μmol/L浓度水平,藏红花素可明显促进细胞的增殖能力,提高磷酸化ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达水平,并增加细胞内Ca~(2+)浓度;给予MEK抑制剂PD98059后,细胞的增殖能力下降,磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的表达减弱,细胞内Ca~(2+)浓度降低。结论藏红花素通过活化ERK1/2信号途径,提高细胞内Ca~(2+)浓度,促进人脐静脉内皮细胞的体外增殖能力。     

抑制水通道蛋白4可降低脊髓后角胶质细胞细胞外调节蛋白激酶信号的活化改善坐骨神经损伤导致的神经病理性疼痛

目的 探讨腰椎间盘突出引起的坐骨神经痛中,抑制水通道蛋白4（AQP4）对脊髓胶质细胞以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路活化的影响。 方法 取8周龄雄性SD大鼠90只,分为假手术组18只,坐骨神经慢性压迫损伤(CCI)+DMSO组36只, CCI+TGN-020组（AQP4抑制剂）36只。CCI模型应用动物行为学,Western blotting方法,免疫荧光（双重染色）等方法检测。 结果 Western blotting显示,细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、 p38MAPK信号通路及星形胶质细胞在神经损伤之后活化;免疫荧光在AQP4的表达被TGN-020抑制之后,胶质细胞及ERK、JNK、p38MAPK信号通路的活化被削弱,p-ERK和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共定位的细胞数量在损伤后明显增多,而TGN-020可减少之。 结论 抑制AQP4可抑制坐骨神经损伤引发的脊髓后角星形胶质细胞活化及MAPK信号通路活化,且可以通过抑制脊髓后角ERK通路的活化来抑制星形胶质细胞的活化,从而改善坐骨神经损伤所致神经病理性疼痛。     

Smad通路参与ERK通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程

目的： 探讨Smad通路是否参与细胞外信号调节激酶(ERK)通路诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的过程及其可能机制。方法：将人脐动脉平滑肌细胞（hUASMCs）分为对照组、血小板源性生长因子（PDGF）组、ERK阻断剂组和PDGF+ERK阻断剂组。用MTT法测hUASMCs的增殖活性(A值)，用免疫组化法测hUASMCs内细胞核增殖抗原（PCNA）、磷酸化ERK和磷酸化Smad蛋白的表达，用RT-PCR法测hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达。结果：PDGF组hUASMCs的增殖活性(A值)及hUASMCs内的PCNA、磷酸化ERK和磷酸化Smad2/3蛋白的表达都明显高于其它各组(P<0.01)；各组hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达没有差异。结论： Smad通路可在蛋白水平参与ERK通路诱导VSMCs的增殖过程。