转壁生物反应器中动态分化组织工程软骨的实验研究

目的 :在转壁生物反应器动态环境中分化骨髓间充质干细胞 (bMSC) ,制备立体组织工程软骨。方法 :穿刺吸取成年兔骨髓 ,分离扩增bMSC ,复合于纤维蛋白凝胶制成圆柱状三维组织 (细胞密度2 0× 10 7/ml) ,置于转壁生物反应器中进行分化培养 ,同时设单纯静止培养组。 5周后观测大体形态和组织学形态、Ⅰ和Ⅱ型胶原免疫组织化学表达 ,测量分化组织的细胞活力。结果 :动态培养可以有效保持材料大体形态 ,甲苯胺兰染色阳性 ,无明显Ⅰ型胶原表达 ,大量表达Ⅱ型胶原 ,人工组织的细胞活力显著高于单纯静止培养方法。结论 :转壁生物反应器培养明显改善组织工程软骨的活力 ,有利于进行三维材料体外软骨分化。     

骨髓间充质干细胞及在软骨组织工程中的研究进展

间充质干细胞 (ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ)是指能在适宜的条件下分化再生骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪、骨髓基质等间充质组织的一类细胞 ,具有典型的干细胞特点 ,终身存在于骨髓和其他组织器官中 ,负责组织的修复和更新〔1,2〕。它们具有多向分化潜能和强大的增殖能力 ,并且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化 ;因此 ,近年来在组织工程领域倍受重视 ,得到广泛研究。笔者仅就骨髓间充质干细胞的生物学特性及其在软骨组织工程中的研究进展作一综述。1　骨髓间充质干细胞的主要生物学特性　　骨髓中只含有少量间充…     

骨髓间充质干细胞软骨分化生物学的影响因素

间充质干细胞(MSCs)因具有在适宜的体内或体外条件下分化形成软骨组织的潜能，且易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化，便于自体移植，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。然而，MSCs在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程。目前其调控机制仍不是很清楚。已知局部环境是影响MSCs向软骨细胞转化的重要因素，低氧张力、高细胞密度、局部应     

组织工程软骨实验生物反应器的设计

目的:设计一套计算机控制的组织工程软骨实验用灌流型生物反应器。方法:通过计算机控制时间及流量,利用蠕动泵、密闭的硅胶管、玻璃管、储液瓶等串联设计一套无菌的灌流型软骨组织工程用生物反应器。结果:生物反应器由控制系统和培养系统组成,运行良好,能置于培养箱中对软骨细胞材料复合物进行动态培养。结论:反应器设计合理。整个生物反应器系统运行可靠。     

组织工程化软骨修复兔骺板损伤的实验研究

目的　探讨组织工程化软骨细胞 生物载体复合物修复兔骺板损伤的可行性。方法于 8周龄兔胫骨上端骺板缺损模型中 ,A、B、C三组分别植入组织工程化软骨、单纯外消旋聚乳酸(PDLLA)、空白对照 ,术后 4、8、16周时对双下肢行X线摄片、组织学检查。结果　 4、8、16周时双侧胫骨长度、胫骨角之差A组与B、C组相比 ,短缩与成角畸形轻 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1) ,组织学显示缺损区呈薄层骺软骨细胞样结构 ;B、C两组间差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论　骨髓间充质干细胞 (MSCs)可定向诱导分化为软骨细胞 ;组织工程化软骨细胞植入可减轻骺板损伤后肢体短缩与成角畸形。     

干细胞构建软骨组织工程研究进展

[背景]创伤后软骨的再生能力是很有限的,而目前处理小的软骨缺损的方法有以下几种:(1)姑息治疗,包括关节镜下的清理和冲洗;(2)修补治疗,骨髓刺激疗法,如微骨折术;(3)修复治疗,包括骨软骨的移植和自体软骨细胞的移植。大的缺损的处理,一般使用同种异体骨软骨移植,或全关节成形术。然而软骨缺损治疗的未来,要靠软骨再生技术所提供的生物医学解决方法。[目的]探讨近年来软骨组织工程的进展,总结干细胞及其他方面进步和发展方向。[方法]检索关于干细胞构建软骨组织工程的文章,在标题和摘要中以"stem cell、tissue engineering、cartilage、bioreactor"为检索词进行检索。最终选择45篇文献进行综述。[结果与结论]实验室和临床研究都已经验证了软骨组织工程治疗大的缺损的方法。再生的软骨可以来自于软骨细胞,多能干细胞和间充质干细胞。支架材料的来源包括蛋白质,碳水化合物,合成材料,复合高分子材料等。软骨诱导生长因子的应用可以加强软骨的形成。生物反应器的发明,能加强体外组织工程软骨的营养运输,提供所需的机械刺激。多学科研究方法的运用,使得临床运用软骨再造技术有希望变为现实。     

膨体聚四氟乙烯（ePTFE）内支撑组织工程软骨的构建实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞和软骨细胞混合培养体外构建ePTFE软骨复合体的可能性。方法：实验组：分离、获取、扩增兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞,二者按7：3比例混和,接种到以膨体聚四氟乙烯（ePTFE）为内支撑外裹聚羟基乙酸（PGA）支架上,体外培养8周后,行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学和生物化学检测。对照组：利用实验组支架单纯接种骨髓间充质干细胞行体外培养。结果：实验组：体外培养8周后形成形态良好的软骨样组织复合体,组织学可见成熟软骨陷窝、异染基质、Ⅱ型胶原表达阳性。对照组：无软骨形成。结论：兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞混合培养,可以在体外构建出特定形状、结构组织学良好的ePTFE软骨复合体。     

Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

[目的]探讨Wnt3a基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。[方法]分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),携带Wnt3a及阴性对照基因(Mock)的慢病毒感染骨髓间充质干细胞,构建过表达Wnt3a骨髓间充质干细胞;采用甲苯胺蓝染色及QPCR观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响;使用MTT法观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。[结果]在0~72 h内,实验组MTT法检测吸光值明显大于对照组(P0.05);BMSCs体外成软骨诱导后,实验组细胞团明显小于对照组,且甲苯胺蓝染色较浅;实验组与对照组比较,成软骨指标Col2A1、Aggrecan和SOX9的m RNA表达降低(P0.05)。[结论]Wnt3a可促进骨髓间充质干细胞增殖,但抑制了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。     

间充质干细胞的研究进展及其在软骨组织工程中的应用

组织工程研究中,种子细胞、生长因子以及组织工程支架是三大要素.理想的种子细胞应具备:取材容易,对机体损伤小,体外培养时增殖力强、易稳定表达软骨细胞表型,植入体内后能耐受机体免疫,且无致瘤性等特点.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不仅具有以上优点,还具有自我复制、多向分化、抗炎作用和营养作用等特性.因此,MSCs是软骨组织工程中理想的种子细胞.研究MSCs在软骨组织工程中的应用有着重要的意义.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的研究体外三维培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化软骨细胞可行性。方法用密度梯度离心法分离纯化BMSCs,并传代扩增后,用离心三维培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养,以常规培养液培养的BMSCs作为阴性对照,于诱导培养第21天取出标本行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、s-100蛋白免疫组织化学检测。结果BMSCs经21d的离心三维诱导培养后,培养管出现软骨外观组织块,组织切片甲苯胺蓝染色呈明显异染,s-100蛋白免疫细胞化学检测阳性。对照组阴性。结论成人BMSCs在三维培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。     

Mechanical Stimulation by Ultrasound Enhances Chondrogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells in a Fibrin‐Hyaluronic Acid Hydrogel

Chondrogenic differentiation and cartilage tissue formation derived from stem cells are highly dependent on both biological and mechanical factors. This study investigated whether or not fibrin‐hyaluronic acid (HA) coupled with low‐intensity ultrasound (LIUS), a mechanical stimulation, produces an additive or synergistic effect on the chondrogenesis of rabbit mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow. For the purpose of comparison, rabbit MSCs were first cultured in fibrin‐HA or alginate hydrogels, and then subjected to chondrogenic differentiation in chondrogenic‐defined medium for 4 weeks in the presence of either transforming growth factor‐beta3 (TGF‐β3) (10 ng/mL) or LIUS treatment (1.0 MHz and 200 mW/cm²). The resulting samples were evaluated at 1 and 4 weeks by histological observation, chemical assays, and mechanical analysis. The fibrin‐HA hydrogel was found to be more efficient than alginate in promoting chondrogenesis of the MSCs by producing a larger amount of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and collagen, and engineered constructs made with the hydrogel demonstrated higher mechanical strength. At 4 weeks of tissue culture, the chondrogenesis of the MSCs in fibrin‐HA were shown to be further enhanced by treatment with LIUS, as observed by analyses for the amounts of GAGs and collagen, and mechanical strength testing. In contrast, TGF‐β3, a well‐known chondrogenic inducer, showed a marginal additive effect in the amount of collagen only. These results revealed that LIUS further enhanced chondrogenesis of the MSCs cultured in fibrin‐HA, in vitro, and suggested that the combination of fibrin‐HA and LIUS is a useful tool in constructing high‐quality cartilage tissues from MSCs.     

不同相对分子质量透明质酸对兔骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 观察不同相对分子质量透明质酸(HA)对兔骨髓来源间充质干细胞(MSCs)向软骨方向定向分化的影响.方法 取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同相对分子质量透明质酸做诱导剂,分为3个实验组,A组:相对低分子质量组(基础培养基+ HA 0.1 g/L,相对分子质量约1000×103),B组:相对中分子质量组(基础培养基+HA0.1 g/L,相对分子质量约1800×103),C组:相对高分子质量组(基础培养基+HA 0.1 g/L,相对分子质量约2000×103).同时设立阳性对照组[基础培养基+ 10 μg/L转化生长因子-β3( TGF-β3)]及空白对照组(基础培养基),观察细胞形态及增殖情况,分别于诱导后第7、14、21天行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测细胞Ⅱ型胶原表达.结果 经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态逐渐改变,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,诱导至21 d可见各实验组Ⅱ型胶原基因相对表达量分别为0.64±0.06、0.72±0.03、0.75±0.01,与阴性对照组(0.09±0.03)、阳性对照组(0.96±0.15)比较差异均有统计学意义,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似.结论 不同相对分子质量外源性HA诱导兔MSCs向软骨细胞分化的能力存在差异,相对高分子质量的HA的诱导能力较相对低分子质量HA的诱导能力强.证明透明质酸的相对分子质量与MSCs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱.     

纤维蛋白凝胶种植技术在组织工程软骨体外构建中的应用

目的探讨纤维蛋白凝胶种植技术应用于体外构建组织工程软骨,从而改善目前常规构建技术的缺陷。方法首先采用逆转录病毒pLEGFP-N1对人间充质干细胞进行荧光蛋白标记,然后分别应用纤维蛋白凝胶种植技术(A组)和沉淀种植技术(B组),体外构建细胞-材料复合体,通过倒置荧光显微镜和扫描电镜等观测种子细胞在支架材料内的分布与数量。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记间充质干细胞,并应用于工程化组织体外构建的示踪;A组细胞在材料内分布更均匀、数量更多,构建第2天细胞数量为(3·53±0·18)×106/个复合体,而B组细胞为(0·88±0·13)×106/个复合体,两组数据差异非常显著(P<0·01)。结论纤维蛋白凝胶种植技术简单易行,可以改善种子细胞在软骨支架材料内的分布,并提高细胞密度,为体外高效构建组织工程软骨创造了条件。     

Comparison of Multipotent Differentiation Potentials of Murine Primary Bone Marrow Stromal Cells and Mesenchymal Stem Cell Line C3H10T1/2

Murine C3H10T1/2 cells have many features of mesenchymal stem cells (MSCs). Whether or not the multipotent differentiation capability of C3H10T1/2 cells is comparable to that of primary bone marrow–derived MSCs (BM-MSCs) was investigated in this study. For in vitro osteogenic differentiation, both BM-MSCs and C3H10T1/2 cells differentiated to osteoblastic cell lineage and showed positive staining for alkaline phosphatase (ALP) and increased mRNA expression of Runx2, Col1αI, and osteocalcin. C3H10T1/2 cells and BM-MSCs induced similar amounts of bone formation in the biomaterials. Under chondrogenic induction in the presence of TGF-β1, cell pellets of both BM-MSCs and C3H10T1/2 cells formed cartilage-like tissues with cartilage matrix components including proteoglycan, type II collagen, and aggrecan. However, C3H10T1/2 cells presented lower adipogenic differentiation potential, with only about 10% C3H10T1/2 cells (but about 70% of BM-MSCs) being committed to adipogenesis. In this study we confirmed that C3H10T1/2 cells coimplanted with osteoconductive scaffolds can form bone spontaneously in vivo and that C3H10T1/2 cells have a basal level of osteocalcin expression, suggesting that they may be a good alternative source of primary BM-MSCs for investigating osteogenic and chondrogenic differentiation in bone or cartilage tissue engineering studies. Caution is needed when using C3H10T1/2 cells for adipogenic studies as they appear to have lower adipogenic potential than BM-MSCs.     

小口径组织工程血管体外构建的研究

目的 探讨间充质干细胞体外构建组织工程血管的可行性.方法 将体外培养扩增的犬骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,接种于ε-己内酯/L-丙交酯(PCLA)支架上,将其置于生物反应器内,在搏动性力学(100±20/55±20)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)刺激条件下培养.3 d后行血管组织学检测.结果 血管支架拉伸强度6.1 MPa;骨髓间充质干细胞成功定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞;血管腔内表面完全为细胞覆盖,表面的细胞沿液体流动的方向分布;种植的部分细胞已经渗透入血管壁内.结论 骨髓间充质干细胞可作为种子细胞,与PCLA支架在生物反应器内构建组织工程血管.     

骨形成蛋白7真核表达质粒的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建骨形成蛋白7(hBMP7)基因真核表达质粒,并使其在骨髓间充质干细胞中表达。方法 采用PCR技术扩增BMP7基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．1中,利用梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞(MSCs),然后用构建的BMP7表达质粒转染MSCs,使其得到表达。结果 经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7真核表达质粒pcDNA-BMP7,通过反转录PCR和免疫组化鉴定证明BMP7在转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论 BMP7真核表达质粒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达,为BMP7基因治疗的研究奠定了坚实的基础,同时也为组织工程成骨和成软骨的研究提供了改良的种子细胞。     

黏附因子N-cadherin在体外骨髓间质细胞诱导分化中的表达

目的：探讨黏附因子N-cadherin在骨髓间质细胞诱导分化中的表达及其转化机制。方法：体外分离，扩增Wistar大鼠骨髓间质细胞，按一定浓度种植于24孔板内，并加入TGF-B诱导剂，于不同时间点取材固定。用免疫组化方法动态观察N-cadherin在骨髓间质细胞诱导分化中表达时相。同时加入抗N-cadherin抗体干扰细胞聚集。结果：Ncadherin主要表达于加入诱导剂后24h，之后呈下调控趋势，并呈现时间依赖性。加入抗体后可明显干扰细胞聚集，当浓度为300ul孔时，未见细胞小结形成。结论：N-cadherin介导了细胞与细胞之间的相互作用，在体外间质细胞转化中发挥重要作用。     

体外诱导骨髓间质干细胞向软骨方向分化的研究

目的　探讨体外诱导骨髓间充质干细胞 (BMSCs)向软骨方向分化的条件和方法。方法　抽取兔股骨骨髓 ,用密度梯度离心和贴壁分离法分离BMSCs ,分别在高密度 (1× 10 6/ml)和低密度 (1× 10 4/ml)培养条件下用转化生长因子 β1(TGF β1)诱导BMSCs向软骨方向分化。倒置显微镜、透射及扫描电子显微镜观察细胞 ,用免疫组织化学、原位杂交、特殊染色方法检测Ⅱ型胶原及软骨基质成分的表达。结果　高密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阳性率为 89.2 %,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 82 .6%,黏多糖特殊染色阳性 ,低密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阴性 ,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 3 .8%,黏多糖特殊染色阴性。结论　TGF β1可以诱导BMSCs向软骨方向分化 ,细胞密度是BMSCs分化的重要影响因素。