缺氧对培养肝细胞极性的影响

目的观察缺氧对培养肝细胞极性的影响。方法利用三明治构型培养成鼠肝细胞,观察缺氧后肝细胞形态、特异性膜区域蛋白分布以及胞质钙离子的变化,以确定对细胞极性的影响。结果缺氧后,肝细胞变得扁平,分化良好的小管样结构消失;免疫组织化学证明肝细胞膜小管区域蛋白失去特异性分布;激光共聚焦显微镜显示肝细胞胞质钙离子荧光强度增强。结论缺氧可导致肝细胞极性丧失,从而造成肝细胞损伤,本研究可为在细胞水平研究肝脏缺血性再灌注损伤的发病机制提供一个体外模型。     

三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究

目的观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定。方法采用改良原位2步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测培养肝细胞的分泌及合成功能,并与单层胶原培养肝细胞比较。结果平均每个鼠肝可获取2×108~3×108个肝细胞,活率在(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,清蛋白分泌功能、尿素合成能力恢复到最佳状态。三明治构型培养的肝细胞清蛋白分泌功能、尿素合成能力在培养的14d内始终维持较高的水平,并形成肝索样结构,伴胆小管网络形成,肝细胞形态维持达28d以上。结论三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能,三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础。     

肝细胞生长因子及受体促进人大肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的:观察不同浓度肝细胞生长因子对体外培养的大肠癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:体外培养人大肠癌细胞,分别加入不同浓度的人重组肝细胞生长因子和或其受体抑制剂Herbimycin A(HA),用Western blot、RT-PCR、ELISA等方法检测肝细胞生长因子对其受体磷酸化表达及大肠癌细胞VEGF表达的影响.结果:肝细胞生长因子在10～100 ng/ml浓度范围内较对照组相比显著促进大肠癌细胞VEGF mRNA(增加了4～5倍)、蛋白质表达(增加了3～10倍);Western blot检测肝细胞生长因子引起其受体磷酸化,并与其诱导的VEGF表达相关.结论:体外培养条件下,肝细胞生长因子呈剂量依赖性促进大肠癌细胞VEGF表达,其表达与其受体磷酸化水平相关;其受体磷酸化抑制剂可以抑制大肠癌细胞VEGF表达.     

三明治培养新生实验小型猪肝细胞的功能与形态

目的 探索双层胶原夹心猪肝细胞的方法，观察培养猪肝细胞的功能与形态特征。方法 将两步法分离的新生中国实验小型猪肝细胞接种于胶原被覆的培养板常规培养，24h后，肝细胞上再加一层胶原形成双层胶原夹心（三明治）培养，观察培养猪肝细胞的白蛋白分泌、形态学特征和乳酸脱氢酶（LDH）漏出量。结果 成功将新生实验小型猪肝细胞固定于双层胶原中，形成三明治状。培养1周内，用SDS／PAGE可检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，倒置相差显微镜下观察到典型的形态特征，培养期内LDH漏出量较少。结论 可用双层胶原对新生乳猪肝细胞进行三明治样培养，为肝细胞提供更接近体内的培养环境，有助于维持特殊的肝功能和形态学特征。     

肝细胞内Ca2+振荡对磷酸化-去磷酸化循环过程的动力学研究

目的:从理论上阐述了Ca^2 振荡对肝细胞中糖原降解的磷酸化-去磷酸化循环过程的调控效应。方法:应用Ca^2 振荡模型观察Ca^2 振荡对肝细胞中糖原降解的磷酸化循环过程的调控。结果:Ca^2 振荡可以增强细胞对激素反应的潜力。肝细胞中的磷酸化-去磷酸化动力学过程，在Ca^2 振荡的调控下，其糖原磷酸化酶的浓度呈现同频、同步振荡。结论:Ca^2 振荡将会提高细胞中信息的传递效率和特异性。     

乳兔和成年兔肝细胞体外分离及培养的比较研究

目的 研究比较体外分离培养乳兔和成年兔肝细胞增殖活性及功能。方法 采用非灌注胶原酶消化法分离乳兔和成年兔肝细胞,比较细胞产率和细胞活率,均采用DMEM培养液（含10%胎牛血清）培养,计数法观察原代细胞增殖变化,MTT法观察传代细胞增殖情况,检测培养液中白蛋白含量变化。培养过程采用相差显微镜进行形态学观察,培养细胞采用PAS染色法鉴定。结果 分离收获乳兔肝细胞较成年兔肝细胞数目多,活率高。培养过程中,乳兔肝细胞较成年兔肝细胞折光性好,生长快,增殖能力强,培养液上清蛋白含量高并且增长速度较快,具有统计学意义。PAS染色观察,乳兔和成年兔肝细胞胞质中充满大量糖原颗粒,两者差异无显著性。结论 乳兔肝细胞比成年兔肝细胞,更加适合体外培养研究。     

猪肝细胞的分离与原代培养

目的：建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果：平均每只猪可获得2×10¹⁰个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论：原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏（HBLSS）应用中细胞来源问题的主要途径。     

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

目的研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时肝实质细胞生长、形态及功能状况.方法原位二步IV型胶原灌注法联合Percoll液密度梯度离心法分离肝实质细胞与Kupffer细胞;体外进行两种细胞单独培养、肝细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养,观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,检测培养上清中白蛋白和糖的水平.结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至21 d;共同培养组肝细胞于48 h即开始出现少量的死亡细胞,细胞生长增值缓慢,细胞可培养存活至10 d.单独培养组上清白蛋白水平在48、96、120、144、168 h比混合培养组高(P<0.05);单独培养组上清糖水平在96、144、168 h高于混合培养组(P<0.05).结论肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;但共培养时肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,肝细胞存活时间缩短,提示在共培养体系要实现肝实质细胞和Kupffer细胞两者良好生长和功能的协调,体外共培养条件需进一步优化.     

金黄地鼠原代肝细胞的分离纯化与培养

目的 建立一种简单、高效的金黄地鼠肝细胞分离、纯化及培养的方法.方法 实验采用两步胶原酶原位灌流法分离地鼠原代肝细胞,percoll离心法纯化细胞,台盼蓝染色检测成活率,对所分离培养的原代肝细胞进行形态学鉴定,Western Blot检测细胞功能.结果 经过分离纯化的金黄地鼠肝细胞,细胞成活率为（93.7％±2.1）％,细胞形态呈现不规则多边形,细胞多为双核和多核细胞.细胞在腺苷处理后,AMP激活的蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平明显升高.结论 成功建立了金黄地鼠肝细胞分离纯化及培养的方法.     

人胰岛素样生长因子-1的体外抗肝纤维化活性

探讨人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的体外抗肝纤维化作用。检测IGF-1对人正常肝细胞L-02增殖及生长周期的影响;建立CCl₄诱导的肝细胞损伤模型,探究IGF-1抗肝细胞损伤活性;以TGF-β1诱导的肝星状细胞HSC-T6为体外肝纤维化研究模型,检测IGF-1对HSC-T6细胞中纤维化相关蛋白表达水平及对胞内TGF-β1/Smad信号通路的影响。结果显示,IGF-1可解除TGF-β1对L-02生长的抑制作用,提高CCl₄损伤L-02的细胞存活率,降低HSC-T6细胞纤维化相关蛋白表达水平,抑制TGF-β1/Smad信号通路中Smad3的磷酸化。结果表明,IGF-1能够促进肝细胞增殖,保护肝细胞免受损伤,干预TGF-β1/Smad信号通路,抑制胞外基质ECM合成,从而发挥抗肝纤维化效果。     

Restoration of cell polarity and bile excretion function of hepatocytes in sandwich-culture

Objective： To investigate the nature of the restoration of cell polarity and bile excretion function in Sandwich-cultured hepatocytes. Methods ： Freshly isolated hepatocytes from male Sprague-Dawley rats were cultured in a double layer collagen gel Sandwich configuration. Morphological changes were observed under a inverted microscope. The domain specific membrane associated protein DPP IV was tested by immunofluorescence, and the bile excretion function was determined by using fluorescein diacetate. Hepatocytes cultured on a single layer of collagen gel were taken as control. Results.. Adult rat hepatocytes cultured in a double layer collagen gel sandwich configuration regained its morphological and functional polarity and maintained polygonal morphology for at least 4 weeks. Immunofluorescence studies using antibodies against DPP IV showed polarity restoration as early as 48 h. After cultured in the double layer collagen gel Sandwich configuration for 96 h the hepatocytes began to excrete bile; while hepatocytes cultured on a single layer collagen gel had no bile excretion. Conclusion.. Hepatocytes cultured in a double layer collagen gel Sandwich configuration are able to regain their morphological and functional polarity given certain conditions. Hepaotcyte culture is a useful tool for the study of polarity restoration.     

肝细胞系Chang liver细胞移植对改善急性肝衰竭存活率的作用的研究

目的 通过体外实验及体内急性肝衰竭模型验证其肝细胞功能,为生物人工肝支持系统寻找一种可用的细胞源。方法 通过Western-Blotting和激光共聚焦检测Chang Liver细胞的肝细胞特异性蛋白表达,在体外评估其肝细胞功能。采用RT-PCR从基因水平检测肝细胞功能相关基因的表达情况。采用大鼠90%肝切除术诱导急性肝衰竭模型(ALF)。取生长良好的Chang Liver细胞移植入脾脏内,并于移植后24 h行90%肝切除术诱导急性肝衰竭,每隔24 h采血1次,测定肝功能指标变化情况。结果 在体外,Chang Liver细胞表达肝细胞特异性标志蛋白,如白蛋白(ALB)、葡糖醛酸基转移酶(UGT)及细胞色素酶P450(CYP3A4)。RT-PCR 同样可检测到相关基因在mRNA水平的表达。在体内,实验组接受Chang Liver细胞移植,其长期生存率达到40%,而对照组的生存率为0。移植Chang Liver细胞的大鼠的肝功能在急性肝衰竭后24 h较对照组获得明显的改善,表现为血样标本中谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),胆红素和碱性磷酸酶(ALP)等肝功能指标的下降。结论 Chang Liver细胞可像正常肝细胞一样表达功能蛋白,明显改善急性肝衰竭大鼠的肝功能,改善存活率,可以作为生物人工肝支持系统较好的细胞源。     

长期酒精暴露和戒断后大鼠不同脑区肌动蛋白结合蛋白、细胞周期素依赖性蛋白激酶5的表达

目的 探讨长期酒精暴露和戒断对大鼠不同脑区肌动蛋白结合蛋白（cofilin）、磷酸化cofilin （P-cofilin）以及细胞周期素依赖性蛋白激酶5（cdk5）表达的影响.方法 雄性SD大鼠24只,随机等分为1个对照组和3个实验组.实验组大鼠自由饮含低浓度乙醇（体积分数为6％）的水溶液2月,对照组大鼠正常饮自来水.2月后撤除酒精进行戒断症状评分,并分别在戒断0h、戒断6h、戒断2d处死大鼠取脑组织.采用免疫组织化学方法检测各组大鼠伏隔核和纹状体区cofilin、p-cofilin （ser3）以及cdk5的表达水平.结果 实验组大鼠撤除酒精后出现明显的戒断症状,在戒断6h达到高峰.在大鼠伏隔核区,戒断0h组cofilin表达水平较对照组显著降低[（0.31±0.05）,（0.39±0.05）,P＜0.05],戒断0h、戒断6h组cdk5表达水平较对照组显著升高[（0.36±0.07）、（0.34±0.07）,（0.25±0.05）,P＜0.05].在大鼠纹状体,戒断0h组cofilin表达水平较对照组显著降低[（0.26±0.04）,（0.34±0.05）,P＜0.05],戒断6h组p-cofilin表达水平较对照组显著升高[（0.43±0.06）,（0.30±0.06）,P＜0.01],戒断0h组cdk5表达水平较对照组显著升高[（0.35±0.06）,（0.26±0.05）,P＜0.05],戒断6h组cdk5表达水平与对照组相比显著升高[（0.37±0.06）,（0.26±0.05）,P＜0.01].结论 长期酒精暴露诱导大鼠形成酒精依赖,并导致相关脑区肌动蛋白结合蛋白以及cdk5的表达变化.     

cofilin在子宫内膜异位症患者在位内膜及异位病灶中的表达及意义

目的检测在位内膜中子宫内膜异位症的候选基因及功能,通过对在位子宫内膜中肌动蛋白结合因子(cofilin)表达的检测,明确其在子宫内膜异位症发生和发展中的作用。方法选取23例经病理证实为子宫内膜异位症的在位内膜及异位内膜标本(增殖期11例,分泌期12例)为实验组,以9例非子宫内膜异位症患者的子宫内膜标本为对照组。采用RT-PCR方法检测cofilin mRNA的相对表达。并对子宫内膜异位症患者在位内膜中cofilin表达水平与内异症严重程度及月经周期进行相关性分析。结果实验组在位内膜中cofilin表达水平明显高于对照组在位内膜(P<0.01);实验组异位内膜cofilin表达水平高于同组在位内膜(P<0.05);实验组在位内膜及异位内膜相比较,中、重度组与轻度组的差别有显著性(P<0.05)。实验组在位内膜及异位内膜和对照组在位内膜的增殖期和分泌期比较,cofilin表达水平均无显著性差异(P>0.05);分别比较实验组与对照组增殖期及分泌期在位内膜差异具有统计学意义(P<0.05);实验组中,分别比较增殖期与分泌期在位内膜与异位内膜,cofilin表达水平也具有统计学差异(P<0.05)。结论子宫内膜异位症患者在位内膜中cofilin表达水平的异常升高在该病的发生发展中起重要作用。     

蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导大鼠脂肪性肝纤维化肝细胞再生障碍的机制

目的 获取通过改变饮食习惯可逆转脂肪性肝纤维化的证据;明确非酒精性脂肪性肝纤维化肝细胞增殖障碍的发生机制.方法 (1)蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCDD)喂养10周诱导非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠模型,恢复组于第9周开始将MCDD转变为蛋氨酸-胆碱对照饮食(MCCD)喂养2周.(2)纤维化和炎症程度采用肝组织病理染色方法评价,肝星状细胞、Kupffer细胞活化采用免疫组化、蛋白质印迹或实时PCR方法评价.(3)肝细胞凋亡和增殖分别采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色法和BrdU染色法评价,肝细胞再生相关细胞因子白细胞介素(IL)-6、抗信号转导与转录激活因子3(STAT3)、多克隆抗体抗c-Jun N端激酶1(JNK-1)、c-Jun、多克隆抗体抗CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、p21、多克隆抗体抗肝细胞核因子6(HNF6)、肝细胞生长因子(HGF)-α表达分别采用实时PCR及蛋白质印迹方法评价.结果 (1)MCDD转变为MCCD后组织病理学显示肝细胞脂肪沉积及炎症反应明显减轻.(2)伴随着活化的肝星状细胞和Kupffer细胞减少,肝纤维化程度明显减轻.(3)模型组肝细胞凋亡数量显著高于正常组和恢复组(68±16比40±8、48±6,均P<0.05);肝细胞增殖/凋亡比值显著低于正常组和恢复组(0.10±0.03比0.19±0.03、0.41±0.09,均P<0.01);恢复组增殖数量显著高于模型组(17.2±4.4比7.5±3.0,P<0.01).(4)模型组IL-6、JNK-1、c-Jun、C/EBPα、p21、HNF6 mRNA表达均显著低于正常组(0.34±0.18、0.41±0.11、0.19±0.03、1.94±0.64、0.34±0.20、0.47±0.21比1.33±0.44、0.83±0.26、1.53±1.20、4.51±1.15、1.30±0.75、0.92±0.16,P<0.05或P<0.01);且模型组上述指标及STAT3蛋白表达亦明显低于正常组(P<0.05或P<0.01);恢复组仅IL-6、JNK-1和p21 mRNA和蛋白表达显著高于模型组(P<0.05或P<0.01).结论 饮食结构调整对于脂肪性肝纤维化的组织学改善具有重要的治疗意义;MCDD脂肪性肝纤维化肝细胞再生抑制与G_0至S期进入障碍有关,促进IL-6、JNK-1和p21的表达可能对于脂肪性肝纤维化恢复具有重要的治疗意义.     

肺癌患者血浆cofilin蛋白含量的变化及其临床意义

目的探讨非小细胞肺癌患者血浆切丝蛋白（cofilin）含量的变化及其临床意义。方法原发性非小细胞肺癌患者50例,健康对照组50例,采用酶联免疫吸附法测定两组血浆cofilin含量,采用免疫组化SP法检测肺癌组织中的cofilin蛋白。结果肺癌组50例患者癌灶组织中cofilin蛋白阳性表达33例（66.00%）,大部分定位于细胞质内,可见到弥漫性分布的棕黄色颗粒;肺癌组患者血浆cofilin蛋白含量为（0.592±0.387）ng/ml,明显高于对照组的（0.210±0.096）ng/ml（P〈0.05）;肺癌组织中cofilin蛋白阳性表达率、血浆cofilin蛋白含量与患者性别、年龄、组织学分化程度均无关（P〉0.05）,与TNM分期、淋巴结转移状况有关（P〈0.05）;血浆cofilin蛋白含量越高则肺癌组织中cofilin蛋白阳性表达率越高（P〈0.05）。结论肺癌患者血浆cofilin蛋白含量明显升高,并与肺癌分期及淋巴结转移有关,检测血浆cofilin蛋白含量可用于肺癌术前诊断及临床分期、转移程度的评估。     

改构型酸性成纤维细胞生长因子对体外培养肝细胞增殖活性的影响

目的 探讨改构型酸性成纤维细胞生长因子(MaFGF)对体外培养大鼠肝细胞增殖的影响.方法 采用“0.25％胰酶+0.1％胶原酶”消化法分离培养大鼠肝细胞并传代纯化扩增,取第3代细胞鉴定后实验:①形态学法观察在不同浓度MaFGF组中细胞的形态变化;②将实验随机分为对照组和MaFGF组,MaFGF组加入一系列浓度的MaF-GF,MTT法测定不同浓度MaFGF组作用于肝细胞24、48、72h的促增殖活性;③MTT法筛选出最适的MaFGF浓度,用此浓度和不加生长因子2种方式培养细胞,并绘制细胞生长曲线.结果 ①MaFGF对体外培养的肝细胞有一定的促增殖作用,但是与浓度不成正比;且实验表明24 h的增殖率较其它时间点显著增高(P＜0.05);比较对照组和各组(4.68×10-3 ～7.80×10-3 mg/L MaFGF组)均差异有统计学意义(P＜0.05),但各组间对肝细胞的促增殖作用的差异无统计学意义;②最适浓度(6.24×10-3 mg/L) MaFGF的第4天细胞数量较对照组明显增加(P＜0.05);MaFGF组的第10天细胞数(12.4×104)是对照组(6×104)的2.1倍(P＜0.05).结论 在适宜浓度和时间内,MaFGF对肝细胞具有一定的促增殖作用且不具有浓度依赖性.     

山莨菪碱对内毒素狗全血乳酸、肝糖原含量的影响

在观察山莨菪碱(654-2)对内毒素狗血流动力学指标影响的同时,观察了654-2对其动脉全血乳酸、血浆葡萄糖及肝细胞糖原含量的影响。实验结果;实验组(内毒素加654-2)动物高乳酸血症下降速度较对照组(内毒素加生理盐水)显著增快;注内毒素后第6h,肝糖原含量较对照组显著增高,而两组动物血流动力学指标变化无明显差异。提示654-2有改善内毒素狗肝脏对乳酸的糖异生作用,而这一作用似与血流动力学指标的改善关系不大。654-2对肝细胞的保护作用可能是其作用环节之一。