经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞

目的:采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞(OECs),以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法.方法:成年雄性SD大鼠6只,采用经改良的方法剥取嗅黏膜,然后用改良差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs.倒置相差显微镜下观察细胞生长情况以及形态并照相,培养7 d、14 d细胞行NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定,并根据免疫细胞化学染色结果计算细胞纯度.结果:体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形.嗅黏膜OECs NGFRp75免疫细胞化学染色阳性.培养7 d嗅黏膜OECs纯度为90%,培养14 d嗅黏膜OECs纯度为85%.嗅黏膜OECs最长可以存活35 d.结论:经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs具有简单、高效的优点,培养的嗅黏膜OECs的纯度完全可以达到细胞移植的要求.     

NGF和GDNF对大鼠嗅鞘细胞体外增殖和分化的影响

本研究旨在比较神经生长因子(NGF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠嗅鞘细胞(OECs)体外增殖和分化的影响。在体外分离培养大鼠OECs的培养液中不加神经营养因子(对照组)或加入不同的神经营养因子(NGF组和GDNF组),倒置显微镜下进行观察,并通过S-100免疫荧光组织化学染色检测各组大鼠OECs体外增殖和分化情况。结果显示:NGF组和GDNF组OECs增殖和分化明显好于对照组(P<0.01),NGF组又明显好于GDNF组(P<0.01)。这些结果提示NGF能促进大鼠OECs体外增殖和分化。     

成年大鼠嗅神经鞘细胞纯化培养的研究

嗅神经鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs)是目前用于神经再生研究较为理想的移植细胞,为了建立一种可以有效获得高纯度、高均一性的OECs培养方法,本实验采用2. 5月的大鼠嗅球为实验材料进行OECs培养,同时结合OECs的生物学特点在培养8d后,通过用硝酸纤维素膜吸附p75抗体,再对培养的OECs进行免疫亲和吸附和对成纤维细胞进行补体杀伤来纯化OECs, 在纯化后分别对培养2、4、6、8d的OECs进行p75免疫组化染色和纯度鉴定。实验结果发现,本研究采用的OECs纯化培养方法所获得OECs纯度在4个不同培养时间点都达到98%以上,说明此方法是一种高效率的纯化培养OECs的方法。     

一种新颖的神经胶质细胞-嗅鞘细胞

嗅鞘细胞(OECs)移植治疗脊髓损伤(SC I)已显示出良好的应用前景,不同来源的OECs体外培养时,在不同发育阶段和不同生长环境中具有不同的生物学特性。OECs具有特异性的标志蛋白,如S-100、p75NTR、GFAP等。体外培养的OECs分泌NGF、BDNF、NT-3/4、GDNF等多种促进神经细胞生长、分化和神经纤维再生的神经营养因子。将OECs植入脊髓损伤部位,该细胞能分裂增殖,并可抑制胶质瘢痕的形成,拮抗Nogo等神经再生抑制性因子的活性,包绕再生轴突形成髓鞘。由于OECs具有上述独特的生物学功能,被认为是继神经干细胞和雪旺氏细胞之后可用于移植治疗脊髓损伤的一种新颖的神经胶质细胞。     

差速贴壁结合神经营养因子3体外纯化培养人胚嗅鞘细胞

目的:采用差速贴壁结合神经营养因子3的方法对人胚嗅球嗅鞘细胞进行原代纯化培养,探讨简单实用的嗅鞘细胞体外培养方法。方法:将差速贴壁后人胚嗅鞘细胞间隔48h用含100mL/L胎牛血清和含NT3的DF12培养液交替进行体外培养。观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和P75免疫细胞化学染色进行细胞及纯度鉴定。结果:体外培养的人胚嗅鞘细胞P75染色呈阳性反应,呈双极、三极细胞,细胞突起细长,并可形成细胞突起网络。在体外培养9d时可以获得95%的嗅鞘细胞,12d时为83%,且细胞状态良好。结论:差速贴壁法结合间断NT3应用是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。     

成人、成年狗鼻腔嗅黏膜成鞘细胞的纯化、培养与鉴定

目的研究成人和成年狗嗅黏膜成鞘细胞（OECs）的分离与培养的方法,为探索在人体和大型动物模型的自体嗅黏膜OECs移植修复脊髓损伤奠定基础。方法采用差速贴壁方法分别从成人和成年比格狗的嗅黏膜分离出OECs,分别培养25d,在第6d、10d和25d进行形态学观察,最后进行OECs特异标记物NGFRp75的免疫细胞化学染色,鉴定成鞘细胞。结果原代培养的成人和成年狗嗅黏膜OECs在培养10d后明显增多,25d的OECs成熟,具有很长的突起,其形态多为双极和三极,NGFRp75的免疫组织化学染色呈阳性。本实验条件下,狗嗅黏膜OECs的生长状态比成人的好。而未进行差速贴壁的培养细胞则几乎均呈成纤维样细胞。结论差速贴壁的方法可以分离出较为纯化的成人、成年狗鼻腔嗅黏膜OECs。     

新生大鼠嗅鞘细胞的改良培养方法研究

目的:探讨新生大鼠嗅鞘细胞的分离、培养和纯化方法。方法:取2 d内的新生大鼠嗅球组织,在解剖显微镜下分离取材,原代培养嗅鞘细胞,运用差速贴壁法和差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法两种方法进行纯化,在倒置显微镜下观察不同培养时间嗅鞘细胞的形态、数量和NGFRp75抗体免疫荧光结果,统计嗅鞘细胞的纯度。结果:嗅鞘细胞的纯度分别是差速贴壁组平均为60.41%±4.32%,差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法组平均为84.98%±4.03%。两组数据用t检验进行统计学分析,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:取材于新生大鼠;显微镜下分离脑膜;差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法纯化,都是良好的嗅鞘细胞培养方法。     

Nurr-1对小胶质细胞微环境的影响

目的:探讨Nurr-1基因对小胶质细胞活化状态及其微环境的影响。方法:分离培养新生SD大鼠小胶质细胞,纯化、鉴定并分别用脂多糖(LPS)刺激活化和过表达Nurr1基因。实验随机分为小胶质细胞组、Nurr1过表达组、LPS处理组、Nurr1过表达+LPS处理组。ELISA分析过表达Nurr1基因对不同状态小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1等炎症相关因子和BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的影响。结果:(1)小胶质细胞混合培养、纯化、CD11b/c免疫细胞化学鉴定为阳性,纯度在95%;(2)Nurr1基因过表达小胶质细胞转染阳性率90%;(3)ELISA法检测结果显示:过表达Nurr1基因的小胶质细胞显著降低了TNF-α、IL-1的分泌,并促使了BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的分泌。结论:Nurr1基因可抑制小胶质细胞的活化和减少炎症相关因子的产生,同时可促进GDNF、BDNF、PDNF等与DA能神经元存活和成熟等相关的神经营养因子的分泌。     

新生鼠嗅鞘细胞培养的几种纯化方法的比较

目的对文献报道的嗅鞘细胞（OEC）纯化方法进行比较,寻找一种较优化的纯化方法,为细胞移植修复脊髓损伤实验研究提供高纯度的种子细胞。方法实验分别比较了3种纯化方法：差速贴壁法、差速贴壁法联合阿糖胞苷化学纯化法、差速贴壁法联合NGFRp75抗体纯化法纯化原代培养的新生SD大鼠的OEC,并对纯化的OEC的形态学和免疫学特性等进行观察。结果与另两种纯化方法相比,差速贴壁法联合NGFRp75抗体纯化法得到的OEC不仅纯度高而且细胞活性好。结论该实验找到了一种纯化OEC的较优化方法——差速贴壁法联合NGFRp75抗体纯化法,此法得到的细胞较符合细胞移植的要求,为下一步细胞移植修复脊髓损伤实验研究打下了细胞学基础。     

富血小板凝胶上清对施万细胞活性的影响

目的:观察富血小板凝胶上清(PRP-r)对大鼠施万细胞(SCs)增殖和分泌神经再生相关活性物质的影响。方法:实验分为PRP-r组和control组。利用大鼠腹主动脉血制备富血小板血浆(PRP),用CaCl₂激活PRP得到PRP-r。CCK-8检测RSC96的增殖能力,ELISA检测RSC96培养上清中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)水平,Western Blot检测RSC96细胞中神经细胞黏附分子(NCAM)、p75神经营养因子受体(p75NTR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100钙结合蛋白B(S100B)的表达。结果:RSC96的增殖能力在PRP-r作用下显著提高,与对照组相比,培养上清中NGF、BDNF、GDNF水平增加,细胞中NCAM、p75NTR、GFAP、S100B蛋白表达上调。结论:PRP-r可以促进RSC96细胞增殖,促进神经营养因子分泌及相关蛋白的表达。     

大鼠嗅鞘细胞体外培养及免疫组化研究

目的：建立体外纯化培养嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的稳定方法并观察培养嗅鞘细胞（OECs）形态学特征。方法：原代培养成年雄性SD大鼠嗅球的嗅神经层和颗粒层中提取的OECs，利用差速贴壁和阿糖胞苷（Ara-c）抑制法除去混杂的成纤维细胞和星形胶质细胞以获得纯化的OECs。用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs，计算纯化度。结果：此方法获得的OECs纯度可达93％以上。OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主，或无突起呈“煎蛋样”，随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性。结论：此方法稳定易复制，可获得高纯度的OECs。     

Culture and purification of human fetal olfactory ensheathing cells using different attachment rates combined with intermittent NT3 nutrition

Objective:To explore a simple and pragmatic method to obtain sufficient olfactory ensheathing cells from human fetus by selective attachment of harvested cells combined with intermittent NT3 nutrition. Methods:DMEM/F12 culture solution including 10% fetal bovine serum or NT3 was used to culture olfactory ensheathing cells intermittently every 48 h. The cell state and growth rates of OECs were observed, and P75 staining was used to estimate the purity of the cells. Results:Human fetal OECs were positive with P75 immunocytochemical staining. OECs in dipolar or tripolar shape formed networks by their processes in vitro. The purity of OECs in "good state" was about 95% at 9 d and 83% on 12 d, respectively. Conclusion:The method of using different attachment rates combined with intermittent NT3 addition is a simple and effective way to culture and purify OECs.     

成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的　在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。　方法　根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。　结果　按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。　结论　差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 ,本实验为临床开展自体嗅粘膜OECs修复脊髓损伤的研究提供参考     

原代培养大鼠嗅球成鞘细胞Nogo(N-18)的共聚焦激光扫描显微镜观察

目的 观察原代培养的成年大鼠嗅球成鞘细胞(OECs)Nogo(N-18)蛋白的表达，探讨Nogo与成鞘细胞促进神经再生作用的关系。方法 原代培养嗅球OECs，采用免疫组织化学和双标免疫荧光细胞化学技术，结合激光共聚焦扫描显微镜观察。结果 原代培养的嗅球OECs的Nogo(N-18)免疫细胞化学反应呈阳性，Nogo(N-18)蛋白主要分布于胞浆，而在胞膜及突起分布较少。结论 嗅球(OECs)含有Nogo—A蛋白，提示Nogo-18蛋白在嗅神经系统可能没有决定抑制轴突再生的作用。     

嗅神经鞘细胞移植治疗中枢神经系统损伤的研究进展

中枢神经系统损伤后的治疗一直是神经科学研究中的一大难题。嗅神经鞘细胞是分布于嗅觉系统中嗅球和嗅上皮基底膜的一种特殊的胶质细胞。大量的研究表明 :嗅神经鞘细胞在中枢神经系统内能长距离的迁移 ,能促进轴突的再生和髓鞘的形成。不管是中枢性还是周围性的嗅神经鞘细胞均能促进损伤神经元的再生。鼻腔是嗅神经鞘细胞自体移植供体的来源。本文综述了近年来嗅神经鞘细胞移植治疗中枢神经系统损伤再生的研究现状和进展     

人胚嗅球嗅鞘细胞原代培养的实验研究

目的拟建立人胚胎嗅球嗅鞘细胞的培养方法并探讨这些细胞在活性、纯度方面是否具备临床应用水平。方法用含有促进细胞生长的谷氨酰胺、转铁蛋白、生物素、硒酸纳的无血清纯化液纯化嗅鞘细胞,胰蛋白酶消化收集细胞,制成单细胞悬液。采用台盼蓝染色法进行活性测定,P75NGFR和S-100双标免疫荧光染色鉴定,以Hoechst复染鉴定OECs的纯度。结果可见比较典型的嗅鞘细胞:双极或梭形、多突起形和扁圆形,主要以梭形和多突起形细胞为主。细胞活性大于95%,纯度大于90%。结论实验建立的人胚胎嗅球嗅鞘细胞原代培养的方法可行,细胞活性大于95%,纯度和均一性已达到临床应用水平。     

不同保存方式下嗅鞘细胞的活性

背景：获取和寻找适合的保存方式对嗅鞘细胞实验和临床应用有重要的意义。 目的：探索合适的嗅鞘细胞低温保存方式。 方法：取对数期生长的嗅鞘细胞,冻存1,3,6个月进行复苏。 结果与结论：MTT比色法及锥虫蓝染色显示5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉处理的细胞活性最高,其次是10%二甲基亚砜处理的细胞,5%二甲基亚砜的保护作用最差。冰箱降温或程控降温仪降温方式及不同的冻存时间对嗅鞘细胞活性影响不明显。因此,推荐用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉作为嗅鞘细胞冻存低温保护剂。